一種篩選κ阿片受體激動(dòng)劑的細(xì)胞模型及篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域，涉及用于篩選Κ阿片受體（Kopioid receptor，0PRK)激動(dòng)劑的細(xì)胞模型及篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藥物篩選模型是藥物研發(fā)必不可少的研究平臺(tái)。高內(nèi)涵分析或高內(nèi)涵篩選（High ContentScreening，HCS)是一種以細(xì)胞為檢測(cè)對(duì)象，依賴于高分辨率的細(xì)胞成像系統(tǒng)，充 分整合樣品制備技術(shù)、自動(dòng)化設(shè)備、數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)、檢測(cè)試劑和生物信息學(xué)等資源的優(yōu)勢(shì)， 在細(xì)胞或分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)候選藥物的多元化、快速化和規(guī)?；Y選。HCS技術(shù)可在保持細(xì) 胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，同時(shí)檢測(cè)候選藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、代 謝途徑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)各個(gè)環(huán)節(jié)的影響，在單一實(shí)驗(yàn)中獲取大量相關(guān)信息，以確定候選藥物的 生物活性和潛在毒性。
[0003]阿片受體（0PR)包括κ阿片受體（0PRK)、μ阿片受體（0PRM)、δ阿片受體（0PRD) 以及阿片受體樣受體（0RL1)，是目前強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥的最重要的一類靶標(biāo)，但其特點(diǎn)是鎮(zhèn)痛和 依賴并存，因此嚴(yán)重影響了臨床應(yīng)用。
[0004] 近30年來，阿片受體和阿片樣物質(zhì)的研究成為神經(jīng)藥理學(xué)、分子藥理學(xué)以及整個(gè) 神經(jīng)生物學(xué)研究中一個(gè)極為活躍的領(lǐng)域，人們希望找到鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)且依賴潛能小的新型強(qiáng) 效鎮(zhèn)痛藥。
[0005] 已有充分證據(jù)表明，0PRK激動(dòng)劑在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體中均有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，且自 身依賴潛能低，并能對(duì)抗μ阿片受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)的成癮性。因此引起了廣大藥學(xué)和藥理學(xué) 工作者的極大關(guān)注，認(rèn)為0PRK是一類非常具有研究和開發(fā)前景的鎮(zhèn)痛藥靶標(biāo)。
[0006] 0PRK屬G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)，與Gv。偶聯(lián)抑制腺苷酸環(huán)化酶（adenylcyclase, 縮寫為AC)活性，使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)cAMP的生成減少，從而抑制了神經(jīng)元活性。
[0007] 0PRK包括3個(gè)結(jié)合部位（也有文章報(bào)道為亞型），是指同一受體的不同位點(diǎn)，特定 激動(dòng)劑與其具有不同的結(jié)合能力，分別命名為^^、、和κ3。早在1982年Attali(Attali B, Guarderes C, Mazurquil H et al. Evidence for multiple "kappa"binding sites by use of opioid peptides in the guinea-pig lumbo-sacral spinal cord. Neuroptides.1982； 3:53~64)等人用3H-etorphine和非標(biāo)記的Dyn(l-27)，化合物DADLE與豚鼠脊髓κ受 體進(jìn)行競(jìng)爭性抑制和飽和性受體結(jié)合試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)κ受體有兩種不同特性的結(jié)合部位，即 DADLE敏感型和DADLE非敏感型。作者稱前者為h亞型，后者為亞型。隨后，Clark 等(Clark JA, Jin L, Price M et al. Kappa opiate receptor multiplicitu:evidence for two U50488-sencitiveκ^ubtypes and a novelκ3subtype. J Parmacol ExP Ther. 1989； 251:461~76)在小牛紋狀體的受體結(jié)合試驗(yàn)中又提出了κ3亞型。
[0008] 因此，由于Κρ1^和κ3亞型均屬同一受體上特定配基的不同位點(diǎn)，而本發(fā)明表 達(dá)的是κ阿片受體的全基因序列，各個(gè)亞型都能獲得相同或者類似的技術(shù)效果。
[0009]cAMP是細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的第二信使，cAMP依賴性蛋白激酶A(cAMP-dependent proteinkinase,PKA)是一種在真核細(xì)胞中普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在信息調(diào) 控及細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中占有十分重要的地位。PKA全酶是一個(gè)R2C2四聚體，包括一個(gè)調(diào)節(jié)（R) 二聚體和兩個(gè)相同的催化（C)亞基。四聚體中的催化亞基無催化活性，PKA活化后調(diào)節(jié)亞 基與催化亞基解離，游離的催化亞基可在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)自由移動(dòng)，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)成分進(jìn)行磷酸化。
[0010] 在本發(fā)明的細(xì)胞模型中，細(xì)胞表達(dá)人源PKA的催化亞基與EGFP的融合蛋白即 PKAcat-EGFP。PKA的活化主要受胞內(nèi)cAMP濃度的影響。未處理細(xì)胞中，cAMP濃度較低， PKAcat-EGFP在細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)高亮度熒光顆粒聚集體。而當(dāng)cAMP濃度升高時(shí)，PKAcat-EGFP 會(huì)從聚集體中釋放出來，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)熒光顆粒的減少。利用PKAcat-EGFP的這種重分布 現(xiàn)象即可檢測(cè)0PRK的激活程度。
[0011] 由于0PRK為Gv。偶聯(lián)受體，激活后抑制cAMP形成，導(dǎo)致PKAcat-EGFP在細(xì)胞質(zhì)內(nèi) 形成顆粒，與未處理細(xì)胞表現(xiàn)一致。因此需加入AC激動(dòng)劑（例如氟化鈉、forskolin等，優(yōu) 選forskolin)使細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)高濃度cAMP，使PKAcat-EGFP在細(xì)胞質(zhì)中呈彌散分布。
[0012]
[0013] 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前篩選0PRK激動(dòng)劑的方法多是以細(xì)胞膜受體的放射性配體受體 結(jié)合實(shí)驗(yàn)、cAMP檢測(cè)試劑盒、雙螢光素酶報(bào)告基因分析等，都存在以下一些缺點(diǎn)，包括需要 的細(xì)胞量大，過程繁瑣，實(shí)驗(yàn)周期長，有的還需要進(jìn)行放射性測(cè)定、使用昂貴的作用底物或 輔助因子，投入的資金與人力均較多。
[0014] 迄今尚未有基于高內(nèi)涵分析、高通量篩選0PRK激動(dòng)劑的細(xì)胞模型的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明人通過創(chuàng)造性的勞動(dòng)和大量的試驗(yàn)，建立了一種細(xì)胞模型，并且驚奇地發(fā) 現(xiàn)，通過對(duì)該細(xì)胞內(nèi)的PKA重分布以及核形態(tài)分析，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)0PRK激動(dòng)劑或AC抑制劑的 高效篩選。由此提供了下述發(fā)明：
[0016] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種細(xì)胞，其同時(shí)表達(dá)阿片受體和PKA。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其滿足如下的（1)一（5)中的任意一項(xiàng)或者多 項(xiàng)：
[0018] (1)所述阿片受體為K阿片受體、μ阿片受體、δ阿片受體或阿片受體樣受體； 具體地，所述κ阿片受體為Ki型、Κ2型或Κ3型Κ阿片受體；所述阿片受體為人源的； 具體地，所述阿片受體的氨基酸序列如SEQIDΝ0 :2所示；
[0019] (2)所述PKA是人源的；具體地，所述PKA為PKA催化亞基；具體地，所述PKA催化 亞基為單拷貝或多拷貝；具體地，所述PKA催化亞基的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；
[0020] (3)阿片受體和PKA為非融合表達(dá)；具體地，阿片受體和PKA蛋白構(gòu)建在不同的表 達(dá)載體上；
[0021] (4)所述PKA連接有可檢測(cè)的標(biāo)記；具體地，所述可檢測(cè)的標(biāo)記為報(bào)告基因蛋白； 更具體地，所述報(bào)告基因蛋白為EGFP蛋白；具體地，所述EGFP蛋白的序列如SEQIDN0 :3所 示；
[0022] (5)所述細(xì)胞為體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；優(yōu)選中國倉鼠卵巢細(xì)胞（例如中國倉 鼠卵巢細(xì)胞CH0-K1)。
[0023] 在本發(fā)明中，PKA和0PRK可以參考GenBank登錄號(hào)分別為NM002730和AF498922 的序列，其編碼的氣基酸序列分別如SEQIDN0 :1和SEQIDN0 :2所不。
[0024] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，PKA催化亞基的氨基酸序列如下（351aa):
[0026] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，0PRK的氨基酸序列如下（380aa):
[0028] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，EGFP的氨基酸序列如下（239aa):
[0030] 本發(fā)明的細(xì)胞可以用于篩選阿片受體激動(dòng)劑或者評(píng)價(jià)待測(cè)樣品例如化合物或組 合物對(duì)阿片受體的激動(dòng)活性，即作為篩選阿片受體激動(dòng)劑或者評(píng)價(jià)化合物或組合物對(duì)阿片 受體的激動(dòng)活性的細(xì)胞模型。其中，具體地，所述阿片受體為κ阿片受體（0PRK)。本發(fā)明 的實(shí)施例5中證明了該細(xì)胞模型的可靠性。
[0031] 在該細(xì)胞模型中，受體介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)下游蛋白分子的重分布程度可反映0PRK的 激活程度，對(duì)核形態(tài)分析可反映細(xì)胞毒性。將該模型用于阿片受體激動(dòng)劑的篩選，通過檢 測(cè)下游蛋白分子重分布的程度來評(píng)價(jià)化合物激動(dòng)0PRK的活性及對(duì)核形態(tài)分析檢測(cè)細(xì)胞毒 性。
[0032] 所述細(xì)胞可以通過如下步驟制備：
[0033] 1)構(gòu)建含有人κ阿片受體基因的真核表達(dá)載體；
[0034] 2)將載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)PKA蛋白（例如PKAcat-EGFP融合蛋白）的中國倉鼠卵巢 細(xì)胞；
[0035] 3)篩選穩(wěn)定表達(dá)人κ阿片受體和PKA蛋白（例如PKAcat-EGFP融合蛋白）的細(xì) 胞株。
[0036] 本發(fā)明的細(xì)胞也可以通過將含人κ阿片受體基因例如（0PRK基因）的載體與含 PKA基因（例如PKAcat-EGFP基因）的載體共轉(zhuǎn)染空的中國倉鼠卵巢細(xì)胞制得。
[0037]PKAcat表示PKA蛋白的催化亞基。
[0038] 本發(fā)明還涉及一種細(xì)胞/細(xì)胞株（中國倉鼠卵巢細(xì)胞株，CHO-PKAcat-EGFP/ 0PRK)，其保藏編號(hào)為CGMCCNo. 9002,保藏日期2014年3月26日，保藏單位是中國微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
[0039] 該細(xì)胞株為能夠穩(wěn)定表達(dá)0PRK和PKAcat-EGFP融合蛋白的中國倉鼠卵巢細(xì)胞 CH0-Kl〇
[0040] 本發(fā)明的另一方面涉及一種篩選阿片受體激動(dòng)劑或者腺苷酸環(huán)化酶抑制劑的方 法，或者一種評(píng)估/測(cè)定待測(cè)樣品對(duì)阿片受體的激動(dòng)活性或者對(duì)腺苷酸環(huán)化酶抑制活性或 者細(xì)胞毒性的方法，包括使用本發(fā)明任一項(xiàng)所述的細(xì)胞的步驟。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的方法，其包括下述步驟：
[0042] 在加入待測(cè)樣品之后或同時(shí)加入腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑，檢測(cè)PKA發(fā)生重分布的程 度；優(yōu)選地，以相同培養(yǎng)條件但是只加入腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑的細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞；具體 地，所述腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑為氟化鈉或forskolin。具體地，腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑例如 forskolin的終濃度為 1 - 100μmol/L、1 - 50μmol/L、1 - 20μmol/L、1 - 15μmol/L、 1 -ΙΟμ mol/L、或者 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或 15ymol/L〇
[0043] 根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的方法，其中：
[0044] 腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑在待測(cè)樣品加入之后再加入；具體地，腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑 在待測(cè)樣品加入之后間隔1 一 60分鐘、5 - 60分鐘、10 - 50分鐘、15 - 45分鐘、20 - 40 分鐘、20 - 35 分鐘（例如 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、或35分鐘）、 25 - 35分鐘或30分鐘加入；和/或
[0045] 在加入腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑之后的1 一 20分鐘、1 一 15分鐘、1 一 10分鐘、3 - 15分鐘、3 - 10分鐘或5分鐘后檢測(cè)PKA發(fā)生重分布的程度。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的方法，其包括下述步驟：
[0047] 1)將本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞接種并進(jìn)行培養(yǎng)；
[0048] 2)棄培養(yǎng)基，并用無血清的培養(yǎng)基進(jìn)行清洗細(xì)胞至少1次；
[0049] 3)加入待測(cè)樣品，在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
[0050] 4)加入forskolin，在無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；
[0051] 5)檢測(cè)PKA的重分布程度。
[0052] 根據(jù)