一種人自然殺傷細(xì)胞體外高效擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人自然殺傷細(xì)胞體外高效擴(kuò)增方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自19世紀(jì)80年代NK細(xì)胞的生物學(xué)活性被發(fā)現(xiàn)以來，有關(guān)NK細(xì)胞的研究及其應(yīng)用就不斷進(jìn)行。國(guó)內(nèi)外均已有臨床試驗(yàn)證明NK細(xì)胞治療血液系統(tǒng)腫瘤是有效地，有望成為徹底治愈血液系統(tǒng)腫瘤的途徑之一。但是NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用同時(shí)也受到其數(shù)量有限的限制，NK細(xì)胞在人的外周血淋巴細(xì)胞中只占了 5%-15%。故體內(nèi)及體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞是研究者們極其關(guān)注的問題及臨床廣泛應(yīng)用NK細(xì)胞的瓶頸問題之一。只有解決了 NK細(xì)胞數(shù)量的限制，才能使NK細(xì)胞應(yīng)用于臨床的實(shí)驗(yàn)廣泛開展，盡快找到NK細(xì)胞治療腫瘤的具有標(biāo)準(zhǔn)意義的有效途徑。國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者對(duì)NK擴(kuò)增方法技術(shù)進(jìn)行研究。
[0003]Carlens S等，應(yīng)用抗⑶3單抗和IL-2擴(kuò)增來源于健康血庫(kù)供者的NK細(xì)胞，經(jīng)21天培養(yǎng)后擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到193倍，NK(⑶3-⑶56+)細(xì)胞純度55%左右。Klingeman H_G等體外應(yīng)用IL-2及IL-15擴(kuò)增經(jīng)磁珠純化的NK細(xì)胞，經(jīng)14天培養(yǎng)后NK細(xì)胞擴(kuò)增了 5_20倍，與K562效靶比為10:1時(shí)殺傷能力可達(dá)75%，E:T為1:1時(shí)為45%。Evren Alici等應(yīng)用抗⑶3單抗和IL-2體外擴(kuò)增來源于MM患者的NK細(xì)胞，經(jīng)過20天培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增了 511倍，其中NK細(xì)胞比例由11%擴(kuò)增為65%，就NK細(xì)胞而言擴(kuò)增了 1624倍。NK細(xì)胞與K562效靶比為10:1時(shí)，其殺傷活性由初培養(yǎng)時(shí)的8%達(dá)到65%。Siegler U等首先磁珠純化NK細(xì)胞，再應(yīng)用IL-2，IL-15，抗⑶3單抗及自體照射過的飼養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增NK細(xì)胞，并且于GMP條件下培養(yǎng)，NK細(xì)胞19天后擴(kuò)增了 117倍。Hiroyuki Fujisaki等應(yīng)用IL-15及41BBL修飾了的K562 (k562-mbl5-41BBL)細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增NK細(xì)胞，照射后的K562-mbl5_41BBL與NK細(xì)胞共培養(yǎng)21天后，來源于外周血的⑶3-⑶56+NK細(xì)胞平均擴(kuò)增了 277倍，比例達(dá)到96.8%。與K562效靶比為4:1時(shí)，殺傷活性達(dá)到80%以上。Gong ff等通過基因修飾K562細(xì)胞使其共表達(dá)主要組織相容復(fù)合體I鏈相關(guān)蛋白A (MICA)，4-1BBL，IL-15，統(tǒng)稱為K562-MICA-41BBL-1L-15細(xì)胞，使其刺激NK細(xì)胞24天，NK細(xì)胞擴(kuò)增達(dá)到了 550倍，比例也有14.8%擴(kuò)增到了 86.7%，并且其殺傷活性也得到強(qiáng)化。后者雖然擴(kuò)增的NK純度高，但這種通過腫瘤細(xì)胞為滋養(yǎng)細(xì)胞的NK細(xì)胞擴(kuò)增體系，在應(yīng)用時(shí)存在培養(yǎng)體系中的腫瘤細(xì)胞有被輸入患者體內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)。
[0004]國(guó)內(nèi)其他應(yīng)用細(xì)胞因子及飼養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增NK細(xì)胞的報(bào)道，彭寶剛等采用PBMCs和附壁Wilms腫瘤細(xì)胞株HFWT細(xì)胞混合培養(yǎng)誘導(dǎo)擴(kuò)增NK細(xì)胞，健康人PBMCs在HFWT細(xì)胞中培養(yǎng)10?21天后，⑶56+⑶16+細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)50%以上。當(dāng)效靶比為2:1時(shí)，NK細(xì)胞殺傷80%的HFWT細(xì)胞。如2007年李曉紅等應(yīng)用IL_2，IL-12，IL-15擴(kuò)增磁珠純化的NK細(xì)胞，15天后擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到53倍。如2008年黃慶生等應(yīng)用基因工程構(gòu)建同時(shí)表達(dá)IL-15，IL-18及41BBL三種基因的K562細(xì)胞，來擴(kuò)增NK細(xì)胞，經(jīng)21天后，擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到520倍。
[0005]國(guó)內(nèi)外學(xué)者的以上方法有使NK細(xì)胞可大量擴(kuò)增者，但是使用磁珠分離，大大增加了研究成本，而借助K562，Wilms腫瘤細(xì)胞株HFWT細(xì)胞等進(jìn)行基因修飾的腫瘤細(xì)胞刺激NK擴(kuò)增，其安全性存在隱患。另外一些學(xué)者的研究方法雖然操作簡(jiǎn)便，但是擴(kuò)增效率較低。目前已有分離純度可達(dá)95%以上的商品化NK細(xì)胞分離試劑盒，但其價(jià)格昂貴，難以滿足大規(guī)模實(shí)驗(yàn)以及臨床腫瘤免疫治療的要求，所以研究操作簡(jiǎn)單而擴(kuò)增效率高的NK細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)十分必要。本發(fā)明旨在尋求相對(duì)簡(jiǎn)單但可以大劑量擴(kuò)增NK細(xì)胞的安全有效的方法；降低技術(shù)成本，減輕病患者負(fù)擔(dān)，使NK產(chǎn)品可以廣泛應(yīng)用于臨床研究及臨床治療腫瘤患者尤其是血液腫瘤患者的需求。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了實(shí)現(xiàn)體外高效無菌擴(kuò)增NK細(xì)胞，突破因外周血NK細(xì)胞數(shù)量有限而不能大量用于臨床以治療腫瘤等的瓶頸；降低技術(shù)成本，減輕病患者負(fù)擔(dān)，使NK產(chǎn)品可以廣泛應(yīng)用于臨床研究及臨床治療腫瘤患者尤其是血液腫瘤患者的需求，本發(fā)明提供了一種人自然殺傷細(xì)胞體外高效擴(kuò)增方法。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種人自然殺傷細(xì)胞體外高效擴(kuò)增方法，包括以下步驟:
a、配制細(xì)胞完全培養(yǎng)液，備用；所述完全培養(yǎng)液含有2mMGluta_MAX和100 μ g/ml青鏈霉素，其余為 GMP CellGroR DC Serum-free Medium 與胎牛血清混合物或 GMP CellGroR DCSerum-free Medium與自體血清混合物；
b、取室溫淋巴細(xì)胞分離液，將備用的人外周血液倒入淋巴細(xì)胞分離液面上，第一次離心，形成細(xì)胞分層；
c、吸取所述步驟b所得所述細(xì)胞分層中的白膜層細(xì)胞于一新離心管中，用磷酸鹽緩沖液洗滌，第二次離心，得白膜層細(xì)胞團(tuán)；
d、將所述步驟c的白膜層細(xì)胞團(tuán)用磷酸鹽緩沖液洗滌，棄去上層清液，得到細(xì)胞；
e、將所述步驟d的所得的細(xì)胞用步驟a所配制的完全培養(yǎng)液重新懸浮，計(jì)數(shù)并調(diào)整活細(xì)胞濃度至 0.5X 106-2X 106 cells/ml ；
f、將e步驟所得細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，并于細(xì)胞培養(yǎng)板中加入⑶16單抗，ATG，IL-2記為第一天；將所述細(xì)胞培養(yǎng)板放入37°C培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間后，更換所述完全培養(yǎng)液，第二次添加新鮮IL-2 ;
g、之后定期更換所述細(xì)胞完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，得到人自然殺傷細(xì)胞。
[0009]所述步驟a中，所述GMP CellGroR DC Serum-free Medium和所述胎牛血清體積比為19:1?4:1 ;
所述自體血清占所述完全培養(yǎng)液的體積比為1_15%。
[0010]所述步驟f中，所述ATG濃度為50 ng/ml-1000ng/ml, 0)16單抗?jié)舛葹? μ g/ml-100 μ g/ml ;IL_2 濃度為 200 U/ml-1000U/ml;所述第二次添加新鮮 IL-2，使 IL-2 的濃度為 200 U/ml-1000U/mlo
[0011]所述步驟b中第一次離心條件為1200-2500rpm, 15_25mins。
[0012]所述步驟c中第二次離心條件為800-2000rpm, 5_15mins。
所述步驟g中2-3天更換所述細(xì)胞完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)20-25天，得到人自然殺傷細(xì)胞。
[0013]所述步驟f中孵育的時(shí)間為2-4天。
[0014]本發(fā)明還提供一種人自然殺傷細(xì)胞體外高效擴(kuò)增方法中的因子組合應(yīng)用，所述步驟f中，因子⑶16單抗，ATG和IL-2組合應(yīng)用。
[0015]所述ATG 的濃度為 50 ng/ml-1000ng/ml, 0)16 單抗的濃度為 2 μ g/ml-100 μ g/ml ；IL-2 的濃度為 200 U/ml-1000U/ml。
[0016]
本發(fā)明的技術(shù)方案帶來的有益效果是:
1、NK細(xì)胞在不進(jìn)行磁珠分離，腫瘤修飾細(xì)胞刺激的情況下，應(yīng)用ATG，⑶16單抗，IL-2短時(shí)間內(nèi)得以高效擴(kuò)增，極大程度上節(jié)約了生產(chǎn)成本且操作簡(jiǎn)便。
[0017]2、NK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)千倍以上，終比例達(dá)到80%以上；最高可以達(dá)到92-93%，生產(chǎn)效率高，完全可以應(yīng)用于大規(guī)模臨床研究等。
[0018]3、NK細(xì)胞的生長(zhǎng)過程均在GMP條件下完成，保證無菌操作，并且在生產(chǎn)最后階段進(jìn)行各種安全檢測(cè)，可應(yīng)用于臨床研究及治療。
[0019]
【附圖說明】
[0020]圖1為本實(shí)施例1的產(chǎn)品檢測(cè)圖。
[0021]
【具體實(shí)施方式】
[0022]針對(duì)現(xiàn)有的NK細(xì)胞培養(yǎng)方法因外周血NK細(xì)胞數(shù)量有限而不能大量用于臨床以治療腫瘤；成本高病患者難以負(fù)擔(dān)，使NK產(chǎn)品不能廣泛應(yīng)用于臨床研究及臨床治療腫瘤患者尤其是血液腫瘤患者的問題，本發(fā)明提供一種人自然殺傷細(xì)胞體外高效擴(kuò)增方法。
包括以下步驟:
a、配制細(xì)胞完全培養(yǎng)液，備用；完全培養(yǎng)液含有2mMGluta-MAX和100 μ g/ml青鏈霉素，其余為 GMP CellGroR DC Serum-free Medium 與胎牛血清混合物或 GMP CellGroR DCSerum-free Medium與自體血清混合物；
b、取室溫淋巴細(xì)胞分離液，將備用的人外周血液倒入淋巴細(xì)胞分離液面上，第一次離心，形成細(xì)胞分層；
c、吸取步驟b所得細(xì)胞分層中的白膜層細(xì)胞于一新離心管中，用磷酸鹽緩沖液洗滌，第二次離心，得白膜層細(xì)胞團(tuán)；
d、將所述步驟c的白膜層細(xì)胞團(tuán)用磷酸鹽緩沖液洗滌，棄去上層清液，得到細(xì)胞；
e、將所述步驟d所得的細(xì)胞用步驟a所配制的完全培養(yǎng)液重新懸浮，計(jì)數(shù)并調(diào)整活細(xì)胞濃度至 0.5X 106-2X 106 cells/ml ；
f、將e步驟所得細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，并于細(xì)胞培養(yǎng)板中加入⑶16單抗，ATG，IL-2記為第一天；將所述細(xì)胞培養(yǎng)板放入37°C培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間后，更換所述完全培養(yǎng)液，第二次添加新鮮IL-2 ;
g、之后定期更換所述細(xì)胞完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，得到人自然殺傷細(xì)胞。
[0023]其中，步驟a中，所述GMP CellGroR DC Serum-free Medium和所述胎牛血清體積比為19:1?4:1。
[0024]其中，自體血清占完全培養(yǎng)液的體積比為1_15%。
[0025]其中，步驟f中，ATG濃度為50 ng/ml -1000ng/ml, CD16單抗?jié)舛葹? μ g/ml-100 μ g/ml ;IL_2 濃度為 200U/ml-1000U/ml;第二次添加新鮮 IL-2，使 IL-2 的濃度為200 U/ml-1000U/mlo
[0026]其中，步驟b中第一次離心條件為1200-2500rpm, 15_25mins。
[0027]其中，步驟c中第二次離心條件為800-2000rpm, 5_15mins。
其中，步驟g中2-3天更換所述細(xì)胞完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)20-25天，得到人自然殺傷細(xì)胞。
[0028]其中，步驟f中孵育的時(shí)間為2-4天。
[0029]本發(fā)明還提供一種人自然殺傷細(xì)胞體外高效擴(kuò)增方法中的因子組合應(yīng)用，所述步驟f中，因子⑶16單抗，ATG和IL-2組合應(yīng)用。
[0030]所述ATG的濃度為 50 ng/ml -1000ng/ml, 0)16 單抗的濃度為 2 μ g/ml-100 μ g/ml ；IL-2 的濃度為 200U/ml-1000U/ml。
[0031]
實(shí)施例1:
一種人自然殺傷細(xì)胞體外高效擴(kuò)增方法，包括以下步驟:
a、配制細(xì)胞完全培養(yǎng)液，備用，為NK細(xì)胞提