Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞系及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物動(dòng)物細(xì)胞系，尤其是涉及一株Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞系及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)，胃癌的發(fā)病率居所有惡性腫瘤第四位，死亡率居第二位。在中國(guó)，胃癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤，占惡性腫瘤死亡率的第一位，全國(guó)平均年死亡率為16/10萬(wàn)人口，高發(fā)地達(dá)60/10萬(wàn)人口。雖然胃癌的診斷及治療已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但近10年來(lái)其5年生存率并沒(méi)有明顯的提高，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其死亡的重要原因，居高不下的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)使胃癌的研究與治療成為亟待解決的重大課題。目前的資料表明，胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段的發(fā)展過(guò)程，其惡變過(guò)程包括了細(xì)胞增生、DNA復(fù)制過(guò)度、細(xì)胞周期功能紊亂、細(xì)胞永生化、逃逸凋亡、血管新生(Ang1genesis)及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等一系列的過(guò)程，地域環(huán)境及生活飲食、幽門(mén)螺桿菌感染(Helicobacter pylori，HP)、癌前病變以及遺傳和基因等因素均與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。分子生物學(xué)的研究顯示，胃癌的癌變涉及癌基因、抑癌基因、凋亡相關(guān)基因與轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等的改變，而基因改變的形式也是多種多樣的，這些基因受一系列復(fù)雜機(jī)制調(diào)控，但是其確切的調(diào)控機(jī)制并不完全明了。
[0003]1977年美國(guó)學(xué)者閔錫鈞根據(jù)顯微鏡下胃癌生長(zhǎng)方式的不同將其分為膨脹型和浸潤(rùn)型兩型(Ming氏分型)，并且指出二者的生物學(xué)行為和臨床預(yù)后截然不同。該分類(lèi)方法很好地反映了胃癌的生物學(xué)行為，且與預(yù)后密切相關(guān)，受到國(guó)內(nèi)外臨床專(zhuān)家和學(xué)者們的公認(rèn)。膨脹型胃癌癌組織呈膨脹性生長(zhǎng)，集聚成團(tuán)塊狀，周?chē)w維結(jié)締組織增生(Desmoplasia)，邊界較為清楚。浸潤(rùn)型胃癌癌組織呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，分散成條索狀，不形成團(tuán)塊狀，與周?chē)M織無(wú)明顯的界限，多為低分化腺癌或印戒細(xì)胞癌。膨脹型術(shù)后5年存活率為27.4%，而浸潤(rùn)型僅為9,1%ο迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)于這方面的研究鮮有報(bào)道，兩型胃癌(Ming氏膨脹型和浸潤(rùn)型)的發(fā)病機(jī)制和形成的分子基礎(chǔ)更不清楚。
[0004]目前世界范圍內(nèi)報(bào)道的胃癌細(xì)胞系已經(jīng)不少:中國(guó)的BGC-823、SGC-7901、MGC-803;美國(guó)的AGS ；日本的MKN-1、MKN_28、MKN_45、MKN-74、NMGC_3、NMGC_4 ；韓國(guó)的SNU-1、SNU-
5、SNU-16等。其中大部分來(lái)源于轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)、腹水或晚期、低分化的腫瘤組織，用這些細(xì)胞系做胃癌研究缺乏很好的代表性和科學(xué)性;另一方面很多細(xì)胞系應(yīng)用至今已經(jīng)有幾十年的時(shí)間，在長(zhǎng)期、反復(fù)的傳代培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞特性會(huì)發(fā)生很大變化，不同實(shí)驗(yàn)室在用同種細(xì)胞的不同代次得到的數(shù)據(jù)相差會(huì)很大，結(jié)果缺乏可比性和重復(fù)性?；谝陨显颍赴┰?xì)胞培養(yǎng)并建立細(xì)胞系在現(xiàn)階段仍有很大的價(jià)值。
[0005]另有研究發(fā)現(xiàn)，雖然各個(gè)細(xì)胞系在體外保持了許多起源細(xì)胞的形態(tài)與功能特征，但是由于周?chē)h(huán)境的變化，這些細(xì)胞系與供體的起源細(xì)胞會(huì)存在程度不一的差異，這種差異在培養(yǎng)開(kāi)始就存在，只是程度相對(duì)較小，以后隨著不斷的傳代培養(yǎng)及變異的發(fā)生，這種差異會(huì)越來(lái)越大，甚至?xí)a(chǎn)生起源細(xì)胞本不具備的特征。由于這些因素的存在，不同細(xì)胞系的建立工作更顯得意義重大。
[0006]迄今世界上關(guān)于胃癌的臨床和基礎(chǔ)研究已有很多的報(bào)道，但從Ming氏分型角度去研究胃癌發(fā)生機(jī)制的報(bào)道卻不多，本株細(xì)胞系不但為以后從Ming氏分型角度深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)行為提供一個(gè)很好的模型，也為進(jìn)一步開(kāi)展胃癌分子生物學(xué)、免疫學(xué)及臨床綜合診治等研究提供有利條件。
[0007]中國(guó)專(zhuān)利CN101993854A公開(kāi)一種來(lái)源于肝轉(zhuǎn)移灶的大腸癌細(xì)胞系CJF及其構(gòu)建方法，所述細(xì)胞系由如下方法獲得:取大腸癌肝轉(zhuǎn)移灶的組織，用膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化成單細(xì)胞后，MACS分選出CD133+細(xì)胞接種于N0D/SCID鼠皮下，成瘤后取出腫瘤組織，經(jīng)體外培養(yǎng)獲得可穩(wěn)定傳代的富含大腸癌干細(xì)胞的大腸癌細(xì)胞系CJF。該發(fā)明CJF細(xì)胞是從結(jié)腸癌人肝轉(zhuǎn)移灶取材的，對(duì)大腸癌肝轉(zhuǎn)移的研究有其他大腸癌細(xì)胞系無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn);該發(fā)明CJF細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)CD133+的細(xì)胞亞群約為10%，這株細(xì)胞系在大腸癌肝轉(zhuǎn)移過(guò)程及腫瘤干細(xì)胞在轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用研究具有廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一株Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞系及其應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明所述Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞系為Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞株XGC-3，已于2015年06月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào):CGMCC N0.10886。
[0010]Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞株XGC-3可作為研究Ming氏膨脹型胃癌發(fā)生、發(fā)展或轉(zhuǎn)移的細(xì)胞模型。
[0011]Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞株XGC-3裸鼠接種后無(wú)成瘤特性，可與其他有成瘤特性的膨脹型細(xì)胞系對(duì)比研究胃癌轉(zhuǎn)移及發(fā)展機(jī)制。
[0012]本發(fā)明采用取自一老年男性胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)混合蛋白酶消化后作原代培養(yǎng)，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)建立了一個(gè)Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞系。
[0013]所述Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞株XGC-3具有以下生物學(xué)特性:
[0014]1、細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，無(wú)接觸抑制，可出現(xiàn)疊加生長(zhǎng)現(xiàn)象。
[0015]2、細(xì)胞倍增時(shí)間接近48h。
[0016]3、染色體分析提示:本株細(xì)胞為穩(wěn)定的亞三倍體細(xì)胞系，有較多的染色體缺失、異位及衍生現(xiàn)象。
[0017]4、裸鼠接種本細(xì)胞后不成瘤。
[0018]本發(fā)明所述Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞株XGC-3可以作為從Ming氏分型角度去研究胃癌的分化機(jī)制、細(xì)胞形態(tài)及功能異常、腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制及指導(dǎo)臨床綜合診治等的細(xì)胞模型。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為XGC-3細(xì)胞來(lái)源腫瘤組織的病理結(jié)果。
[0020]圖2為XGC-3細(xì)胞在顯微鏡下的形態(tài)學(xué)觀察圖。
[0021]圖3為XGC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
[0022]圖4為XGC-3細(xì)胞染色體分析結(jié)果。
[0023]圖5為XGC-3細(xì)胞免疫缺陷小鼠體內(nèi)成瘤性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0025]Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞株XGC-3的建立及鑒定。
[0026]—、Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞株XGC-3的建立
[0027]采集胃癌患者手術(shù)切除腫瘤組織，經(jīng)混合酶消化后作原代培養(yǎng)，進(jìn)而成功建立一株能夠連續(xù)傳代的胃癌細(xì)胞系，目前傳至51代，細(xì)胞性狀保持穩(wěn)定。該患者病理結(jié)果為胃體部中分化管狀腺癌(圖1)。
[0028]二、Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞株XGC-3的生物學(xué)特性檢測(cè)
[0029]1、細(xì)胞形態(tài)學(xué):細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定并傳化后，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞觀察。結(jié)果顯示:相差顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞呈上皮樣細(xì)胞排列，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，有重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象(圖2)。
[0030]2、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定:取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第20代細(xì)胞制成IX 105/ml的單細(xì)胞懸液，然后按照ΙΟΟμΙ/孔接種于96孔板，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。24h后開(kāi)始加藥測(cè)定490nm波長(zhǎng)時(shí)的0D值，每天換液，共測(cè)9天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后繪制生長(zhǎng)曲線，按公式Td = tXlg2/lg(Nl/N0)計(jì)算倍增時(shí)間。結(jié)果顯示:本株細(xì)胞貼壁后第1天生長(zhǎng)緩慢，第2天開(kāi)始呈指數(shù)生長(zhǎng)，在每天更換培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)充足的條件下細(xì)胞可出現(xiàn)疊加生長(zhǎng)，無(wú)接觸抑制現(xiàn)象;細(xì)胞倍增時(shí)間約48h(圖3)。
[0031]3、染色體分析:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第35代細(xì)胞作核型分析。細(xì)胞經(jīng)秋水仙素作用2h，經(jīng)0.075mol/L KC1低滲，甲醇一冰醋酸固定處理，冰濕片滴片，室溫老化后用胰酶處理，Giemsa染色顯帶分析。結(jié)果顯不:本細(xì)胞系為穩(wěn)定的亞二倍體細(xì)胞系。細(xì)胞染色體缺失、異位及衍生染色體等現(xiàn)象很常見(jiàn)，具有惡性腫瘤細(xì)胞的特征(圖4)。
[0032]4、免疫缺陷小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn):取4周齡BALB/C雌性小鼠3只，右前肢皮下分別注射2X107個(gè)/ΙΟΟμΙ細(xì)胞，連續(xù)觀察1月后頸椎脫白法處死裸鼠，未發(fā)現(xiàn)移植瘤生長(zhǎng)(圖5)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞株XGC-3，已于2015年06月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào):CGMCC N0.10886。2.如權(quán)利要求1所述Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞株XGC-3作為研究Ming氏膨脹型胃癌發(fā)生、發(fā)展或轉(zhuǎn)移的細(xì)胞模型。3.如權(quán)利要求1所述Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞株XGC-3作為從Ming氏分型角度研究胃癌的分化機(jī)制、細(xì)胞形態(tài)及功能異常、腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制及指導(dǎo)臨床綜合診治的細(xì)胞模型。
【專(zhuān)利摘要】Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞系及其應(yīng)用，涉及微生物動(dòng)物細(xì)胞系。所述Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞系為Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞株XGC-3，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：CGMCC？No.10886。Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞株XGC-3可作為研究Ming氏膨脹型胃癌發(fā)生、發(fā)展或轉(zhuǎn)移的細(xì)胞模型。Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞株XGC-3裸鼠接種后無(wú)成瘤特性，可與其他有成瘤特性的膨脹型細(xì)胞系對(duì)比研究胃癌轉(zhuǎn)移及發(fā)展機(jī)制。所述Ming氏人膨脹型胃癌細(xì)胞株XGC-3可以作為從Ming氏分型角度去研究胃癌的分化機(jī)制、細(xì)胞形態(tài)及功能異常、腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制及指導(dǎo)臨床綜合診治等的細(xì)胞模型。CGMCC No.1088620150616
【IPC分類(lèi)】C12R1/91, C12N5/09
【公開(kāi)號(hào)】CN105462927
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510989640
【發(fā)明人】蔡建春, 徐浩, 彭積貴, 駱啟聰, 黃衛(wèi)鋒, 莊伊凡, 陳嘉佳
【申請(qǐng)人】廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院
【公開(kāi)日】2016年4月6日
【申請(qǐng)日】2015年12月25日