）、Wang Resin (Merck公司制造）、及 HMPA-PEGA Resin(Merck公司制造）等。同時，在Amino-PEGA Resin與氨基酸之間可 以存在連接基團，該連接基團，可列舉如：4_羥基甲基苯氧基乙酸（HMPA)、4-(4_羥基甲 基-3-甲氧基苯氧基）_ 丁基乙酸（HMPB)等。亦可使用C末端的氨基酸預(yù)先與樹脂結(jié)合的 H-Cys-(Trt)-Trityl Nova PEG 樹脂（Merck 公司制造）等。
[0115] 對于樹脂與氨基氮受脂溶性保護基所保護的氨基酸的結(jié)合，可使用如含羥基的樹 脂或以氯官能化的樹脂，使氨基酸的羧基以酯鍵結(jié)合在樹脂。同時，亦可使用以氨基官能化 的樹脂，使氨基酸的羧基以酰胺鍵結(jié)合在樹脂。
[0116] 而且，2-氯三苯甲基氯樹脂是優(yōu)選的，因為在固相合成中肽鏈延伸時，其具有可防 止末端Cys消旋化的特點。
[0117] 糖鏈-多肽復(fù)合物的制誥方法-2 (A法）
[0118] 糖鏈-多肽復(fù)合物，可如以下概略所示，使用結(jié)合糖鏈的Asn經(jīng)由液相合成制造。
[0119] (1)先使氨基氮受脂溶性保護基保護的氨基酸的羧基，與氨基游離而羧基受保護 或酰胺化的氨基酸結(jié)合。
[0120] (2)之后再使所得反應(yīng)物的脂溶性保護基脫離而形成游離氨基。
[0121] (3)該游離氨基，再與氨基氮受脂溶性保護基所保護的任意氨基酸的羧基，在溶液 中進行酰胺化反應(yīng)。該情形時，N末端側(cè)氨基酸的氨基氮受脂溶性保護基所保護，C末端側(cè) 的羧基受保護或酰胺化，因此可防止氨基酸之間自縮合，游離氨基與羧基反應(yīng)而結(jié)合。
[0122] (4)之后再使上述脂溶性保護基脫離而形成游離氨基。
[0123] (5)重復(fù)上述（3)及（4)的步驟1次以上，即可使任意數(shù)目的任意氨基酸結(jié)合，而 獲得C末端的羧基受保護或酰胺化、N末端含游離氨基的肽。
[0124] (6)在上述（5)中所合成的肽的游離氨基將要受乙酰基保護時，優(yōu)選使用乙酸酐、 乙酸等進行乙?；?。
[0125] (7)最后，再以酸切斷側(cè)鏈的脂溶性保護基，即可得到具有期望的氨基酸序列的 肽。
[0126] 糖鏈-多肽復(fù)合物的制誥方法-3 (A法）
[0127] 糖鏈-多肽復(fù)合物，可如以下概略所示，以結(jié)合糖鏈的Asn經(jīng)由片段合成法制造。
[0128] (1)先以制造上述糖鏈-多肽復(fù)合物的方法（A法）的⑴至（6)，在樹脂上合成 氨基氮受乙?；蛑苄员Ｗo基保護的多肽或糖鏈-多肽復(fù)合物。
[0129] (2)之后再于側(cè)鏈保護基未經(jīng)脫保護的條件下，自樹脂切斷多肽或糖鏈-多肽復(fù) 合物，即可獲得C末端含游離羧基、N末端氨基氮受乙?；蛑苄员Ｗo基保護的多肽或糖 鏈-多肽復(fù)合物。
[0130] (3)所得的氨基氮受乙酰基或脂溶性保護基保護的多肽或糖鏈-多肽復(fù)合物，再 經(jīng)由固相合成法或液相合成法，與樹脂或多肽結(jié)合。
[0131] (4)之后再使上述脂溶性保護基脫離而形成游離氨基。
[0132] (5)重復(fù)上述（3)及（4)的步驟1次以上，即可使任意數(shù)目的任意氨基酸結(jié)合而得 到肽。
[0133] (6)最后，再以酸切斷樹脂，即可得到具有期望的氨基酸序列的肽。
[0134] 脂溶性保護基，可例舉如：9_芴基甲氧基羰基（Fmoc)、叔丁氧基羰基（Boc)、苯甲 基、烯丙基、烯丙氧基羰基、乙?；?，羧酸酯系或酰胺系的保護基等。在氨基酸上導(dǎo)入脂溶 性保護基時，例如在導(dǎo)入Fmoc基時，可加入9-芴基甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯與碳酸氫 鈉進行反應(yīng)而導(dǎo)入。該反應(yīng)可在〇至50°C、并優(yōu)選在室溫，進行反應(yīng)約1至5小時。
[0135] 受脂溶性保護基保護的氨基酸，亦可使用已商品化的商品。其例可列舉如： Fmoc_Ser-〇H、 Fmoc_Asn-〇H、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc_Leu-〇H、 Fmoc-Ile_0H、 Fmoc_Ala-〇H、 Fmoc_Tyr-〇H、Fmoc_Gly-〇H、Fmoc_Lys-〇H、Fmoc_Arg-〇H、Fmoc_His-〇H、Fmoc_Asp-〇H、 Fmoc_Glu-〇H、 Fmoc_Gln-〇H、 Fmoc_Thr-〇H、 Fmoc_Cys-〇H、 Fmoc_Met-〇H、 Fmoc-Phe-〇H、 Fmoc_Trp-〇H、Fmoc-Pro-OH0
[0136] 此外，受脂溶性保護基保護的、在側(cè)鏈導(dǎo)入保護基的氨基酸，可列舉如： Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Asn (Trt)-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、 Fmoc-Cys(StBu)-OH、 Fmoc-Cys(tBu)-OH、 Fmoc-Cys(Trt)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-His(Trt)-〇H、 Fmoc_Lys(Boc)-〇H、 Fmoc-Ser(tBu)-〇H、 Fmoc-Thr(tBu) -OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
[0137] 此外，想要在糖鏈-多肽結(jié)合物的氨基酸序列中，附加連接基團時，在固相合成的 過程中，通過替代上述受脂溶性保護基所保護的氨基酸，而使用受脂溶性保護基保護的連 接基團，即可于優(yōu)選的位置，嵌入連接基團。
[0138] 在使用2-氯三苯甲基氯樹脂的情形時，可使用：二異丙基乙胺（DIPEA)、三乙胺、 吡啶、2, 4, 6-三甲吡啶等堿進行酯化。在使用含羥基的樹脂時，作為酯化的催化劑，可使用： 1-均三甲苯基磺?；?3-硝基_1，2, 4-三唑（MSNT)、二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)、二異丙基碳 二亞胺（DIC)等一般已知的脫水縮合劑。氨基酸與脫水縮合劑的使用比例是，相對于前者 1當(dāng)量，后者，一般為1至10當(dāng)量、優(yōu)選2至5當(dāng)量。
[0139] 酯化反應(yīng)，優(yōu)選通過例如將樹脂置入固相的管柱中，再以溶劑洗凈該樹脂，之后加 入氨基酸的溶液進行操作。洗凈用溶劑，可列舉如：二甲基甲酰胺（DMF)、2_丙醇、二氯甲烷 等。溶解氨基酸的溶劑，可列舉如：二甲基亞砜（DMSO)、DMF、二氯甲烷等。酯化反應(yīng)可以在 0至50°C、優(yōu)選室溫進行約10分鐘至30小時左右、優(yōu)選15分鐘至24小時左右。
[0140] 此時固相上未反應(yīng)的基團，優(yōu)選使用乙酸酐等進行乙?；舛耍╟apping)。
[0141] 脂溶性保護基的脫離，例如以堿處理進行。該堿，可列舉如：哌啶、嗎啉等。其中， 優(yōu)選在溶劑存在下進行該操作。其溶劑，可列舉如：DMS0、DMF、甲醇等。
[0142] 游離氨基與氨基氮受脂溶性保護基所保護的任意氨基酸的羧基的酰胺化反應(yīng)，優(yōu) 選在活化劑及溶劑存在下進行。
[0143] 活化劑的例子，可列舉如：二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)U-乙基-3-(3-二甲基氨基 丙基）碳二亞胺·鹽酸鹽（WSC/HC1)、疊氮基磷酸二苯酯（DPPA)、羰基二咪唑（⑶I)、氰基 膦酸二乙酯（DEPC)、苯并三唑-1-基氧-三吡咯烷基鱗（DIPCI)、苯并三唑-1-基氧-三吡 咯烷基鱗六氟磷酸鹽（PyBOP)U-羥基苯并三唑（HOBt)、羥基琥珀酰亞胺（HOSu)、二甲基氨 基吡啶（DMAP)U-羥基-7-氮雜苯并三唑（HOAt)、羥基鄰苯二甲酰亞胺（HOPht)、五氟苯酚 (Pfp-OH)、2-(1H-苯并三唑-1-基）-1，1，3,3_四甲基脲鑰六氟磷酸鹽（HBTU)U-〔雙（二 甲基氨基）亞甲基〕-5-氯-IH-苯并三唑鑰3-氧化物六氟磷酸鹽（HCTU)、0-(7_氮雜苯并 三唑-1-基）-1，1，3,3_四甲基脲鑰六氟磷酸鹽（HATU)、〇-苯并三唑-1-基-1，1，3,3-四甲 基脲鑰四氟硼酸鹽（TBTU)、3, 4-二氫-3-羥基-4-氧雜-1，2, 3-苯并三嗪（Dhbt) (3, 4-dih ydr〇-3-hydrodi-4-〇xa-l, 2, 3-benzotriazine (Dhbt))、氯化 4- (4, 6-二甲氧基-1，3, 5-三 嗪-2-基）-4-甲基嗎啉η水合物（DMT-MM)等。
[0144] 活化劑的使用量，相對于氨基氮受脂溶性保護基所保護的任意氨基酸，為1至20 當(dāng)量、優(yōu)選1至10當(dāng)量、更優(yōu)選1至5當(dāng)量。
[0145] 溶劑的例子，可列舉如：DMSO、DMF、二氯甲烷等。反應(yīng)可以在0至50°C、優(yōu)選在室 溫，進行約10分鐘至30小時左右、優(yōu)選15分至24小時左右。脂溶性保護基的脫離，可如 上述同樣進行。
[0146] 在導(dǎo)入C末端氨基酸至氨基官能化的Rink-Amide_Resin(Merck公司制造）、 Rink-Amino-PEGA Resin (Merck 公司制造）、NH-SAL-Resin (渡邊化學(xué)公司制造）、及 NH-SAL-Resin-Linker所結(jié)合的Amino-PEGA-Resin (Merck公司制造）等時，可用上述的酰 胺化反應(yīng)進行導(dǎo)入。
[0147] 自樹脂（resin)切斷肽鏈時，優(yōu)選使用酸處理。該酸的例子，可列舉如：三氟乙酸 (TFA)、氟化氫（HF)等。
[0148] 如此操作，即可得到在期望的位置含糖鏈附加 Asn的糖鏈-多肽復(fù)合物。
[0149] 同時，在本發(fā)明的一實施方案中，在固相合成所使用的糖鏈附加 Asn中的糖鏈的 非還原末端含唾液酸時，為防止酸處理使唾液酸切斷，優(yōu)選該唾液酸的羧基經(jīng)保護基保護。 該保護基的實例，可列舉如：苯甲基、烯丙基、二苯基甲基、苯甲酰甲基等。保護基的導(dǎo)入及 保護基的脫離方法，可以以公知的方法進行。
[0150] 糖鏈-多肽復(fù)合物的制誥方法（B法）
[0151] 糖鏈-多肽復(fù)合物，可以通過先行合成多肽，之后再將合成的多肽附加在糖鏈的 方法制造。具體而言，即對在將要附加糖鏈的位置含Cys的多肽，用固相合成法、液相合成 法、以細(xì)胞合成的方法、由天然存在之物中分離萃取的方法等制造。在多肽以固相合成法或 液相合成法合成的情形時，氨基酸可各以一殘基結(jié)合，亦可結(jié)合在多肽。其中，在預(yù)定形成 雙硫鍵的位置的Cys等將不附加糖鏈的Cys，預(yù)先以如乙酰胺甲基（Acm)予以保護。同時， 在糖鏈-多肽復(fù)合物中導(dǎo)入將不附加糖鏈、且也不用于形成雙硫鍵的Cys時，可以在糖鏈 附加步驟及形成雙硫鍵步驟的過程中，預(yù)先以保護基保護Cys，之后再通過脫保護即可導(dǎo)入 Cys。此類保護基，可例舉如：叔丁基（tBu)或4-甲氧基苯甲基等。
[0152] 此外，在1多肽中，在Cys附加不同糖鏈時，可通過首先使用于導(dǎo)入糖鏈的Cys 未受保護，其次將用于導(dǎo)入不同糖鏈的Cys，預(yù)先通過StBu等保護，即可導(dǎo)入不同的糖 鏈。具體而言，即在以固相合成等合成多肽時，先使要導(dǎo)入第一糖鏈的Cys不受保護，且以 Fmoc-Cys (StBu)-OH等使要導(dǎo)入第二糖鏈的Cys等，形成含保護基的Cys。然后，再于維持 StBu等保護基的同時，在未受保護的Cys上導(dǎo)入糖鏈。其次，將StBu基團等進行脫保護，即 可在未受保護的Cys上導(dǎo)入不同的糖鏈。而且，將要導(dǎo)入第一糖鏈的Cys及將要導(dǎo)入第二 糖鏈的Cys，可為1個亦可為多個。
[0153] 此外，StBu基團的脫保護，可以使用：三（2-羧基乙基）膦鹽酸鹽（TCEP)、二硫蘇 糖醇（DTT)、三丁基膦等還原劑進行反應(yīng)而脫保護。上述反應(yīng)，一般在0至80°C進行，優(yōu)選 在5至60°C進行，更優(yōu)選在10至35°C進行。反應(yīng)時間，一般優(yōu)選為30分鐘至5小時左右。 反應(yīng)完成后，優(yōu)選再經(jīng)由適當(dāng)、公知的方法（如高效液相柱色譜（HPLC))純化。
[0154] 在導(dǎo)入不同的糖鏈時，優(yōu)選導(dǎo)入對CyS的脫保護步驟中的還原條件及HPLC等的純 化步驟中的酸性條件，更為穩(wěn)定的糖鏈。特別是，在導(dǎo)入含唾液酸的糖鏈時，優(yōu)選先導(dǎo)入不 含唾液酸的糖鏈或唾液酸殘基數(shù)少的糖鏈。
[0155] 同時，在想要于糖鏈-多肽復(fù)合物的氨基酸序列中，附加連接基團時，可通過例如 在固相合成的過程中，替代以脂溶性保護基保護的氨基酸，而使用以脂溶性保護基保護的 連接基團，即可在所合成的多肽的所期望的位置，嵌入連接基團。
[0156] 接著，再通過使鹵代乙?；擎溠苌锱c在上述中所得的含無保護Cys的肽反 應(yīng)，而使糖鏈與無保護Cys的硫醇基反應(yīng)，而結(jié)合于肽上。上述反應(yīng)，可在磷酸緩沖液、 Tris-鹽酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、或它們的混合溶液中，一般在0至80°C進行反應(yīng)，優(yōu)選在 10至60°C進行反應(yīng)，更優(yōu)選在15至35°C進行反應(yīng)。反應(yīng)時間，通常為10分鐘至24小時， 一般優(yōu)選為30分鐘至5小時左右。在反應(yīng)完成后，亦可再以適當(dāng)、公知的方法（如HPLC) 純化。
[0157] 鹵代乙?；擎溠苌铮闪信e如天冬酰胺結(jié)合型糖鏈的1位碳結(jié)合的羥基， 以-NH-(CH 2) a-(CO)-CH2X (X為鹵素原子，a為整數(shù)，只要不妨礙目的的連接基團的功能即可 并無特別的限定，而表示〇至4的整數(shù)）取代的化合物。
[0158] 具體而言，鹵代乙?；瘡?fù)合型糖鏈衍生物與含Cys多肽在磷酸緩沖液中，于室溫 反應(yīng)。反應(yīng)完成后，再經(jīng)由HPLC純化即可獲得含糖鏈結(jié)合Cys的糖鏈-多肽復(fù)合物。
[0159] 此外，亦可在DMSO、DMF、甲醇、乙腈等有機溶劑、與上述緩沖液的混合溶液中進行 反應(yīng)。此時，可以有機溶劑的比例，為0至99% (v/v)的范圍，添加至上述緩沖液中。這對 于含對緩沖液溶解性低的無保護Cys的肽是優(yōu)選的，因為可通過添加此類有機溶劑而提高 對反應(yīng)溶液的溶解性。
[0160] 此外，亦可在DMSO、DMF、甲醇、乙腈等機溶劑、及它們的混合溶液中進行反應(yīng)。優(yōu) 選在堿存在下進行該反應(yīng)。堿的例子，可列舉如：DIPEA、三乙胺、吡啶、2, 4, 6-三甲吡啶等。 同時，亦可在緩沖溶液中再加入胍鹽酸鹽或尿素的混合溶液中進行反應(yīng)。其中，胍鹽酸鹽或 尿素，可以最終濃度IM至8M加入上述緩沖溶液中。添加胍鹽酸鹽或尿素，可提高對緩沖液 溶解性低的肽的溶解性，因此是優(yōu)選的。
[0161] 此外，含無保護Cys的多肽，為了防止經(jīng)由雙硫鍵而形成2聚體，亦可在緩沖液中 添加三（2-羧基乙基）膦鹽酸鹽（TCEP)或二硫蘇糖醇（DTT)之后反應(yīng)。TCEP或DTT，可以 最終濃度10 μ M至IOmM加入緩沖溶液中。
[0162] 之后，在糖鏈結(jié)合在目的的Cys之后，再以Acm等使受保護的Cys的保護基脫保 護。在保護基為Acm基時，可在水、甲醇、乙酸、或它們的混合溶液中，使用碘、乙酸汞（II )、 硝酸銀（I)、或乙酸銀（I)等反應(yīng)而脫保護。
[0163] 上述反應(yīng)，一般在0至80°C進行，優(yōu)選在5至60°C、更優(yōu)選在10至35°C進行。反 應(yīng)時間，一般優(yōu)選為5分鐘至24小時左右。在反應(yīng)完成后，在以DTT及鹽酸等處理之后，亦 可再以適當(dāng)、公知的方法（如HPLC)純化。
[0164] 如此操作，即可得到在期望的位置含結(jié)合糖鏈的Cys的糖鏈-多肽復(fù)合物。同時， 此類純化的糖鏈-多肽復(fù)合物，亦可再如下文所述，使脫保護的Cys之間形成雙硫鍵。
[0165] 此外，在制造肽序列中含多股的含唾液酸糖鏈（諸如二唾液酸糖鏈及單唾液酸 糖鏈等）的糖鏈-多肽復(fù)合物時，亦可使用所要導(dǎo)入的糖鏈上的唾液酸的羧基，受苯甲基 (Bn)、烯丙基、二苯基甲基、苯甲酰甲基等保護的含唾液酸糖鏈。
[0166] 在導(dǎo)入唾液酸的羧基受保護的糖鏈時，亦可在后述的糖鏈-多肽復(fù)合物中雙硫鍵 的形成步驟之后，再進行唾液酸保護基的脫保護步驟。
[0167] 如此操作，通過以苯甲基等保護唾液酸的羧基，使制造步驟中經(jīng)由HPLC等的分離 /純化步驟容易。同時，保護唾液酸的羧基，亦可防止對酸不穩(wěn)定的唾液酸脫離。
[0168] 糖鏈上唾液酸羧基的保護反應(yīng)，可以本領(lǐng)域技術(shù)人員熟習(xí)的方法進行。同時，形成 雙硫鍵的糖鏈-多肽復(fù)合物中，唾液酸羧基的保護基，可以在堿性條件下進行水解脫保護。 上述反應(yīng)，一般在0至50°C進行，優(yōu)選在0至40°C進行，更優(yōu)選在0至30°C進行。反應(yīng)時 間，一般優(yōu)選為5分鐘至5小時左右。在反應(yīng)完成后，在以磷酸或乙酸等弱酸中和之后，亦 可再以適當(dāng)、公知的方法（如HPLC)純化。
[0169] 此外，通過上述A法及B法制作的糖鏈-多肽復(fù)合物，可以利用：空氣及/或氧、碘、 DMS0、氧化和還原的谷胱甘肽的混合物、鐵氰酸鉀、埃爾曼試劑（5, 5'-二硫代雙（2-硝基苯 甲酸））、三氟乙酸鉈（III )、以及烷基三氯硅烷亞砜等通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，形 成Cys之間的雙硫鍵。
[0170] 此外，在形成Cys-Cys間的雙硫鍵時，對糖鏈-多肽復(fù)合物中的不希望形成雙硫鍵 的Cys，可預(yù)先以保護基保護。此類保護基的例子，可使用如：Acm、tBu、4-甲氧基苯甲基、 4-甲基苯甲基等在氧化條件下穩(wěn)定的保護基。
[0171] 而且，B法中，形成雙硫鍵，亦可在導(dǎo)入糖鏈之前進行。但是，在要形成雙硫鍵的 Cys上導(dǎo)入保護基時，脫保護步驟須在形成雙硫鍵步驟之前進行。
[0172] 此外，B法中與鹵代乙酰化復(fù)合型糖鏈衍生物反應(yīng)的氨基酸，只要為含硫醇基 的氨基酸即可并無特別的限定，例如D-型的半胱氨酸（D-Cys)、高半胱氨酸、原半胱氨酸 (norcysteine)、青霉胺等可與Cys同樣使用。
[0173] 本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物中結(jié)合的糖鏈種類并無特別的限定，但優(yōu)選糖鏈-多 肽復(fù)合物中結(jié)合的糖鏈所存在的糖殘基數(shù)合計為5以上。例如，通過1股以上的5糖以上 的糖鏈附加、多股5糖以下的糖鏈附加，即可使存在于1個糖鏈-多肽復(fù)合物中附加糖鏈的 糖殘基數(shù)為5以上。在以多股糖鏈附加時，結(jié)合在1個肽上的糖鏈的種類可相同，亦可以以 不同種類的糖鏈組合結(jié)合，但優(yōu)選以相同種類的糖鏈結(jié)合。
[0174] 例如，在存在于糖鏈-多肽復(fù)合物中的結(jié)合糖鏈的糖殘基數(shù)合計為5時，可以用含 2個糖殘基的麥芽糖糖鏈、含3個糖殘基的麥芽三糖糖鏈各1股進行結(jié)合。同時，在存在于 糖鏈-多肽復(fù)合物中的結(jié)合糖鏈的糖殘基數(shù)合計為6時，可以3股麥芽糖糖鏈進行結(jié)合，亦 可以2股麥芽三糖糖鏈進行結(jié)合。此外，在存在于糖鏈-多肽復(fù)合物中的結(jié)合糖鏈的糖殘 基數(shù)合計為7時，可以2股麥芽糖糖鏈及1股麥芽三糖糖鏈進行結(jié)合，亦可以以1股含7個 糖殘基的二-N-乙酰葡萄糖胺糖鏈進行結(jié)合。同樣地，在存在于糖鏈-多肽復(fù)合物中的結(jié) 合糖鏈的糖殘基數(shù)合計為8以上時，可以各種組合的糖鏈進行結(jié)合。
[0175] 結(jié)合在本發(fā)明糖鏈-多肽復(fù)合物的糖鏈數(shù)，只要糖鏈-多肽復(fù)合物，不致失去可在 PH中性附近的水溶液中自組裝，而形成β-折疊結(jié)構(gòu)的特征即可并無特別的限定。例如，可 以是1、2、3、4、5、或6股，優(yōu)選是1、2、或3股。
[0176] 本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物中，糖鏈所結(jié)合的氨基酸殘基的位置，只要不致失去 糖鏈-多肽復(fù)合物，可在PH中性附近的水溶液中自組裝，而形成β -折疊結(jié)構(gòu)的特征即可 并無特別的限定。例如，糖鏈結(jié)合的氨基酸殘基的位置可以在多肽的N末端側(cè)及/或C末 端側(cè)，在N末端側(cè)及C末端側(cè)以外的位置亦可。
[0177] 優(yōu)選地，可以在從位于多肽N末端的氨基酸殘基計算，至第X個的全部的氨基酸、 及從位于C末端的氨基酸殘基計算，至第y個的全部的氨基酸（其中，X及y為整數(shù)，而X 〇、y 0,且x+y，系結(jié)合在多肽的糖鏈數(shù)的合計）上均結(jié)合糖鏈。
[0178] 更具體而言，在多肽結(jié)合的糖鏈數(shù)為1股時，該1股的糖鏈，可結(jié)合在位于所述多 肽N末端的氨基酸殘基、或位于所述多肽C末端的氨基酸殘基。
[0179] 同時，在多肽結(jié)合的糖鏈數(shù)為2股時，該2股的糖鏈，可結(jié)合在選自以下的（1)至 (3)所組成的組的氨基酸殘基：
[0180] (1)從位于多肽N末端的氨基酸殘基計算的第1個及第2個氨基酸殘基
[0181] (2)從位于多肽C末端的氨基酸殘基計算的第1個及第2個氨基酸殘基
[0182] (3)位于多肽N末端的氨基酸殘基、及位于多肽C末端的氨基酸殘基
[0183] 而且，在多肽結(jié)合的糖鏈數(shù)為3股時，該3股的糖鏈，可與選自以下（1)至（4)所 組成的組的任意氨基酸殘基結(jié)合：
[0184] (1)從位于多肽N末端的氨基酸殘基計算，第1個、第2個及第3個氨基酸殘基
[0185] (2)從位于多肽C末端的氨基酸殘基計算，第1個、第2個及第3個氨基酸殘基
[0186] (3)從位于多肽N末端的氨基酸殘基計算，第1個及第2個氨基酸殘基、及位于多 肽C末端的氨基酸殘基
[0187] (4)位于多肽N末端的氨基酸殘基、及從位于多肽C末端計算，第1個及第2個氨 基酸殘基
[0188] 本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物上所附加的糖鏈，優(yōu)選含支鏈。其中，本發(fā)明中，多肽 結(jié)合的糖鏈為所謂「含支鏈的糖鏈」時，并不限于例如，在諸如二唾液酸糖鏈、無唾液酸糖 鏈、二-N-乙酰葡萄糖胺糖鏈等1個糖鏈中含支鏈的情形，而且還涵蓋例如，在1個多肽中 附加多股直鏈糖鏈，而以肽整體而言為含支鏈糖鏈的狀態(tài)的情形。例如，在1個肽中結(jié)合 2股以上的麥芽糖糖鏈或麥芽三糖糖鏈等直鏈糖鏈時，亦包含在本發(fā)明的「含支鏈的糖鏈」 中。
[0189] 本發(fā)明中，所謂水凝膠，意指基本上分散介質(zhì)為水的凝膠。只要本發(fā)明的肽可分散 在水中，形成水凝膠，肽與水的混合比例并無特別的限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員亦可視水凝膠的 用途適當(dāng)調(diào)節(jié)混合的比例。例如，本發(fā)明的一實施方案中，在以C(DiGlcNAc) -(RADA) 4制造 水凝膠時，肽濃度為0. 5重量％以上時可在寬的pH形成水凝膠，而在肽濃度為約0. 25重 量％時，可在中性pH形成水凝膠，但在酸性pH并不形成水凝膠。因此，以本發(fā)明的肽制造的 水凝膠，在肽濃度為低濃度時，可以通過PH控制水凝膠的形成。利用此種性質(zhì)，可以例如， 在使用水凝膠后通過改變PH，使凝膠變化為溶膠，即可快速拋棄或排出。
[0190] 本發(fā)明中，對水凝膠的強度及性質(zhì)的評量方法并無特別的限定，可以通過例如鋼 球載重試驗及動力黏度測定評量。鋼球載重試驗，可例如，通過在杜漢氏管（Durham tube) 內(nèi)形成的水凝膠的表面負(fù)載給定重量的鋼球，以觀察鋼球于水凝膠的表面停留、或下沉，來 評量水凝膠的強度。同時，在鋼球載重試驗中，亦可同時目視確定水凝膠的透明度、及有無 不溶物或沉淀。在水凝膠的動力黏度測定時，通過以流變儀測定對象的水凝膠動力黏度，即 可測定隨時間經(jīng)過的水凝膠強度變化。
[0191] 此外，本實施例中評量水凝膠時，作為形成水凝膠的操作之一，亦包含劇烈攪拌的 操作。進行此類劇烈攪拌的操作，可形成高均一性的凝膠，因此可使進行的評量更可靠。
[0192] 本發(fā)明的水凝膠可用于各種用途中，例如，本發(fā)明的水凝膠對生物體的安全性高， 因此可用于醫(yī)藥用途（止血基質(zhì)、血管栓塞材料等的手術(shù)輔助劑、醫(yī)藥品等的緩釋載體、外 科手術(shù)或再生醫(yī)療等之中的創(chuàng)傷包覆材料、黏膜隆起材料、齒槽骨重建材料、角膜再生材料 等組織重建材料，組織培養(yǎng)實驗等之中的三維培養(yǎng)基質(zhì)）或化妝品用途（護膚用品、護發(fā)用 品等）上。特別優(yōu)選地，它可以用作止血基質(zhì)、緩釋載體、或培養(yǎng)基質(zhì)更佳。
[0193] 本發(fā)明中，所謂止血基質(zhì)，廣泛指生物體出血的止血所使用的基質(zhì)。本發(fā)明的止血 基質(zhì)，并不限定僅包含本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物與水，亦可再含其他的各種成分。例如， 再含具有消毒/殺菌成分的藥劑時，不只對傷口出血進行止血，亦同時可進行傷口的殺菌/ 消毒。
[0194] 本發(fā)明中，所謂緩釋載體，廣泛指具有緩緩釋放內(nèi)包物質(zhì)或藥劑的性質(zhì)的載體。本 發(fā)明的緩釋載體中內(nèi)包的物質(zhì)并無特別的限定，可內(nèi)包各種物質(zhì)或藥劑。同時，本發(fā)明緩釋 載體中內(nèi)包的物質(zhì)或藥劑并不限定為1種，亦可同時內(nèi)包2種以上的物質(zhì)或藥劑。
[0195] 本發(fā)明中，所謂培養(yǎng)基質(zhì)，廣泛指細(xì)胞及組織的培養(yǎng)所使用的基質(zhì)。例如，將本發(fā) 明的培養(yǎng)基質(zhì)涂布于細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)皿，再培養(yǎng)細(xì)胞，即可提高細(xì)胞的粘附性/成長性。 同時，例如在本發(fā)明的培養(yǎng)基質(zhì)中將細(xì)胞及組織內(nèi)包并進行培養(yǎng)，亦可對細(xì)胞及組織有效 率地進行三維培養(yǎng)。
[0196] 本發(fā)明中，所謂黏膜隆起材料，廣泛指在通過內(nèi)窺鏡手術(shù)的胃癌及食道癌等黏膜 的切除手術(shù)或黏膜下層剝離手術(shù)中，用于在病變部位形成黏膜隆起的膜下注入材料。例如， 在以內(nèi)窺鏡等切除病變部位時，在病變部位的下部注入本發(fā)明的組織隆起材料使切除部位 隆起時，可容易地進行病變部位的切除。
[0197] 本發(fā)明中，所謂血管栓塞材料，廣泛指動脈栓塞術(shù)中，作為栓塞物使用的血管內(nèi)栓 塞促進用修復(fù)材料。在肝癌或子宮肌瘤等的動脈栓塞術(shù)中，以本發(fā)明的血管栓塞材料自病 變部位上游的動脈內(nèi)注射，在與血液接觸時可形成水凝膠。由此可阻塞腫瘤營養(yǎng)供給路徑 的動脈，即可殺死腫瘤。
[0198] 本發(fā)明中，所謂組織重建材料，廣泛指再生醫(yī)療中，在生物體內(nèi)重建組織時形成支 架的材料。例如，在骨的再生中，注入本發(fā)明的組織重建材料，可形成細(xì)胞支架進行骨形成， 即可促進骨的再生。
[0199] 此外，本說明書中所使用的用語，用以說明特定的實施方案，并無限定發(fā)明的含 O
[0200] 此外，本說明書中所使用的「包含」的用語，除文意上明顯須不同地理解的情形外， 是所述事項（組件、步驟、要素、數(shù)字等）所存在的含意，但并未排除存在以外的其他事項 (組件、步驟、要素、數(shù)字等）。
[0201] 只要無不同的定義，在此所使用的全部的用語（包含技術(shù)用語及科學(xué)用語），具有 與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所廣泛理解的相同的含意。其中所使用的用語，除非明 顯表示為不同的定義，否則應(yīng)被解釋成與本說明書及關(guān)連技術(shù)領(lǐng)域中的含義一致的含義， 而不應(yīng)被解釋成理想化、或過度形式化的含義。
[0202] 第一的、第二等用語在表達(dá)各種要素的情形時使用，但應(yīng)理解這些要素并不受該 類用語所限定。此類用語只為使一種要素與其他的要素區(qū)別，例如將第一要素記載為第二 要素，同樣地，將第二要素記載為第一要素，均不會脫離本發(fā)明的范圍。
[0203] 以下，再以實施例更具體說明本發(fā)明，然而，本發(fā)明可以各種實施方案具體化，因 此