糖鏈-多肽復(fù)合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于多肽結(jié)合糖鏈的糖鏈-多肽復(fù)合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 水凝膠及纖維蛋白膠等生物凝膠，目前被利用為三維培養(yǎng)等研究用基質(zhì)、手術(shù)中/ 手術(shù)后的止血劑及創(chuàng)傷愈合敷片等外科用基質(zhì)、藥物傳送系統(tǒng)（DDS)等。
[0003] 然而，這些的大多數(shù)使用生物來源的材料，因此在使用時，存在受病毒等微生物的 感染、免疫原性、疾病傳播等風(fēng)險。例如，盡管纖維蛋白膠在手術(shù)時作為止血劑利用而有高 價值，然而其原料來自于人類血液，因此在使用于實際的手術(shù)時，常發(fā)生患者受纖維蛋白膠 中所混入的肝炎病毒所感染的事件，因此造成重大的社會問題。同時，生物來源的生物凝 膠，亦存在未必可以以品質(zhì)均一的凝膠供應(yīng)的問題。
[0004] 相對于生物來源的生物凝膠，已知以化學(xué)合成所制造的生物凝膠，無感染的風(fēng)險， 且可供應(yīng)品質(zhì)均一的凝膠（專利文獻1)。然而，目前為止已知的生物凝膠，卻在凝膠形成 時，有緩沖液的交換或置換、多種藥劑混合等步驟的必要，因此在操作上亦復(fù)雜。同時，亦 有由于因 PH范圍而成為難溶性，而有限定所并用的試劑或溶劑，而且還有限定適用的部位 (患部）、及使用時注射筒或注射管受阻塞等問題。而且，由于難溶性、特別是在接近于生物 體的PH的中性范圍內(nèi)的難溶性（亦即，不透明），因此在如手術(shù)區(qū)等需要辨視性時，使用上 會有困難。
[0005] [先前技術(shù)文獻]
[0006] 專利文獻
[0007] [專利文獻1]美國專利第5670483號

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008](發(fā)明要解決的問題）
[0009] 本發(fā)明的目的是提供在寬的pH范圍內(nèi)可形成透明均質(zhì)的水凝膠的糖鏈-多肽復(fù) 合物。
[0010](解決問題的手段）
[0011] 本發(fā)明的發(fā)明人等，為解決所述問題經(jīng)過廣泛研究的結(jié)果，意外地，發(fā)現(xiàn)通過使含 極性氨基酸殘基與非極性氨基酸殘基交互排列的氨基酸序列的多肽，與糖鏈結(jié)合所制造的 糖鏈-多肽復(fù)合物，在寬的PH范圍內(nèi)，特別是在中性范圍顯示高水溶性，因而可形成透明且 均質(zhì)的水凝膠，從而完成本發(fā)明。
[0012] 亦即，本發(fā)明提供糖鏈-多肽復(fù)合物，其特征為所述多肽是含有極性氨基酸殘基 與非極性氨基酸殘基交互排列的、由8至34個氨基酸殘基組成的氨基酸序列的多肽，且所 述多肽結(jié)合1個或多個糖鏈。
[0013] 同時，本發(fā)明的一實施方案中，其特征是，所述糖鏈-多肽復(fù)合物，在pH為中性附 近的水溶液中可通過自組裝，形成含β-折疊結(jié)構(gòu)的水凝膠。
[0014] 而且，本發(fā)明的一實施方案中，其特征是，所述各極性氨基酸殘基，是選自下述所 組成的組的氨基酸殘基：天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基、精氨酸殘基、賴氨酸殘基、組氨酸殘 基、酪氨酸殘基、絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基、天冬酰胺殘基、谷氨酰胺殘基、及半胱氨酸殘基。
[0015] 并且，本發(fā)明的一實施方案中，其特征是，所述各非極性氨基酸殘基，是選自：丙氨 酸殘基、纈氨酸殘基、亮氨酸殘基、異亮氨酸殘基、甲硫氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、色氨酸殘 基、脯氨酸殘基、及甘氨酸殘基所組成的組的氨基酸殘基。
[0016] 同時，本發(fā)明的一實施方案中，其特征是，所述各極性氨基酸殘基，是選自：天冬氨 酸殘基、谷氨酸殘基、精氨酸殘基、及蘇氨酸殘基所組成的組的氨基酸殘基；且所述各非極 性氨基酸殘基是丙氨酸殘基。
[0017] 而且，本發(fā)明的一實施方案中，其特征是，所述氨基酸序列，為「RADA」重復(fù)序列、或 「RATARAEA」重復(fù)序列。
[0018] 并且，本發(fā)明的一實施方案中，其特征是，所述氨基酸序列，是選自： RADARADARADARADA(序列編號 1)、RADARADARADARADARADA(序列編號 2)、及 RATARAEARATARAEA (序列編號3)所組成的組的氨基酸序列。
[0019] 同時，本發(fā)明的一實施方案中，其特征是，結(jié)合在所述多肽的1個或多個糖鏈中所 存在的糖殘基數(shù)合計為5以上。
[0020] 而且，本發(fā)明的一實施方案中，其特征是，結(jié)合在所述多肽的糖鏈數(shù)，為1、2、或3 股。
[0021] 并且，本發(fā)明的一實施方案中，其特征是，從位于所述多肽N末端的氨基酸殘基計 算，至第X個的所有氨基酸、及從位于C末端的氨基酸殘基計算，至第y個的所有氨基酸（其 中，X及y為整數(shù)，X彡0、y彡0,且x+y，是結(jié)合在多肽的糖鏈的總數(shù)）結(jié)合糖鏈。
[0022] 同時，本發(fā)明的一實施方案中，其特征是，結(jié)合在所述多肽的糖鏈數(shù)，為1、2、或3 股；在結(jié)合在所述多肽的糖鏈數(shù)為1股時，該1股糖鏈，結(jié)合在位于所述多肽N末端的氨基 酸殘基、或位于C末端的氨基酸殘基上；
[0023] 在結(jié)合在所述多肽的糖鏈數(shù)為2股時，該2股糖鏈，結(jié)合在選自以下（1)至（3)所 組成的組的氨基酸殘基上：
[0024] (1)從位于所述多肽N末端的氨基酸殘基計算，為第1及第2個的氨基酸殘基，
[0025] (2)從位于所述多肽C末端的氨基酸殘基計算，為第1及第2個的氨基酸殘基，
[0026] (3)位于所述多肽N末端的氨基酸殘基、及位于所述多肽C末端的氨基酸殘基，
[0027] 在結(jié)合在所述多肽的糖鏈數(shù)為3股時，該3股糖鏈，結(jié)合在任一選自以下（1)至 (4)所組成的組的氨基酸殘基：
[0028] (1)從位于所述多肽N末端的氨基酸殘基計算，為第1、第2及第3個的氨基酸殘 基，
[0029] (2)從位于所述多肽C末端的氨基酸殘基計算，為第1、第2及第3個的氨基酸殘 基，
[0030] (3)從位于所述多肽N末端的氨基酸殘基計算，為第1及第2個的氨基酸殘基、以 及位于所述多肽C末端的氨基酸殘基，
[0031] (4)位于所述多肽N末端的氨基酸殘基、及從位于所述多肽C末端計算，為第1及 第2個的氨基酸殘基。
[0032] 而且，本發(fā)明的一實施方案中，其特征是，所述糖鏈，為具有支鏈的糖鏈。
[0033] 并且，本發(fā)明的一實施方案中，其特征是，所述糖鏈，為選自：二唾液酸糖鏈、無唾 液酸糖鏈、二-N-乙酰葡萄糖胺糖鏈、二甘露糖糖鏈、N-乙酰葡萄糖胺糖鏈、麥芽三糖糖鏈、 麥芽糖糖鏈、麥芽四糖糖鏈、麥芽七糖糖鏈、β-環(huán)糊精、及γ-環(huán)糊精的糖鏈。
[0034] 同時，本發(fā)明的一實施方案中，其特征是，其是水凝膠形成用組合物，該組合物包 含本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物。而且，該水凝膠形成用組合物，可為止血用醫(yī)藥組合物、亦 可為緩釋載體用醫(yī)藥組合物、亦可為培養(yǎng)基質(zhì)用組合物。
[0035] 而且，本發(fā)明的一實施方案中，其特征是，其是含本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物的組 合物，且所述組合物，為水凝膠的狀態(tài)。并且，該類組合物，可為止血用醫(yī)藥組合物、亦可為 緩釋載體用醫(yī)藥組合物、亦可為培養(yǎng)基質(zhì)用組合物。
[0036] 將以上所述的本發(fā)明的一個或多個特征所任意組合的發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可 理解，應(yīng)包含在本發(fā)明的范圍中。
[0037](發(fā)明的效果）
[0038] 本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物，在包含中性范圍的寬的pH范圍中亦具有高水溶性， 而可形成均一透明的水凝膠，因此不受并用的藥劑或溶劑所限定，可作為各種用途使用。同 時，由于亦可在寬的pH范圍中使用，因此適用部位（患部）不受限定。
[0039] 同時，本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物，在包含中性范圍的寬的pH亦具有高水溶性， 而可形成均一透明的水凝膠，因此在中性PH亦可以溶膠（sol)狀態(tài)及凝膠（gel)狀態(tài) 可逆存在。亦即，糖鏈-多肽復(fù)合物，一旦形成凝膠狀態(tài)后，即使經(jīng)由機械性攪拌形成溶 膠狀態(tài)，亦可再形成凝膠狀態(tài)。因此，可以以凝膠狀態(tài)（亦即，為隨時可用的狀態(tài)）流通 (distributed)，而不像其它肽性凝膠，在適于凝膠化的pH(例如，酸性pH)下形成凝膠后， 須再進行緩沖液交換（或置換）等使PH為中性的繁雜操作。亦即，本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù) 合物，與其他肽性凝膠比較，操作性非常優(yōu)異。而且，本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物，可使用的 pH范圍廣，因此使用時不易發(fā)生阻塞注射筒及注射管等問題。
[0040] 此外，本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物，是由動物生物體內(nèi)存在的糖鏈所修飾，因此與 未受任何修飾的肽比較，其抗原性降低。同時，本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物，亦幾乎不會產(chǎn) 生如在經(jīng)聚乙二醇（PEG)等修飾的化合物中所見到的毒性的危險性。因此，本發(fā)明的糖 鏈-多肽復(fù)合物，在使用于生物體時具有高安全性。
[0041] 同時，由本案說明書的實施例亦可知，本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物，與結(jié)合PEG的 多肽比較，可形成更透明均一的水凝膠。
[0042] 而且，本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物，在生理條件下（中性范圍）亦可形成均一透明 的水凝膠，且具有低抗原性，因此適于作為動物活體中使用的水凝膠。
[0043] 更具體言之，含本發(fā)明糖鏈-多肽復(fù)合物的水凝膠，在中性pH，即使在含高濃度血 漿的條件下，亦具有可維持透明均一的凝膠狀態(tài)的特征，因此在利用在如止血劑方面有高 的價值。
[0044] 而且，含本發(fā)明糖鏈-多肽復(fù)合物的水凝膠，在中性pH，即使在含任何酸性蛋白 質(zhì)、堿性蛋白質(zhì)的情形下，亦具有高緩釋性，因此在用于各種物質(zhì)的緩釋載體方面有高的利 用價值。
【附圖說明】
[0045] 圖1所示的是，（RADA) 4及C (DiGlcNAc) - (RADA) 4在各種pH的鋼球載重試驗結(jié)果 的圖像。
[0046] 圖2所示的是，（RADA) 4及C (DiGlcNAc) - (RADA) 4,在含各種濃度血漿的情形下的 鋼球載重試驗結(jié)果的圖像。
[0047] 圖3所示的是，（RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4,在內(nèi)包酸性蛋白質(zhì)的情形下測 定緩釋效果結(jié)果的曲線圖。
[0048] 圖4所示的是，（RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4,在內(nèi)包堿性蛋白質(zhì)的情形下測 定緩釋效果結(jié)果的曲線圖。
[0049] 圖5所示的是，（RADA) 4,在pH2或pH7的情形下測定圓偏光二色性（CD)結(jié)果的曲 線圖。
[0050] 圖6所示的是，C (DiGlcNAc)-(RADA) 4,在pH2或pH7的情形下測定圓偏光二色性 (CD)結(jié)果的曲線圖。
[0051] 圖7所示的是，（RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4,在pH7下測定動力黏度結(jié)果的 曲線圖。
【具體實施方式】
[0052] 本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物，可以是生物來源的，亦可以通過化學(xué)合成而制造，但 就安全性或品質(zhì)的穩(wěn)定性、糖鏈的均一性方面而言，優(yōu)選以化學(xué)合成制造。
[0053] 本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物，例如在水溶液中，可通過肽分子間的靜電相互作用、 氫鍵結(jié)合、及疏水性相互作用等相互作用而自組裝。本說明書中，糖鏈-多肽復(fù)合物在水溶 液中所謂「自組裝」，是指在水溶液中多肽之間，通過某種相互作用（例如：靜電相互作用、 氫鍵結(jié)合、范德華力、疏水性相互作用等），自發(fā)地集合之意，但不應(yīng)當(dāng)被解釋為具有限制意 義。
[0054] 本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物，在水溶液中可自組裝，而形成折疊結(jié)構(gòu)。之后， 再以該折疊結(jié)構(gòu)進行數(shù)層重疊，即可形成水凝膠。確定水溶液中的糖鏈-多肽復(fù)合物 形成β -折疊結(jié)構(gòu)的方法并無特別的限定，可通過測定如含糖鏈-多肽復(fù)合物水溶液的圓 偏光二色性（CD)，予以確定。一般而言，作為具有β-折疊結(jié)構(gòu)的分子的特征，在197nm附 近的波長可見到正吸收，在216nm附近的波長可見到負吸收，通過測定圓偏光二色性，確定 這些波長附近的波峰，即可確定系形成β -折疊結(jié)構(gòu)。
[0055] 本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物，由于含極性氨基酸殘基與非極性氨基酸殘基交互排 列的氨基酸序列，在水溶液中形成β-折疊結(jié)構(gòu)時，可在β-折疊結(jié)構(gòu)一面僅排列極性氨基 酸殘基，在另一面僅排列非極性氨基酸殘基。因此，可使該β-折疊結(jié)構(gòu)，以形成隱藏疏水 面（僅排列非極性氨基酸殘基的面）的方式而組裝成二層結(jié)構(gòu)。隨后，再進而使分子自組 裝而延伸該折疊分層結(jié)構(gòu)，即可形成三維的立體結(jié)構(gòu)（如水凝膠）。在本說明書中，具 有此種性質(zhì)的多肽以SAP(自組裝肽）表示。
[0056] 本發(fā)明中，所謂「pH為中性附近」，意指pH在7. 0附近，更具體而言是指pH 5. 0至 9.0的范圍，優(yōu)選pH在6.0至8.0的范圍內(nèi)。
[0057] 同時，本發(fā)明的一實施方案中，糖鏈-多肽復(fù)合物的特征是，在pH中性附近的水溶 液中可自組裝形成含β-折疊結(jié)構(gòu)的水凝膠。因此只要具有該特征，并不排除在pH中性附 近以外的水溶液中可自組裝形成含β-折疊結(jié)構(gòu)的水凝膠的那些。
[0058] 本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物，包含含極性氨基酸殘基與非極性氨基酸殘基交互排 列的氨基酸序列的多肽。該氨基酸序列的長度并無限定，但優(yōu)選是由8至34個氨基酸殘基 組成的氨基酸序列，更優(yōu)選是由12至25個氨基酸殘基組成的氨基酸序列，且進一步優(yōu)選是 由16至21個氨基酸殘基組成的氨基酸序列。
[0059] 本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物，包含含極性氨基酸殘基與非極性氨基酸殘基交互排 列的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明中，所謂「氨基酸」，是以其最廣的意義使用，不只為構(gòu)成蛋 白質(zhì)的氨基酸，亦包含氨基酸變異體及衍生物等非構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員， 根據(jù)其廣義定義，可理解本發(fā)明中的氨基酸，可為如：構(gòu)成蛋白質(zhì)的L-氨基酸；D-氨基酸； 氨基酸變異體及衍生物等經(jīng)過化學(xué)修飾的氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鳥氨酸等非構(gòu)成 蛋白質(zhì)的氨基酸；及具有本領(lǐng)域已知的為氨基酸特征的特性的化學(xué)合成的化合物等。非構(gòu) 成蛋白質(zhì)氨基酸的例子，可包括：α -甲基氨基酸（α -甲基丙氨酸等）、D-氨基酸、類組氨 酸氨基酸（2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸（homohistidine)、α-氟化甲 基-組氨酸及α -甲基-組氨酸等）、側(cè)鏈上含額外亞甲基的氨基酸（「高」氨基酸）及氨 基酸側(cè)鏈中的羧酸官能團為磺酸基所取代的氨基酸（磺基丙氨酸等）。本發(fā)明的優(yōu)選方面 中，本發(fā)明中所使用的氨基酸，可以是蛋白質(zhì)構(gòu)成的氨基酸。
[0060] 本發(fā)明中，極性氨基酸殘基，只要為側(cè)鏈具有極性的氨基酸殘基即可并無特別的 限定，可包含如：酸性氨基酸殘基及堿性氨基酸殘基。本說明書中，酸性氨基酸殘基，可例 舉如：天冬氨酸（Asp :D)殘基、及谷氨酸（Glu :Ε)等；堿性氨基酸，可例舉如：精氨酸（Arg : R)、賴氨酸（Lys :Κ)、組氨酸（His :Η)等。
[0061] 此外，本說明書中，如「天冬氨酸（Asp :D)」等的表示，是天冬氨酸的簡寫，即使用 三字母表示時為「Asp」、以一字母表示時為「D」。
[0062] 此外，本說明書中，中性氨基酸殘基中，含羥基、酸酰胺基、硫醇基等的氨基酸殘 基，是具有極性的，因此亦包含于極性氨基酸殘基中。舉例如，本說明書中，酪氨酸（Tyr : Y)、絲氨酸（Ser :S)、蘇氨酸（Thr :T)、天冬酰胺（Asn :N)、谷氨酰胺（Gin :Q)、半胱氨酸 (Cys :C)包含于極性氨基酸殘基中。
[0063] 本說明書中，非極性氨基酸殘基，只要側(cè)鏈為不具極性的氨基酸即可并無特別的 限定，可包含如：丙氨酸（Ala :A)、纈氨酸（Val :V)、亮氨酸（Leu :L)、異亮氨酸（lie :1)、甲 硫氨酸（Met :M)、苯丙氨酸（Phe :F)、色氨酸（Trp :W)、甘氨酸（Gly :G)、脯氨酸（Pro :P)等。 [0064] 本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物中，「極性氨基酸殘基與非極性氨基酸殘基交互排 列的氨基酸序列」，優(yōu)選為該氨基酸序列為「RADA」的重復(fù)序列（重復(fù)2至8次，優(yōu)選重 復(fù)3至6次）、或「RATARAEA」的重復(fù)序列（優(yōu)選重復(fù)1至4次，更有選重復(fù)2至3次） 的那些氨基酸序列，更優(yōu)選為該氨基酸序列，為選自：RADARADARADARADA(序列編號1)、 RADARADARADARADARADA (序列編號2)、及RATARAEARATARAEA (序列編號3)所組成的組的氨 基酸序列。
[0065] 本發(fā)明中，所謂「糖鏈」，意指由1個以上單元糖（單糖及/或其衍生物）連接而成 的化合物。在由2個以上單元糖連接而成的情形時，各單元糖之間，經(jīng)脫水縮合而以糖苷鍵 結(jié)合。該類糖鏈，可例舉如：生物體中所含的單糖類及多糖類（葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海 藻糖、木糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸以及這些的復(fù)合物及衍生物），及其 他由經(jīng)分解的多糖、糖蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖、糖脂等復(fù)合生物體分子所分解或衍生的 糖鏈等范圍廣泛之物，但并不限定于此。糖鏈可為直鏈型亦可為支鏈型。
[0066] 同時，本發(fā)明中，「糖鏈」中亦包含糖鏈的衍生物，糖鏈的衍生物，可例舉如：構(gòu)成 糖鏈的糖，為含羧基的糖（例如：c-l位受氧化形成羧酸的醛糖酸（aldonic acid)(例如： D-葡萄糖受氧化的D-葡萄糖酸）、末端的C原子形成羧酸的糖醛酸（uronic acid) (D-葡萄 糖受氧化的D-葡萄糖醛酸））、含氨基或氨基的衍生物的糖（例如：D-葡萄糖胺、D-半乳糖 胺等）、含氨基及羧基兩者的糖（例如：N_輕乙酰神經(jīng)氨酸（N-glycoylneuraminic acid)、 N-乙酰胞壁酸等）、去氧化的糖（例如：2-脫氧-D-核糖）、含硫酸基的硫酸化糖、含磷酸基 的磷酸化糖等糖鏈但并不限定于此。
[0067] 本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物中，結(jié)合于多肽的糖鏈并無特別的限定，但就生物相 容性的觀點而言，優(yōu)選為在生物體內(nèi)作為復(fù)合糖（糖肽（或糖蛋白）、蛋白多糖、糖脂等）存 在的糖鏈。該類糖鏈，可例舉如生物體內(nèi)結(jié)合在肽（或蛋白質(zhì)）上的N-結(jié)合型糖鏈、0-結(jié) 合型糖鏈等糖鏈的糖肽（或糖蛋白）。
[0068] 本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物中，結(jié)合在所述多肽的糖鏈，可使用如：二唾液酸 (Disialo)糖鏈、無唾液酸（Asialo)糖鏈、二-N-乙酰葡萄糖胺（DiGlcNAc)糖鏈、二甘露 糖（DiMan)糖鏈、N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc)糖鏈、麥芽三糖（Maltotriose)糖鏈、麥芽糖 (Maltose)糖鏈、麥芽四糖（Maltotetraose)糖鏈、麥芽七糖（Maltohetaose)糖鏈、β-環(huán) 糊精（β-cyclodextrin)糖鏈、γ-環(huán)糊精（γ-cyclodextrin)糖鏈。
[0069] 更具體言的，本發(fā)明中所使用的糖鏈，可為：如下式（1)所示的二唾液酸糖鏈、如 下式（2)所示的無唾液酸糖鏈、如下式（3)所示的二-N-乙酰葡萄糖胺糖鏈、如下式（4)所 示的二甘露糖糖鏈、如下式（5)所示的N-乙酰葡萄糖胺糖鏈、如下式（6)所示的麥芽三糖 糖鏈、如下式（7)所示的麥芽糖糖鏈、如下式（8)所示的麥芽四糖糖鏈、如下式（9)所示的 麥芽七糖糖鏈、如下式（10)所示的β-環(huán)糊精糖鏈、如下式（10-2)所示的γ-環(huán)糊精糖鏈。
[0071] 式（1)二唾液酸糖鏈
[0072]
[0073] 式（2)無唾液酸糖鏈
[0075] 式⑶二-N-乙酰葡萄糖胺糖鏈
[0076]
[0077] 式（4)二甘露糖糖鏈
[0079] 式（5) N-乙酰葡萄糖胺糖鏈
[0081] 式（6)麥芽三糖糖鏈
[0082]
[0083] 式（7)麥芽糖糖鏈
[0085] 式⑶麥芽四糖糖鏈
[0087] 式（9)麥芽七糖糖鏈 [0088]
[0089] 式（10) β -環(huán)糊精糖鏈
[0091] 式（10-2) γ -環(huán)糊精糖鏈
[0092] 本發(fā)明中，亦可使用自上述二唾液酸糖鏈、無唾液酸糖鏈、二-N-乙酰葡萄糖胺糖 鏈、二甘露糖糖鏈、或麥芽七糖糖鏈的非還原末端去除1個或多個糖的糖鏈。
[0093] 本發(fā)明中，糖鏈所結(jié)合的氨基酸殘基并無特別的限定，如糖鏈可結(jié)合在半胱氨酸 (Cys :〇或天冬酰胺（Asn :Ν)上，優(yōu)選結(jié)合在半胱氨酸（Cys :〇上。
[0094] 本發(fā)明中，使糖鏈結(jié)合在氨基酸上的方法并無特別的限定，例如氨基酸殘基可直 接結(jié)合糖鏈，亦可為氨基酸殘基經(jīng)由連接基團而結(jié)合糖鏈。
[0095] 同時，本發(fā)明中，糖鏈所結(jié)合的氨基酸殘基，可與「極性氨基酸殘基與非極性氨基 酸殘基交互排列的氨基酸序列」直接結(jié)合，或可以如經(jīng)由連接基團結(jié)合。
[0096] 此類連接基團，可例舉如兩末端含氨基及羧基的烷鏈及PEG鏈等，以使其可與氨 基酸結(jié)合而形成肽鍵。此類連接基團，可舉如：-NH-(CH 2)n-C0-(式中，η為整數(shù)，只要不妨 礙目的的連接基團的功能即可并無特別的限定，優(yōu)選為1至15的整數(shù)。）或-NH-(CH 2CH2O) ^-CH2CH2-CO-(式中，m為整數(shù)，只要不妨礙目的連接基團的功能即可并無特別的限 定，優(yōu)選為1至7的整數(shù)。）等。更具體地可舉如：-NH- (CH2) n-C0- (C12-連接基團） 及-NH- (CH2CH2O) 3-CH2CH2-C0- (PEG-連接基團）等。
[0097] 本發(fā)明的糖鏈-多肽復(fù)合物，可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員一般已知的多肽合成方法， 再加入糖鏈附加步驟制造。在附加糖鏈時，盡管可以利用，以轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶為代表的酶的方 法，但該情形時，會有附加的糖鏈必須是大量的、使最終步驟后的純化煩雜、糖鏈附加的位 置及可附加的糖鏈亦受限定等問題。因此該方法雖可使用于分析用途等少量的合成中，但 在大規(guī)模制造上其并非是實用性的方法。
[0098] 以下所例舉的是本發(fā)明糖鏈-多肽復(fù)合物的簡便制造方法的具體例：通過使用結(jié) 合糖鏈的Asn (糖鏈附加 Asn)，再適當(dāng)使用固相合成、液相合成等公知的肽合成方法而制造 糖鏈-多肽復(fù)合物的方法（A法）；及通過依照公知的肽合成方法制造任意氨基酸殘基是 Cys的多肽，之后，再經(jīng)由化學(xué)合成在Cys上附加糖鏈，以制造糖鏈-多肽復(fù)合物的方法（B 法）。以此類制造方法為參考，本領(lǐng)域技術(shù)人員即可以各種方法制造糖鏈-多肽復(fù)合物。
[0099] 再者，此類A法及B法，亦可以2種以上組合進行。在用于分析等少量的合成 時，上述方法可進一步與轉(zhuǎn)移酶的糖鏈延伸反應(yīng)組合使用。而且，A法，在專利國際公開第 2004/005330 號簡報（US 2005222382 (Al))中，B法，在國際公開第 2005/010053 號簡報（US 2007060543 (Al))中，亦各有記載，其所公開內(nèi)容亦全部并在本說明中作為參考。此外，關(guān)于 制造在A法及B法中所使用的糖鏈構(gòu)造為均一的糖鏈，亦曾記載在國際公開第03/008431 號簡報（US 2004181054(A1))、國際公開第 2004/058984 號簡報（US 2006228784(A1))、國 際公開第2004/058824號簡報（US 2006009421 (Al))、國際公開第2004/070046號簡報（US 2006205039 (Al))、國際公開第2007/011055號簡報等之中，其所公開內(nèi)容亦全部并在本說 明中作為參考。
[0100] 糖鏈-多肽復(fù)合物的制誥方法（A法）
[0101] 糖鏈-多肽復(fù)合物，可如，以下概略所示，使用結(jié)合糖鏈的Asn經(jīng)由固相合成制造。
[0102] (1)先使氨基氮受脂溶性保護基保護的氨基酸的羧基結(jié)合于樹脂（resin)。在該 情形下，由于氨基酸的氨基氮受脂溶性保護基所保護，因此可防止氨基酸之間自縮合，而使 樹脂與氨基酸反應(yīng)而結(jié)合。
[0103] (2)之后再使所得反應(yīng)物的脂溶性保護基脫離而形成游離氨基。
[0104] (3)該游離氨基，再與氨基氮受脂溶性保護基所保護的任意氨基酸的羧基，進行酰 胺化反應(yīng)。
[0105] (4)之后使上述脂溶性保護基脫離而形成游離氨基。
[0106] (5)重復(fù)上述（3)及（4)的步驟1次以上，即可使任意數(shù)目的任意氨基酸結(jié)合而獲 得一末端結(jié)合樹脂，另一末端上含游離氨基的肽。
[0107] (6)在上述（5)中所合成的肽的游離氨基將要受乙酰基所保護時，優(yōu)選使用乙酸 酐、乙酸等進行乙?；?br>[0108] (7)最后，再以酸切斷樹脂，即可得到具有期望的氨基酸序列的肽。
[0109] 其中，在（1)中，通過使用氨基氮受脂溶性保護基所保護的糖鏈附加 Asn，替代氨 基氮受脂溶性保護基所保護的氨基酸，并使該天冬酰胺部分的羧基與樹脂的羥基反應(yīng)，即 可獲得C末端含糖鏈附加 Asn的肽。
[0110] 同時，在⑵之后，或以1次以上的任意次數(shù)重復(fù)⑶及⑷之后，在⑶中，使用 氨基氮受脂溶性保護基所保護的糖鏈附加 Asn，替代氨基氮受脂溶性保護基所保護的氨基 酸，即可在多肽的任意位置結(jié)合糖鏈。
[0111] 如此操作，在任何（1)及（3)的步驟中，2次以上，使用氨基氮受脂溶性保護基所保 護的糖鏈附加 Asn，替代氨基氮受脂溶性保護基所保護的氨基酸，即可在多肽的任意2處以 上結(jié)合糖鏈。
[0112] 在結(jié)合糖鏈附加 Asn之后，再使脂溶性保護基脫離而形成游離氨基，之后隨即進 行步驟（7)，即可得到N末端含糖鏈附加 Asn的多肽。
[0113] 提供的C末端為酰氨基的樹脂，一般只要為可在固相合成中使用的樹脂即可， 優(yōu)選使用如：以氨基官能化的Rink-Amide-Resin (Merck公司制造）、Rink-Amide-PEGA Resin (Merck公司制造）、或NH-SAL-Resin (渡邊化學(xué)公司制造）。此外，亦可在以氨基官能 化的 Amino-PEGA-Resin (Merck 公司制造）等上再結(jié)合 Fmoc-NH-SAL-Resin-Linker (渡邊 化學(xué)公司制造）等。之后再以酸切斷該類樹脂與肽，即可使肽C末端的氨基酸酰胺化。
[0114] 此外，使C末端為羧酸的樹脂（resin)，優(yōu)選使用如：以氯官能化的2-氯三苯 甲基氯樹脂（Merck公司制造）、以氨基官能化的Amino-PEGA Resin (Merck公司制造）、 含羥基的NovaSyn TGT醇樹脂（Merck公司制造