WL EasyTaq (全式金生物技術有 限公司），加水至25 μL。PCR反應程序設置為：94°C預變性4min，94°C變性30s，58°C退火 30s，72°C延伸2min，共25個循環(huán)，循環(huán)結束后進行72°C終延伸10 min，4°C保存。PCR產(chǎn)物 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳來檢測目的片段（圖1)。
[0019] 1.5目的基因的克隆與測序 對目標片段進行切膠回收，純化后的DNA片段連接到pMD18T simple vector載體上， 轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，經(jīng)藍白斑篩選和PCR檢測，對陽性克隆進行測序，得到206bp 的26S RNA的核苷酸序列（具體序列見SEQ ID NO. 3)。
[0020] 實施例2.煙草26S RNA基因在不同組織器官及不同生長發(fā)育階段表達的穩(wěn)定性 分析 2. 1樣品的制備 分別以煙草幼苗期根、旺長期根、成熟期根、盛花期根、莖、葉、萼片、花冠、柱頭、子房、 雄蕊、雌蕊12個組織器官的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，具體提取方法詳見實施例1 中I. 1、1. 3所述。
[0021] 2.2 RT-qPCR 引物的合成 qPCR上游引物如SEQ ID NO. 4所示；qPCR上游引物如SEQ ID NO. 5所示； 由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。
[0022] 2.3聚合酶鏈式反應（PCR) 以步驟2. 1中的cDNA為模板，以2. 2中獲得的引物進行PCR擴增反應，PCR反應體系： 在25 PL的體系中依次加50 ng模板、I PL的正、反向引物、I PL EasyTaq，加水至25 μL。 PCR反應程序為：94°C預變性4 min，94°C變性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸40 s，共25個 循環(huán)。再72°C終延伸10 min，4°C保存。PCR反應結束后，取2 PL PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂 糖凝膠電泳檢測，凝膠成像觀察。
[0023] 2. 4實驗結果 檢測結果如圖2所示，擴增到12條亮度基本一致、單一的條帶，表明26S RNA基因在煙 草不同生長發(fā)育階段、不同組織器官中表達穩(wěn)定，同時還表明，本發(fā)明設計的實時熒光定量 PCR引物具有很高的特異性。
[0024] 實施例3.煙草26S RNA基因在不同激素處理條件下表達的穩(wěn)定性分析 3.1不同激素處理的煙草樣品的制備 將煙草種子置于培養(yǎng)皿中，加入Hoagland溶液在光照和黑暗12/12 h (25/23°C)條件 下培養(yǎng)，至發(fā)芽后2周時用以下激素進行處理5小時：10 μmol/L的生長素（IAA)、獨腳金內 酯（GR24)、細胞分裂素（6-BA)和油菜素內酯（BR)，50ymol/L的脫落酸（ABA)和的赤霉素 (GA)以及100 μ mol/L的茉莉酸甲酯（MeJA)，取整株幼苗煙草參照實施例1中I. 1方法提 取RNA，并參照實施例1中1. 3制取cDNA。
[0025] 3. 2聚合酶鏈式反應 以步驟3. 1中的cDNA為模板，以2. 2中獲得的引物進行PCR擴增反應，以具體方法詳 見實施例2中2. 3所述。
[0026] 3. 3實驗結果 檢測結果如圖3所示，在采用實施例2中的實時熒光定量PCR引物為引物時，經(jīng)7種激 素處理的煙草樣品中擴增到與對照（未處理）樣品亮度基本一致的條帶，從而表明26S RNA 基因在不同激素的處理后能夠穩(wěn)定表達。
[0027] 實施例4. 26S RNA基因在煙草中的特異性實時熒光定量PCR的檢測 4. 1樣品的制備 參照實施例1中I. 1步驟提取煙草總RNA，并參照實施例1中1. 4步驟反轉錄制成 cDNA 〇
[0028] 4. 2熒光定量PCR 以4. 1中cDNA為模板，以2. 2中合成的引物為定量引物，用Bio-Rad CFX96熒光定量 PCR儀進行PCR擴增反應。在25 PL的反轉錄體系設置和反應過程中依次加入以下試劑： 12. 5 μL SYBR Green qPCR Mix，50 ng cDNA為模板，實例2中實時熒光定量PCR的正、反向 引物各I KL (濃度為10 Mmol/L)，再加蒸餾水至25 μL，反應程序為：95°C預變性10 min， 先運行40個循環(huán)再95°C變性15 s，60°C退火30 s。為檢測PCR擴增基因的特異性，在PCR 反應之后運用溶解曲線分析，擴增溫度以0. 5°C的增幅從65°C緩慢遞增到95°C，每個增幅 的時間為5 s，連續(xù)檢測樣品的熒光強度以獲取溶解曲線。
[0029] 4· 3實驗結果 反應結果如圖4所示，3次重復的熒光定量PCR擴增曲線在20個循環(huán)出現(xiàn)，且穩(wěn)定良 好，表明基因豐度高而穩(wěn)定；溶解曲線結果如圖5所示：Tm值為83°C，只有一個特異而尖銳 的峰，表明本發(fā)明設計的定量擴增引物特異性強、無非特異性產(chǎn)物擴增出現(xiàn)。
[0030] 最終表明，26S RNA基因在煙草內表達穩(wěn)定，可作為定量煙草的內參基因，通過該 內參基因研究煙草基因表達分析時，能夠提高煙草基因表達分析研究的可靠性和穩(wěn)定性。
【主權項】
1. 一種煙草26SRNA基因，其特征在于：所述基因核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。2. -種煙草26SRNA基因的克隆方法，其特征在于：通過對煙草組織樣本的芯片表達 數(shù)據(jù)分析，篩選出26SRNA基因序列，以引物對26SRNA-F/26SRNA-R進行PCR擴增、獲得 陽性克隆，后經(jīng)質粒測序驗證；其中引物對序列如SEQIDNO. 1/SEQIDNO2所示；所獲得 的目的片段如SEQIDNO. 3,大小為206bp。3. 根據(jù)權利要求2所述的煙草26SRNA基因的克隆方法，其特征在于：通過對煙草不 同生長發(fā)育時期的50~150個不同組織樣本的芯片表達數(shù)據(jù)分析，篩選在所有樣品中穩(wěn)定 表達且變異系數(shù)較小的組成型26SRNA基因序列。4. 根據(jù)權利要求2所述的煙草26SRNA基因的克隆方法，其特征在于：通過對煙草不 同生長發(fā)育時期的99個不同組織樣本的芯片表達數(shù)據(jù)分析。5. 根據(jù)權利要求2所述的煙草26SRNA基因的克隆方法，其特征在于：所述PCR擴增 的反應程序如下：94°C預變性4min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸40s，共25 個循環(huán)，再72°C終延伸10min，4°C保存。6. -種煙草26SRNA基因的qRT-PCR擴增方法，其特征在于：以26SRNA的基因序列 為基礎，設計1~5對熒光定量特異引物，以10~30個煙草樣本的cDNA為模板，進行qRT-PCR 擴增，熒光染料為SYBRGreen，其中qRT-PCR的熒光定量PCR引物，其序列如SEQIDNO. 4/ SEQIDNO. 5 所示。7. 根據(jù)權利要求6所述的煙草26SRNA基因的qRT-PCR擴增方法，其特征在于：以26S RNA的基因序列為基礎，按照實時熒光定量PCR引物設計的原則，設計1對熒光定量特異 引物，以不同生長發(fā)育時期、不同組織器官，以及不同激素處理條件下的20個煙草樣本的 cDNA為模板。8. 根據(jù)權利要求6所述的煙草26SRNA基因的qRT-PCR擴增方法，其特征在于：在利 用半定量PCR評估26SRNA基因表達水平的穩(wěn)定性和可靠性之后進行qRT-PCR擴增，所述 半定量PCR擴增程序如下：94°C預變性4min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸40 s，共25個循環(huán)，再72°C終延伸10min，4°C保存。9. 根據(jù)權利要求6所述的煙草26SRNA基因的qRT-PCR擴增序列方法，其特征在于：所 述的qRT-PCR擴增采用兩步法，即在95°C預變性10min，先運行40個循環(huán)再95°C變性15 s，60°C退火30s，然后為檢測PCR擴增基因的特異性，在PCR反應之后運用溶解曲線，擴增 溫度以0. 5°C的增幅從65°C緩慢遞增到95°C，每個增幅的時間為5s。10. 煙草26SRNA基因在煙草功能基因或不同發(fā)育時期基因表達的相對水平的內參基 因中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，具體涉及煙草26S？RNA（26Sribosomal？RNA）內參基因的克隆方法及其應用。本發(fā)明所獲得的26S？RNA基因的部分核苷酸序列可作為研究煙草功能基因或不同組織、不同生長發(fā)育階段以及不同激素處理條件下的基因表達分析的內參基因。利用該內參基因設計的實時熒光定量PCR引物擴增特異性強，能夠提高煙草基因表達分析研究的穩(wěn)定性、可靠性和重復性。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68, C12N15/10
【公開號】CN105385687
【申請?zhí)枴緾N201510989404
【發(fā)明人】謝小東, 楊軍, 秦廣雍, 張劍鋒, 羅朝鵬, 李鋒, 王晨, 王燃, 林福呈
【申請人】中國煙草總公司鄭州煙草研究院, 鄭州大學
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年12月24日