一種100bp梯度DNA分子量標(biāo)志物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)試劑制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種IOObp梯度DNA分子量 標(biāo)志物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在DNA合成及各種方式的基因操作過程中，需要對合成的或進(jìn)行操作的DNA分子 大小變化進(jìn)行監(jiān)測，常用的方法是通過將待測DNA分子與一種已知分子量的DNA混合標(biāo)準(zhǔn) 物質(zhì)同時進(jìn)行電泳，通過比較待測DNA分子與DNA分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在電泳過程中的迀移程度 來判斷待測DNA分子的大小。因此需要制備一些已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA。制備標(biāo)準(zhǔn)DNA的 常用方法有以下4種：
[0003] 化學(xué)合成法：是通過化學(xué)反應(yīng)的方法將4種不同的脫氧核糖核苷酸結(jié)合在一起， 合成目標(biāo)大小的DNA片段。但是此方法操作繁瑣、效率低、合成DNA長度受限。
[0004] 片段連接法：是先用化學(xué)合成法合成一些小分子量的DNA分子，再用酶促連接反 應(yīng)將小分子DNA -個個逐步連接起來，形成不同大小的DNA分子。理論上合成DNA長度不 限，但操作繁瑣，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模制備。
[0005] 酶切法：是用一種或者兩種限制性內(nèi)切酶對噬菌體DNA，質(zhì)粒進(jìn)行切割，產(chǎn)生不同 大小的DNA片段，作為分子量標(biāo)志，此方法的缺陷是酶切產(chǎn)生的DNA片段大小受所用限制性 內(nèi)切酶的限制，難以形成像IOObp整數(shù)倍的DNA片段且DNA分子的制備和純化過程比較復(fù) 雜，成本高且產(chǎn)率低。
[0006] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR法）：此方法可實(shí)現(xiàn)任意分子量大小的DNA片段、模板來 源不受限制、成本低、可規(guī)?；a(chǎn)且快速便捷，已廣泛用于基因克隆和DNA片段的制備。 目前國內(nèi)的專利中有一公開的專利是利用此方法制備IOObp分子量的標(biāo)志物，專利號： 200410103204. 4。但是此方法仍然使用11對特異性的引物分別對11個片段進(jìn)行擴(kuò)增，操 作復(fù)雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的之一在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，設(shè)計一種IOObp梯度DNA分子量標(biāo) 志物的制備方法。所述方法采用無縫克隆與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相結(jié)合的方法，以重組質(zhì)粒為 模板，使用1對特異性引物分別對目標(biāo)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，簡化了操作步驟，且能按預(yù)定目 標(biāo)快速、精確、大量地制備用于DNA分子量標(biāo)志物的不同長度的DNA分子。
[0008] 本發(fā)明提供一種IOObp梯度DNA分子量標(biāo)志物的制備方法，采用無縫克隆與聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相結(jié)合的方法，具體包括如下步驟：以10個含有DNA片段的重組質(zhì)粒為模板，用 1對特異性引物，在有PCR mix存在的條件下，在PCR儀上，在同一個PCR擴(kuò)增條件下進(jìn)行 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，同時合成10條DNA片段，所得DNA帶的長度分別為：400bp、500bp、600bp、 800bp、900bp、1000 bp、1150bp、1300bp、1500bp、2200bp，再經(jīng)純化、混合而成：
[0009] (1)模板DNA :采用10個含有DNA片段的重組質(zhì)粒；
[0010] ⑵1對引物的DNA序列如下：
[0011] 上游引物-SjF :5' -GGATATCTGTGGATCCGA-3' ；
[0012] 下游引物-SjR :5' -GGTGGTGGTGCTCGAGTG-3' ；
[0013] 每條引物溶液的濃度為10 ymol/L ;
[0014] (3)DNA條帶的制備-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：取10個PCR用薄壁離心管，分別標(biāo)上 400bp、500bp、600bp、800bp、900bp、1000 bp、1150bp、1300bp、1500bp、2200bp 的標(biāo)志，按以下 方案，在每個管中加入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用的試劑：
[0015] 2XPCR mix 50 μΙ·, 卜.游弓丨物-SjF 2,5 μι, ΙΟμηιοΙ/L； 卜游4??-?R 2.5 μL. !0 ^iraoizL； 重組質(zhì)粒DNA 0.1 pL： 加去離子水至總體積為 100 μL;
[0016] (4)擴(kuò)增反應(yīng)條件為 ％°C 5min ;%°C 3〇sec，6〇°C 3〇sec，72°C I. 5min，共 3〇 個循 環(huán)；72°C延伸 lOmin，10°C保存；
[0017] (5)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，確定片段大?。?br>[0018] (6)片段確定后，使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒對剩余擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，測定 濃度后-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0019] (7) IOObp梯度DNA分子量標(biāo)志物的構(gòu)建：
[0020] 將 400bp、500bp、600bp、800bp、900bp、lOOObp、1150bp、1300bp、1500bp、2200bp 共 10條DNA片段溶于TE緩沖液中，將含有DNA的溶液與6 X DNA上樣緩沖液以5:1的比例配 制、混勻，使500bp、lOOObp、1500bp條帶的終濃度為80ng/ μ L，其余條帶的終濃度為40ng/ μ L ；
[0021] 或?qū)?500bp、800bp、1000bp、1300bp、1500bp、2200bp 共 6 條 DNA 片段溶于 TE 緩沖 液中，將含有DNA的溶液與6 X DNA上樣緩沖液以5:1的比例配制、混勻，使500bp、1000 bp、 1500bp條帶的終濃度為80ng/ μ L，其余條帶的終濃度為40ng/ μ L。
[0022] 進(jìn)一步的，所述6XDNA上樣緩沖液包括：30mmol/L EDTA，體積分?jǐn)?shù)36%的丙三 醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)〇. 05 %的溴酚藍(lán)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 05 %的二甲苯氰FF。
[0023] 進(jìn)一步的，所述10個重組質(zhì)粒的制備方法包括如下步驟：
[0024] (1)提取日本血吸蟲成蟲基因組DNA ;
[0025] (2)篩選模板DNA :以含有信號肽、具有跨膜結(jié)構(gòu)編碼蛋白以及胞外段編碼大于 110個氨基酸為篩選標(biāo)準(zhǔn)，通過Schistodb數(shù)據(jù)庫選取10個基因，具體基因序列如下：
[0026] 400bp 基因 Sjp_0104440 序列如 SEQ ID NO: 1 所示；
[0027] 500bp 基因 Sjp_0133040 序列如 SEQ ID N0:2 所示；
[0028] 600bp 基因 Sjp_0073840 序列如 SEQ ID N0:3 所示；
[0029] 800bp 基因 Sjp_0117070 序列如 SEQ ID N0:4 所示；
[0030] 900bp 基因 Sjp_0097450 序列如 SEQ ID N0:5 所示；
[0031] 1000 bp 基因 Sjp_0042690 序列如 SEQ ID N0:6 所示；
[0032] 1150bp 基因 Sjp_0072390 序列如 SEQ ID N0:7 所示；
[0033] 1300bp 基因 Sjp_0121630 序列如 SEQ ID N0:8 所示；
[0034] 1500bp 基因 Sjp_0007620 序列如 SEQ ID N0:9 所示；
[0035] 2200bp 基因 Sjp_0004440 序列如 SEQ ID NO: 10 所示；
[0036] (3)設(shè)計無縫克隆引物；
[0037] (4)構(gòu)建重組質(zhì)粒。
[0038] 進(jìn)一步的，所述設(shè)計無縫克隆引物的方法包括如下步驟：以上述10個基因 DNA序 列信息為基礎(chǔ)，根據(jù)無縫克隆原理設(shè)計無縫克隆引物，所述引物長度限定在15~35bp，所 述引物5'端包含與載體pET32c(+)末端相同的18個堿基序列，具體的無縫克隆引物如下：
[0039] 400bp基因 Sjp_0104440無縫克隆上游引物序列如SEQ ID NO: 11所示；
[0040] 400bp基因 Sjp_0104440無縫克隆下游引物序列如SEQ ID NO: 12所示；
[0041] 500bp基因 Sjp_0133040無縫克隆上游引物序列如SEQ ID NO: 13所示；
[0042] 500bp基因 Sjp_0133040無縫克隆下游引物序列如SEQ ID NO: 14所示；
[0043] 600bp基因 Sjp_0073840無縫克隆上游引物序列如SEQ ID NO: 15所示；
[0044] 600bp基因 Sjp_0073840無縫克隆下游引物序列如SEQ ID NO: 16所示；
[0045] 800bp基因 Sjp_0117070無縫克隆上游引物序列如SEQ ID NO: 17所示；
[0046] 800bp基因 Sjp_0117070無縫克隆下游引物序列如SEQ ID NO: 18所示；
[0047] 900bp基因 Sjp_0097450無縫克隆上游引物序列如SEQ ID NO: 19所示；
[0048] 900bp基因 Sjp_0097450無縫克隆下游引物序列如SEQ ID N0:20所示；
[0049] 1000 bp基因 Sjp_0042690無縫克隆上游引物序列如SEQ ID N0:21所示；
[0050] 1000 bp基因 Sjp_0042690無縫克隆下游引物序列如SEQ ID N0:22所示；
[0051] 1150bp基因 Sjp_0072390無縫克隆上游引物序列如SEQ ID N0:23所示；
[0052] 1150bp基因 Sjp_0072390無縫克隆下游引物序列如SEQ ID N0:24所示；
[0053] 1300bp基因 Sjp_0121630無縫克隆上游引物序列如SEQ ID N0:25所示；
[0054] 1300bp基因 Sjp_0121630無縫克隆下游引物序列如SEQ ID N0:26所示；
[0055] 1500bp基因 Sjp_0007620無縫克隆上游引物序列如SEQ ID N0:27所示；
[0056] 1500bp基因 Sjp_0007620無縫克隆下游引物序列如SEQ ID N0:28所示；
[0057] 2200bp基因 Sjp_0004440無縫克隆上游引物序列如SEQ ID N0:29所示；
[0058] 2200bp基因 Sjp_0004440無縫克隆下游引物序列如SEQ ID N0:30所示。
[0059] 進(jìn)一步的，所述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括如下步驟：
[0060] 使用設(shè)計好的無縫克隆引物進(jìn)行目的DNA片段的PCR擴(kuò)增；
[0061] 采用酶切方法將載體線性化；
[0062] 將制得的目的DNA片段和線性化載體進(jìn)行重組反應(yīng)制得連接產(chǎn)物并將所述連接 產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化制得克隆產(chǎn)物；
[0063] 將克隆產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化宿主菌，涂平板挑選出陽性克隆子。
[0064] 進(jìn)一步的，所述使用設(shè)計好的無縫克隆引物進(jìn)行目的DNA片段的PCR擴(kuò)增的具體 步驟為：以日本血吸蟲成蟲基因組為模板DNA，用上述無縫克隆引物分別對10個基因的DNA 片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0065] 所述PCR反應(yīng)體系為：
[0066] 2xPCR mix 25 μL； i .游引物 1.0 ，IO μη·丨ol/L; 卜游引物 1.0 μL，丨 0 μηιοΙ/Ι_,; 日本血吸蟲成蟲基因組DNA LOpL; 去離子水 22 μL,; 總體積 _5:0. jiL
[0067] 擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94°C 5min ;94°C 30sec，58°C 30sec，72°C I. 5min，共 30 個循環(huán)； 72°C 延伸 10min，4°C 保