一種蛇毒纖溶酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種從蛇毒中制備蛇毒纖溶酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]纖溶酶是一種絲氨酸蛋白酶，屬胰蛋白酶，類似于血纖維蛋白溶酶，它能水解蛋白質(zhì)底物、堿性氨基酸的酯及酰胺，并具有強(qiáng)烈的溶解血纖蛋白的作用。
[0003]目前由于各種原因引起的血液栓塞疾病，如腦血栓、心肌梗塞，冠心病，肢體血管栓塞等的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，此類疾病嚴(yán)重危害了患者的生存質(zhì)量。目前上市的溶栓類生化藥物中很多都存在著不足，如降纖酶只在體內(nèi)激活人體纖溶系統(tǒng)，不直接溶栓；尿激酶制劑中存在二聚體，易導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)。
[0004]本發(fā)明的目的在于改進(jìn)分離純化方法，從蛇毒干粉中提取對(duì)血栓有直接溶解作用的高純度纖溶酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供從蛇毒中提取蛇毒纖溶酶的方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是：將蛇毒干粉經(jīng)離子交換層析、凝膠過(guò)濾純化和冷凍干燥得到取蛇毒纖溶酶精品，包括如下步驟：
(1)蛇毒干粉用pH 7. 0-9. 0 的含 0. 01-0. 20mol/L NaCl 的 0. 01-0. 05 mol/L 磷酸緩沖液溶解，離心去沉淀，得上清液；
(2)離子交換層析：取上述緩沖液上樣于DEAE-SepharoseFast Flow柱后，用pH7· 0~9· 0 含 0· 01~0· 20mol/L NaCl ^0. 01-0. 05 mol/L 磷酸平衡液沖洗至 0D〈0. 1，換用 pH7. 0-9. 0含0· 1-0. 5mol/L NaCl的0· 01-0. 05 mol/L磷酸緩沖液作為洗脫液洗脫，紫外檢測(cè)，收集酶活性部分，超濾濃縮；
(3)凝膠過(guò)濾層析：將上述濃縮液上樣于SepharcylS-200凝膠柱，用pH 6. 0-8. 0含0. 01-0. 20mol/L NaCl的0· 01?0· 05 mol/L磷酸緩沖液洗脫，紫外檢測(cè)儀檢測(cè)并記錄，洗脫酶活性峰，超濾后冷凍干燥，即得成品。
【具體實(shí)施方式】
[0007]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表述的范圍。
實(shí)施例
[0008]1)蛇毒干粉的溶解
取蛇毒干粉50g，溶于1500ml pH 8· 0含0. 10mol/L NaCl的0. 02 mol/L磷酸緩沖液緩沖液中，于4°C冰箱中放置過(guò)夜，lOOOOrpm離心8min，去除不溶物，得蛇毒上清液。
[0009]2)離子交換層析
2. 1)將上述上清液上樣于 DEAE-Sepharose Fast Flow 柱，用 pH 8· 0 含 0. 10mol/LNaCl的0. 02mol/L磷酸平衡液沖洗至0D〈0. 1 ；
2. 2)換用pH 8· 0含0. 20mol/L NaCl的0. 02mol/L磷酸洗脫液洗脫，紫外檢測(cè)，收集酶活性部分；
2.3)用超濾器（3KD膜）超濾濃縮至約100ml。
[0010]3)凝膠過(guò)濾層析
3.1)將上述濃縮液上樣于Sepharcyl S-200凝膠柱；
3.2)用 pH 7. 0 含 0. 30mol/L NaCl 的 0. 02mol/L 磷酸緩沖液洗脫，流速為 lml/min ；
3.3)用紫外檢測(cè)儀檢測(cè)并記錄，洗脫酶活性峰；
3.4)超濾（3KD)脫鹽后再進(jìn)小型凍干機(jī)冷凍干燥，即得成品。
[0011]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種從蛇毒中提取蛇毒纖溶酶的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)蛇毒干粉用含NaCl的磷酸緩沖液溶解后，離心去沉淀，得上清液； (2)離子交換層析:將上述上清液，上樣于DEAE-SepharoseFast Flow柱，用含NaCl的磷酸平衡液沖洗，換用含不同濃度NaCl的磷酸洗脫液洗脫；紫外檢測(cè)，收集酶活性部分，超濾濃縮； (3)凝膠過(guò)濾層析:將上述濃縮液上樣于SepharcylS-200凝膠柱，用含NaCl的磷酸緩沖液平衡，紫外檢測(cè)儀檢測(cè)并記錄，洗脫酶活性峰，超濾后冷凍干燥，即得成品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取蛇毒纖溶酶的方法，其特征在于所述步驟(1)中所述的緩沖液是pH 7.0-9.0的含0.01-0.20mol/L NaCl的0.01-0.05 mol/L磷酸緩沖液。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取蛇毒纖溶酶的方法，其特征在于所述步驟(2)中所述平衡液是pH 7.0-9.0含0.01-0.20mol/L NaCl的0.01-0.05 mol/L磷酸緩沖液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取蛇毒纖溶酶的方法，其特征在于所述步驟(2)中所述洗脫液用pH 7.0-9.0含0.1-0.5mol/L NaCl的0.01-0.05 mol/L磷酸緩沖液。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中提取蛇毒纖溶酶的方法，其特征在于所述步驟(4)中所述平衡液是pH 7.0-9.0含0.01-0.20mol/L NaCl的0.01-0.05 mol/L磷酸緩沖液。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種蛇毒纖溶酶的制備方法。其特征在于以蛇毒干粉為原料，經(jīng)干粉的溶解、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析和冷凍干燥以得到纖溶酶成品。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明采用多次層析能有效去除雜質(zhì)，提高蛇毒纖溶酶的純度，進(jìn)而以較高的收率獲得純度高、活性好的蛇毒纖溶酶。蛇毒纖溶酶高純度提取，將為治療血栓類疾病開(kāi)拓一條有效的新途徑。
【IPC分類】C12N9/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105385671
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510826560
【發(fā)明人】劉乃山, 于曉娜, 劉翠珍
【申請(qǐng)人】青島康原藥業(yè)有限公司
【公開(kāi)日】2016年3月9日
【申請(qǐng)日】2015年11月25日