一種復活小麥矮縮病毒冰凍毒源的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物學技術領域，具體地，涉及以較低的成本和簡單的操作將小麥矮縮病毒復活的技術。
【背景技術】
[0002]小麥矮縮病毒(Wheat dwarf virus, WDV)是雙生病毒科(Geminiviridae)玉米線條病毒屬(Mastrevirus)的成員，病毒粒體為孿生顆粒形態(tài)。該病毒擁有廣泛的寄主，包括小麥(Triticum aestivum)、大麥(Hordeum vulgare)，燕麥(Avena sativa)等禾本科作物以及一些雜草，引起植株的嚴重矮縮、黃化、條斑和分蘗增多等癥狀。按照寄主范圍和基因組序列，目前可劃分為3個不同株系，分別為小麥矮縮病毒(Wheat dwarf virus, WDV)，燕麥矮縮病毒(Oat dwarf virus, ODV)和大麥矮縮病毒(Barley dwarf virus, BDV)。條沙葉蟲單(Psammotettix striatus L.)為該病毒的主要介體，以持久性非增殖方式傳播。由小麥矮縮病毒引起的小麥矮縮病最早于1961年在前捷克斯洛伐克發(fā)現(xiàn)(Vacke，1961)，近年來該病毒的危害逐年加劇。目前已經(jīng)成為歐洲、非洲和亞洲等大、小麥生產(chǎn)上威脅性很大的病害之一。小麥在拔節(jié)之前受到WDV侵染會造成植株嚴重矮縮，株高通常僅為10-20cm，且植株不再增高，拔節(jié)之后，受侵染的小麥分蘗長短不一，根部產(chǎn)生許多的小分蘗，嚴重時病株在拔節(jié)前即死亡，輕病株雖能拔節(jié)，但多不抽穗，有的雖抽穗，但籽粒不實。在歐洲，小麥因該病害減產(chǎn)可高達40% -80%。2007年我國首次報道了小麥矮縮病的發(fā)生，經(jīng)過對該病害的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，小麥矮縮病害在我國的麥類產(chǎn)區(qū)分布極為普遍，在陜西、甘肅、河北、云南等12個省均有該病害的發(fā)生，而且該類病毒群體在我國還處在群體擴張時期。在陜西北部麥區(qū)已經(jīng)引起嚴重的減產(chǎn)。如2007和2008年在陜西省韓城地區(qū)該病害發(fā)病面積超過10萬畝，病株率20%以上重病田達1萬畝，正成為威脅我國西北、華北和西南麥區(qū)重要的病毒病。
[0003]小麥矮縮病毒病的傳播主要通過介體以持久循回方式傳播，即病毒介體-條沙葉蟬取食后，病毒隨著植物汁液由口針進入到腸道，病毒穿越細胞膜到達血腔后由唾液腺被傳出。近年來本實驗室采用免疫熒光標記法研究發(fā)現(xiàn)WDV在介體體內(nèi)除由中腸進入血淋巴到達唾液腺這種途徑外，濾室內(nèi)的一部分病毒還能擴散到濾室肌肉層并釋放到血淋巴，經(jīng)血淋巴到達唾液腺；由于小麥矮縮病毒由葉蟬?；詡鞑ィ荒芡ㄟ^機械磨擦接種傳毒，且病毒僅局限在韌皮部，使得抗病性及致病性等研究工作存在很大的困難。病毒的活體保存通常是將病株和介體常年飼養(yǎng)在特定的環(huán)境中，待毒源的長勢不好時，采用介體條沙葉蟬在活體植株上飼喂繼續(xù)傳毒至新苗上，周而復始。這種方法存在周期長，費時費工，同時飼養(yǎng)條件不易掌握等缺點。
[0004]中國專利“水稻黑條矮縮病毒冰凍毒源的活化方法”(ZL200910241900.4)，把帶有水稻黑條矮縮病毒的葉片冰凍保持活性再喂食介體昆蟲使其帶毒，再由介體昆蟲將水稻黑條矮縮病毒傳播給健康植株，使植物病毒冰凍毒源活化。該方法中的介體昆蟲被轉(zhuǎn)移兩次，第一次被喂食冰凍毒源，帶毒后又轉(zhuǎn)移到健康植物中使其將病毒傳播給植物；而且健康植株的種植和冰凍毒源的喂飼采用了兩個地點、空間，操作起來很不方便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述領域中的缺陷，本發(fā)明提供一種復活小麥矮縮病毒冰凍毒源的方法，該方法操作簡單，易于掌握。
[0006]—種復活小麥矮縮病毒冰凍毒源的方法，包括如下步驟:
[0007](1)取裝有土壤的種植容器，播種健康的寄主植物種子，讓土壤吸足水分；
[0008](2)將帶有矮縮病毒的葉片毒源從冰箱取出，插入吸足水分的土壤內(nèi)，并罩上頂端帶紗網(wǎng)的玻璃罩；
[0009](3)將條沙葉蟬置于玻璃罩內(nèi)，所述毒源、條沙葉蟬和寄主植物種子均全部位于玻璃罩內(nèi)，條沙葉蟬取食冰凍毒源；
[0010](4)待3-4天后寄主植物種子芽萌動露出土表，條沙葉蟬會自動取食新苗，矮縮病毒傳播到寄主植物上。
[0011]所述玻璃罩罩住整個種植容器土壤表面。
[0012]所述種植容器為底部帶孔的花盆。
[0013]所述讓土壤吸足水分的方法為將種植容器置于另一盛水容器內(nèi)。
[0014]所述步驟(3)中的條沙葉蟬被饑餓處理過。
[0015]所述寄主植物為小麥(Triticum aestivum L.)。
[0016]優(yōu)選高感品種揚麥12號。
[0017]所述小麥發(fā)芽為在22 °C光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行，16h光照、8h黑暗，光照強度為20000Lx。
[0018]所述的毒源為采自陜西韓城或山西太原病害發(fā)生地，經(jīng)PCR和血清學鑒定為陽性后，挑選癥狀明顯的小麥病葉剪成7-8cm的小段，-20°C低溫冰箱長期保存。
[0019]所述條沙葉蟬種群采自陜西韓城，常年在冬小麥幼苗上飼養(yǎng)。
[0020]本發(fā)明提供的方法是基于傳統(tǒng)生物學技術建立的，具體的實施方法是選用健康飽滿的小麥種子10-15粒左右分散播種到裝滿土的花盆中，表面覆蓋一層細土后放置到盛有清水的塑料盒中吸足水分；將毒源從冰箱取出，均勻地插到吸足水分的花盆中；然后用吸蟲器吸取一定量的無毒條沙葉蟬，放置到一端帶有紗網(wǎng)的玻璃罩中；將玻璃罩罩到插好毒源的花盆上；條沙葉蟬因沒有食物會取食冰凍毒源，冰凍毒源因插到吸足水分的土壤里而不會干掉，待3-4天后小麥芽萌動露出土表，葉蟬會自動取食新苗，從而將病毒傳播到小麥上。本發(fā)明將新苗的萌發(fā)過程與葉蟬取食帶毒的過程同時進行，且在同一個種植容器中完成，待葉蟬帶毒后不需要二次轉(zhuǎn)移，直接取食新苗，使新苗帶毒。
[0021]本發(fā)明提供的WDV冰凍毒源復活的方法，可按需將冰凍后的病毒分離物通過飼喂條沙葉蟬而重新成功地活化出來，從而為利用WDV病毒研究植物病毒致病性或介體傳播病毒以及寄主抗病性等提供簡便有效的方法。變常年多次接種為需求性接種，節(jié)省了介體飼養(yǎng)的成本；還節(jié)省了病毒活體保存所需要的光照培養(yǎng)箱的成本，同時還避免了在長期的活體保存中病毒的變異及與其它病毒的混雜；另外沒有季節(jié)依賴性，能夠滿足各個季節(jié)的需求，周年隨時可以操作。本發(fā)明方法統(tǒng)籌安排了時間和空間，節(jié)約了時間，節(jié)省了空間，操作簡單，易于掌握。
【附圖說明】
[0022]圖1.條沙葉蟬在冰凍毒源葉片上取食；
[0023]圖2.條沙葉蟬從冰凍毒源轉(zhuǎn)移至小麥幼苗上取食；
[0024]圖3.具有典型癥狀的小麥矮縮病毒發(fā)病株；
[0025]圖4.條沙葉蟬的帶毒率檢測的PCR電泳圖；
[0026]其中:M代表 DL2000 DNA Marker,從上到下依次為 2000bp, lOOObp, 750bp, 500bp，250bp, lOObp ；l-23泳道依次為條沙葉蟬的1_23號樣品。
[0027]圖5.接種小麥植株的PCR檢測的電泳圖；
[0028]其中:M代表 DL2000 DNA Marker,從上到下依次為 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp，250bp, lOObp ；1-10泳道依次為接種植株的1-10號樣品。
[0029]圖6.獲毒植株的介體傳毒檢測:左為未接種小麥健康對照，右為冰凍毒源獲毒植株經(jīng)葉蝴再傳毒發(fā)病植株。
【具體實施方式】
[0030]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。
[0031]需特別指出的是，盡管本發(fā)明是針對小麥矮縮病毒冰凍毒源的復活技術，但應用本發(fā)明對任何引起小麥矮縮病的相近株系如大麥矮縮病毒、燕麥矮縮病毒的冰凍毒源復活方法均也包括在本發(fā)明所要求的權(quán)利范圍之內(nèi)。
[0032]實施例1.植物樣品與介體材料準備
[0033]所述的小麥矮縮病毒(WDV)毒源是采自陜西韓城，山西太原等地，經(jīng)PCR和血清學鑒定為陽性后，挑選癥狀明顯的病葉剪成7-8cm的小段，-20°C低溫冰箱長期保存。傳毒介體-條沙葉蝴[Psammotettix striatus (Linnaeus)]采自陜西韓城，經(jīng)脫毒純化后在健康小麥上常年扣罩飼養(yǎng)繁殖。經(jīng)PCR檢測，該種群對本實驗室保存的活體WDV毒源的傳毒效率為70-80%。所述的介體飼養(yǎng)和作為飼料及傳毒寄主的小麥均飼養(yǎng)在22°C光照培養(yǎng)箱內(nèi)，16h光照、8h黑暗，光照強度為20000LX。每六周將葉蟬轉(zhuǎn)移到新種的幼苗上，以此方法來保存葉蟬。
[0034]實施例2.冰凍毒源的活化
[0035]挑選健康飽滿的小麥(如揚麥12號)種子10-15粒左右分散播種到裝滿