煙草26s rna內(nèi)參基因的克隆方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及煙草基因表達(dá)過程中所需的一種內(nèi)參 基因 26S RNA。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草（AYcoiiaflaiaAaciM? Z.)為前科煙草屬，含有尼古?。∟icotine)的葉用一年 生作物。人類使用煙草大約有1500年的歷史，作為煙草工業(yè)的重要原料，將葉片采收后經(jīng) 過調(diào)制、分級(jí)、加工處理，制成卷煙、雪茄煙、斗煙、嚼煙及鼻煙等，供人嗜用。煙草是經(jīng)典的 基因工程研究模式作物之一，然而，在分析煙草基因表達(dá)過程中可供選擇的內(nèi)參基因并不 多見。目前，文獻(xiàn)中報(bào)道較多的有GAPDH、EF-la，而在其他植物中廣泛使用的內(nèi)參基因，在 煙草中并未得到明確的克隆和驗(yàn)證。同時(shí)，由于內(nèi)參基因的選擇存在不通用性，即不同物種 間的內(nèi)參基因存在差異性。這就要求在煙草中使用其他植物中的內(nèi)參基因，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)要 求開展必要的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)與鑒定。隨著基因芯片技術(shù)越來越成熟，大量的基因芯片數(shù)據(jù)為 新內(nèi)參基因的挖掘提供了良好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和平臺(tái)，為內(nèi)參基因的選擇提供了更為廣闊的空 間。與傳統(tǒng)同源性比對(duì)方法所獲的內(nèi)參基因相比較，通過基因芯片表達(dá)技術(shù)篩選到的內(nèi)參 具有高量表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)的特性。
[0003] 實(shí)時(shí)焚光定量 PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR， qRT-PCR)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總 量的方法。利用qRT-PCR分析基因表達(dá)水平是現(xiàn)在分子生物學(xué)中重要的研究手段，qRT-PCR 具有定量準(zhǔn)確、靈敏度高和高通量等特點(diǎn)。在qRT-PCR中，對(duì)目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量的分析是 通過內(nèi)參基因的均一化來確定。因此，內(nèi)參基因的選擇是qRT-PCR的關(guān)鍵步驟。一個(gè)理想 的內(nèi)參基因應(yīng)該是在不同發(fā)育階段和不同組織器官中穩(wěn)定表達(dá)，且表達(dá)量不受其他外界因 素、實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件的影響。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)特別理想的內(nèi)參基因。因此，研究者必須結(jié) 合各自的實(shí)驗(yàn)條件和樣品類型來選擇合適的內(nèi)參基因。
[0004] 26S核糖體（26Sribosomal RNA)基因是常用的內(nèi)參基因，由于核糖體RNA的合成 獨(dú)立于信使RNA，其基因轉(zhuǎn)錄水平穩(wěn)定性更好，因此，26S RNA成為很多動(dòng)植物基因表達(dá)分 析中內(nèi)參基因的重要選擇對(duì)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供煙草26S RNA基因部分序列，可作為煙草內(nèi)參基因的應(yīng)用。并同時(shí)提 供克隆煙草26S RNA基因的特異性引物，建立基于SYBR Green熒光染料技術(shù)的qRT-PCR方 法，從而作為煙草26S RNA的內(nèi)參基因，為利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)煙草基因表達(dá)分析的研 究提供有用的方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種煙草26S RNA基因序列的克隆方法，通過對(duì)煙草不同生長發(fā)育時(shí)期的99個(gè)不同組 織樣本的芯片表達(dá)數(shù)據(jù)分析，篩選出在所有樣品中穩(wěn)定表達(dá)的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV)較小的組成型26S RNA基因序列，以引物對(duì)26S RNA-F/26S RNA-R進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、獲得陽性克隆，后經(jīng)質(zhì)粒測序驗(yàn)證；其中引物序列為如SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2所 不。
[0007] 所獲得的目的片段如SEQ ID NO. 3所示，大小為206bp。
[0008] 所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下：94°C預(yù)變性4 min，94°C變性30 s，56°C退火30 s， 72°C延伸40 s，共25個(gè)循環(huán)，再72°C終延伸10 min，4°C保存。
[0009] 本發(fā)明還提供一種qRT-PCR擴(kuò)增煙草26S RNA基因部分序列的方法，以26S RNA的 基因序列為基礎(chǔ)，按照qRT-PCR引物設(shè)計(jì)的原則，設(shè)計(jì)出一對(duì)熒光定量特異引物。以煙草不 同生長發(fā)育時(shí)期、不同組織器官以及不同激素處理?xiàng)l件下的20個(gè)樣本的cDNA為模板，利用 半定量PCR評(píng)估26S RNA基因表達(dá)水平的穩(wěn)定性和可靠性之后，進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR擴(kuò)增，熒光染料為SYBR Green，其中qRT-PCR的定量引物，其序列如SEQ ID NO. 4/SEQ ID NO. 5 所示。
[0010] 所述的qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：在95°C預(yù)變性10 min，先運(yùn)行40個(gè)循環(huán)再 95°C變性15 s，60°C退火30 s，然后為檢測PCR擴(kuò)增基因的特異性，在PCR反應(yīng)之后運(yùn)用溶 解曲線，擴(kuò)增溫度以0. 5°C的增幅從65°C緩慢遞增到95°C，每個(gè)增幅的時(shí)間為5 s。
[0011] 本發(fā)明的有益效果在于： 1. 本發(fā)明首次克隆到煙草26S RNA基因，其穩(wěn)定性和特異性經(jīng)由半定量PCR和實(shí)時(shí)熒 光定量PCR檢測和驗(yàn)證； 2. 26S RNA基因不僅在煙草不同組織器官、不同生長發(fā)育階段的組織中穩(wěn)定表達(dá)，而 且能夠在各種激素處理?xiàng)l件下亦穩(wěn)定表達(dá)。26S RNA基因穩(wěn)定表達(dá)的特性，為煙草不同發(fā) 育階段、不同組織器官、不同激素處理相關(guān)基因表達(dá)的定量研究提供了新的高可信度的內(nèi) 參基因； 3. 經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的用于熒光定量PCR檢測的引物亦可用于半定量PCR快 速檢測，且擴(kuò)增特異性和穩(wěn)定性良好。
【附圖說明】
[0012] 圖1 :本發(fā)明中煙草26S RNA基因擴(kuò)增的1%瓊脂糖凝膠電泳圖； 其中：M為BM2000 Marker，1為煙草26S RNA基因； 圖2 :本發(fā)明的26S RNA基因在煙草不同生長發(fā)育階段、不同組織器官中PCR擴(kuò)增的1% 瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖3 :本發(fā)明的26S RNA基因在煙草不同激素處理?xiàng)l件PCR擴(kuò)增的1%瓊脂糖凝膠電泳 圖； 圖4 :本發(fā)明中26S RNA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖； 圖5 :本發(fā)明中26S RNA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的溶解曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用 于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。
[0014] 實(shí)施例1. 一種煙草26SRNA基因的克隆 1. 1煙草總RNA提?。?取約IOOmg煙草新鮮組織，在液氮中迅速研磨成粉末，加入相應(yīng)量BB6 (每lmLBB6， 加 ΙΟμLβ -巰基乙醇，現(xiàn)用現(xiàn)配)，渦旋劇烈振蕩混勻；室溫孵育3min后，12000g離心2-5 min，小心吸取離心管中的上清至RNase-free的離心管中；向上清中加入0. 5倍體積無水乙 醇，并渦旋徹底混勻，分散沉淀，再將得到的溶液和沉淀一起加入離心柱中，以12000g離心 30s，棄掉流出液后，加50〇μL CB6，室溫12000g離心30s，棄掉流出液；向離心柱中央加入 80 μ L的DNase I工作液，室溫放置15min，重復(fù)該步驟一次，以除去基因組DNA ;加50〇μL WB6，12000g離心30s，棄掉流出液；再12000g離心2min，徹底去除殘留的乙醇，在室溫靜 置數(shù)分鐘，徹底晾干離心柱后，加5〇μL RNase-free H2O在離心柱的中央，室溫靜置lmin， 12000g離心2min，洗脫RNA。將WL原始樣品稀釋10倍或100倍后，取5μL進(jìn)行1%瓊脂糖 凝膠電泳檢測RNA樣品的完整性檢測。并取IPLRNA用微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop2000 ) 測定RNA樣品的純度和濃度值。將合格樣品置于-80°C保存待用。
[0015] 1.2 PCR擴(kuò)增引物序列 26SRNA的上游引物如SEQ ID NO. 1所示；26SRNA的下游引物如SEQ ID NO. 2所示。
[0016] 根據(jù)基因芯片表達(dá)分析所得到的在不同生長發(fā)育時(shí)期組織樣本中穩(wěn)定表達(dá)、且變 異系數(shù)較小的26S RNA基因，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)該擴(kuò)增引物，最后由北京六合華大基 因科技股份有限公司合成。
[0017] 1.3 反轉(zhuǎn)錄（RT) 以煙草總RNA為模板，在25 PL的反轉(zhuǎn)錄體系設(shè)置和反應(yīng)過程中依次加入以下試劑： 2.0 PgRNA，1.5 yL01igo(dT)Primer(20 μ mol/L)，再加 RNase-free H2O 至 14yL;7(TC 溫浴6 min后，迅速將離心管放入冰浴中，再依次加入5. 0 μL的M-MLV 5XBuffer，1.0 μL 的M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，LO μL 的 RNase inhibitor 和 4.0 μLχΙΝΤΡ Mixture，混勻后，42°C溫育 75min，加水稀釋5倍后，-20°C保存。
[0018] 1.4聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 以步驟1. 3得到的cDNA為模板，以步驟1. 2中獲得的序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 采用以下25μL反應(yīng)體系：50ng模板、WL的正、反向引物、