一種基于改良lamp法的日本血吸蟲(chóng)核酸檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于改良LAMP法的日本血吸蟲(chóng)核酸檢測(cè)試 劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血吸蟲(chóng)病是世界上第二大寄生蟲(chóng)病，是一種人畜共患的寄生蟲(chóng)病，流行于亞洲、非 洲和拉丁美洲的76個(gè)國(guó)家和地區(qū)，是世界上重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一?，F(xiàn)主要存在6種寄 生于人體的血吸蟲(chóng)，其中我國(guó)流行的血吸蟲(chóng)為日本血吸蟲(chóng)。日本血吸蟲(chóng)不僅影響個(gè)人健康， 而且影響整個(gè)血吸蟲(chóng)病流行區(qū)域的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。我國(guó)已于2004年將血吸蟲(chóng)病列為乙類(lèi)傳染 病，與傳染性非典型肺炎、艾滋病處于同等重要的防治位置。
[0003] 我國(guó)的血吸蟲(chóng)病分布在江蘇、浙江、上海、安徽、江西、湖南、湖北、四川、云南、廣 西、廣東、福建等12個(gè)?。ㄊ校┑?33個(gè)縣（市、區(qū)），共有釘螺面積148億平方米，累計(jì)感 染者達(dá)1160萬(wàn)例，受威脅人口在1億以上。經(jīng)過(guò)60年的積極防治，全國(guó)的血吸蟲(chóng)病疫情已 得到有效控制，但近年來(lái)由于生物、自然、社會(huì)經(jīng)濟(jì)、人口流動(dòng)、政策保障等因素變化較大， 一些地方呈現(xiàn)血吸蟲(chóng)病疫情擴(kuò)散蔓延的態(tài)勢(shì)，表現(xiàn)為老疫區(qū)血吸蟲(chóng)病患者增加，釘螺擴(kuò)散 明顯，新釘螺區(qū)出現(xiàn)，感染性釘螺分布范圍擴(kuò)大，部分已達(dá)血吸蟲(chóng)病傳播控制和傳播阻斷的 地區(qū)可能出現(xiàn)疫情回升，各地輸入性血吸蟲(chóng)病病例增加，說(shuō)明我國(guó)的血吸蟲(chóng)病防治工作還 任重道遠(yuǎn)。
[0004] 國(guó)家對(duì)血吸蟲(chóng)病的防治非常重視，每年針對(duì)血吸蟲(chóng)患者及疫水要進(jìn)行大量的資金 投入用于血吸蟲(chóng)的防控。
[0005] 目前用于血吸蟲(chóng)診斷的方法主要有病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷和超聲診斷等。傳統(tǒng) 病原學(xué)診斷方法是診斷血吸蟲(chóng)病最為可靠、經(jīng)典，是判斷血吸蟲(chóng)病患病與否的金標(biāo)準(zhǔn)，尤其 Kato-Katz涂片糞檢法以及毛蝴孵育法（MHT)。Kato-Katz法是從患者糞便中查找血吸蟲(chóng) 蟲(chóng)卵，較為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且疫區(qū)群眾依從性下降，且易造成漏檢。MHT法包括尼龍袋法、頂管 法、集孵法與促孵法等，該方法檢出率高于常規(guī)方法，但用時(shí)太長(zhǎng)，工作量大，且同樣存在不 能早期診斷和群眾依從性差等問(wèn)題。免疫診斷方法具有較高的敏感性以及疫區(qū)群眾的依從 性較高等優(yōu)點(diǎn)，已為廣大專(zhuān)業(yè)人員和疫區(qū)群眾所接受，并在對(duì)疫區(qū)化療對(duì)象的大規(guī)模篩查 和血清流行病學(xué)調(diào)查以及防治效果的評(píng)價(jià)等方面起到了極為重要的作用，已形成了皮試、 尾蝴膜試驗(yàn)、環(huán)卵沉淀試驗(yàn)（C0PT)、間接血凝試驗(yàn)（IHA)、多種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA) 和直接免疫檢測(cè)等方法。C0PT，對(duì)于非疫區(qū)健康人群具有較高的敏感性和較低的假陽(yáng)性率， 但對(duì)疫區(qū)的反復(fù)化療的人群其敏感性為72 %，這一方法的NPV較高（超過(guò)87 % )，而PPV較 低（32%-70%)，這一方法費(fèi)時(shí)且相對(duì)復(fù)雜，需要顯微鏡。IHA，仍是社區(qū)診斷常規(guī)的方法， 用于化療人群的篩選，與Kato-Katz法及MHT法相比，其敏感性高、簡(jiǎn)便、快速，然而在反復(fù) 化療的地區(qū)，這一方法的PPV較低（低于37% )，敏感性為69-100%，特異性為35-94%， 此外這一方法同衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)有64-84%的交叉反應(yīng)，這限制了其應(yīng)用。ELISA法包括了 Dot-ELISA，SPA-ELISA等，其敏感性從65-100%，但是大多數(shù)報(bào)道的特異性均小于60 %， ELISA的NPV較高（超過(guò)88% )，但是大多數(shù)報(bào)道的PPV非常低。血吸蟲(chóng)病的超聲診斷是 非損傷性診斷方法，操作簡(jiǎn)便，能準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)肝臟血吸蟲(chóng)病的病理改變，可評(píng)估病情的嚴(yán)重程 度。在現(xiàn)場(chǎng)短期內(nèi)可檢查大量人群，立即可獲結(jié)果，若使用標(biāo)準(zhǔn)化方法，具有可比性。但是 對(duì)于早期血吸蟲(chóng)病人無(wú)效。
[0006] 疫區(qū)每年都要進(jìn)行大規(guī)模的疫水鑒定、滅螺工作。目前，我國(guó)對(duì)疫水的鑒定工作主 要是依靠：①收集釘螺，然后在光照條件充足的情況下孵育出毛蝴鏡檢；②采用"哨鼠"的 辦法判定該水浴是否有尾蝴；③采集牛糞"糞檢"血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵。從釘螺中孵育毛蝴對(duì)釘螺的 條件要求高，如果釘螺保存不當(dāng)導(dǎo)致其體內(nèi)寄生的胞蝴死亡或者活力下降，將導(dǎo)致假陰性 的產(chǎn)生；另一方面，鏡檢毛蝴也需要一定的專(zhuān)業(yè)技術(shù)，對(duì)檢驗(yàn)人員要求較高，否則也會(huì)導(dǎo)致 漏檢等。"哨鼠"更是一種耗時(shí)長(zhǎng)且敏感性較低的檢驗(yàn)方法，該方法首選選定水域，然后讓小 白鼠在該水域水面游泳一定時(shí)間（4小時(shí)/天，共2天），游泳過(guò)的小白鼠經(jīng)過(guò)6個(gè)周左右的 培養(yǎng)以后，檢測(cè)該小白鼠是否感染血吸蟲(chóng)，從而來(lái)鑒定該水域是否疫水，"哨鼠"方法判定疫 水的工作在時(shí)間上有一種嚴(yán)重的滯后感，往往疫情已過(guò)而鑒定結(jié)果卻還沒(méi)有出來(lái)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)的引物組及其應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明首先提供了一個(gè)引物組，由序列表的序列1所示的單鏈DNA分子（F3)、序列 表的序列2所示的單鏈DNA分子（B3)、序列表的序列3所示的單鏈DNA分子（FIP)和序列 表的序列4所示的單鏈DNA分子（BIP)組成；所述引物組的功能為如下（a)或（b) : (a)鑒 定或輔助鑒定日本血吸蟲(chóng)；(b)檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有日本血吸蟲(chóng)。
[0009] 本發(fā)明還保護(hù)所述引物組在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的功能為如下（a) 或（b) :(a)鑒定或輔助鑒定日本血吸蟲(chóng)；(b)檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有日本血吸蟲(chóng)。
[0010] 含有所述引物組的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述試劑盒的功能為如下 (a)或（b) : (a)鑒定或輔助鑒定日本血吸蟲(chóng)；(b)檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有日本血吸蟲(chóng)。 [0011] 所述試劑盒中還可包括其他環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的常規(guī)試劑。
[0012] 所述試劑盒中還可包括鈣黃綠素和Bst DNA聚合酶。所述試劑盒中還可包括UNG 酶。所述試劑盒中還可包括溴酚藍(lán)。LAMP反應(yīng)目前存在的一大問(wèn)題就是其產(chǎn)物對(duì)環(huán)境的嚴(yán) 重污染，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性的發(fā)生。本發(fā)明中將UNG酶反應(yīng)體系引入傳統(tǒng)的LAMP反應(yīng)體系中， 在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行抗污染及LAMP反應(yīng)，極大降低環(huán)境污染對(duì)后續(xù)檢測(cè)的影響，最大程 度的降低了假陽(yáng)性的發(fā)生。本發(fā)明中將顯色劑鈣黃綠素與輔顯劑溴酚藍(lán)結(jié)合使用，陰陽(yáng)性 結(jié)果的視覺(jué)色差優(yōu)于目前單純使用顯色劑鈣黃綠素的視覺(jué)色差，使得結(jié)果判定更為簡(jiǎn)潔可 與巨〇
[0013] 所述試劑盒中還可包括：dNTPs、Mg離子、甜菜堿、猛離子和Bst Buffer。
[0014] 所述試劑盒具體可包括LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶和UNG酶。
[0015] 所述LAMP反應(yīng)液的制備方法（22. 5 μ L)具體可為：將3 μ L IOmmol dNTPs、0. 5 μ L 10ymol/L F3、0.5yL 10ymol/L B3、lyL 40ymol/L FIP、lyL 40ymol/L BIP、1.5yL IOOmM MgSOyK溶液、I μ L 5M甜菜堿水溶液、2. 5 μ L鈣黃綠素與氯化錳混合液（含I. 5mM 鈣黃綠素和IOOmM 111(：12;溶劑為水）、2. 5 μ L Bst Buffer、1 μ L 10 μ M溴酚藍(lán)溶液和8 μ L 雙蒸水。
[0016] 本發(fā)明還保護(hù)所述試劑盒的制備方法，包括將所述引物組中的各條引物進(jìn)行獨(dú)立 包裝的步驟。
[0017] 本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定或輔助鑒定日本血吸蟲(chóng)的方法，包括如下步驟：
[0018] (1)提取待測(cè)血吸蟲(chóng)的基因組DNA ;
[0019] (2)以步驟（1)提取的基因組DNA為模板，采用所述引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增； 如果所述引物組可以實(shí)現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)血吸蟲(chóng)為或候選為 日本血吸蟲(chóng)；如果所述引物組不能實(shí)現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)血吸 蟲(chóng)為或候選為非日本血吸蟲(chóng)。
[0020] 所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中可含有鈣黃綠素和Bst DNA聚合酶。所述環(huán)介 導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中還可含有UNG酶。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中還可含有溴 酚藍(lán)。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的初始反應(yīng)體系中，鈣黃綠素的濃度可為〇.15mM、Bst DNA聚 合酶的濃度可為0. 32U/ μ L、UNG酶的濃度可為0. 04U/ μ L、溴酸藍(lán)的濃度可為0. 4 μ M。所 述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系具體組成如下：22. 5 μ L所述LAMP反應(yīng)液、1 μ L Bst DNA聚 合酶（8U)、0. 5 μ L UNG酶（IU)和1 μ L模板。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系具體組成如 下：22. 5 μ L所述LAMP反應(yīng)液、1 μ L Bst DNA聚合酶、0· 5 μ L UNG酶和1 μ L模板。
[0021] 本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有日本血吸蟲(chóng)的方法，包括如下步驟：
[0022] (1)提取待測(cè)樣本的總DNA ;
[0023] (2)以步驟⑴提取的總DNA為模板，采用所述引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；如果 所述引物組可以實(shí)現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴(kuò)增，所述待測(cè)生物樣本含有或疑似含 有日本血吸蟲(chóng)；如果所述引物組不能實(shí)現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴(kuò)增，所述待測(cè)生 物樣本不含有或疑似不含有日本血吸蟲(chóng)。
[0024] 所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中可含有鈣黃綠素和Bst DNA聚合酶。所述環(huán)介 導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中還可含有UNG酶。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中還可含有溴 酚藍(lán)。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的初始反應(yīng)體系中，鈣黃綠素的濃度可為〇.15mM、Bst DNA聚 合酶的濃度可為0. 32U/ μ L、UNG酶的濃度可為0. 04U/ μ L、溴酸藍(lán)的濃度可為0. 4 μ M。所 述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系具體組成如下：22. 5 μ L所述LAMP反應(yīng)液、1 μ L Bst DNA聚 合酶（8U)、0. 5 μ L UNG酶（IU)和1 μ L模板。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系具體組成如 下：22. 5 μ L所述LAMP反應(yīng)液、1 μ L Bst DNA聚合酶、0· 5 μ L UNG酶和1 μ L模板。
[0025] 所述待測(cè)樣本為離體的生物樣本或水樣。所述離體的生物樣本為血液、肌肉等。所 述離體的生物樣本為家兔的離體樣本、釘螺的離體樣本等。
[0026] 以上任一所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)條件具體如下：37 °C 20min，然后 65 °C 60min〇
[0027] 以上任一所述日本血吸蟲(chóng)可為成蟲(chóng)、幼蟲(chóng)或蟲(chóng)卵。
[0028] 血吸蟲(chóng)病的核酸診斷理論上是最佳的診斷方法，它既可有效地確診血吸蟲(chóng)病患者 又可對(duì)環(huán)境中的感染因素（包括釘螺、疫水及牛糞）中是否含有血吸蟲(chóng)做出判定。
[0029] 應(yīng)用本發(fā)明提供的引物組或試劑盒檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)，具有靈敏性高、特異強(qiáng)、操作 簡(jiǎn)便快捷、用時(shí)短（I. 5h)、不依賴(lài)特殊儀器（僅需恒溫水浴鍋即可）、結(jié)果判斷簡(jiǎn)潔（只需 肉眼觀(guān)察即可）、檢測(cè)全程反應(yīng)管不開(kāi)蓋、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，非常適于在日本血吸蟲(chóng)疫源地進(jìn) 行環(huán)境評(píng)估以及在醫(yī)院進(jìn)行臨床診斷。本發(fā)明對(duì)于血吸蟲(chóng)的發(fā)生監(jiān)測(cè)和防控具有重大的應(yīng) 用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】