專利名稱：快速分離日本血吸蟲未成熟蟲卵的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及日本血吸蟲未成熟蟲卵的分離方法。
背景技術(shù)：
血吸蟲病是一種分布廣，危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病，其流行嚴(yán)重影響了人們?nèi)罕姷纳眢w健康并阻礙了疫區(qū)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。血吸蟲卵在血吸蟲病的病理損害和傳播流行方面起著重要作用，是造成組織病理損害和病原體傳播的關(guān)鍵因素，故血吸蟲病防制工作的重點(diǎn)歸根到底是如何控制蟲卵傳染源的問題。無論是控制傳染源為主的現(xiàn)場防治對策研究，還是有關(guān)血吸蟲卵的實驗室研究，均需要分離得到高純度且具有生物活性的完整血吸蟲卵。
國內(nèi)陳佩惠等所描述的提取純蟲卵的方法不僅耗費(fèi)時間長，且蟲卵純化后仍見不少的肝細(xì)胞；朱蔭昌所述的分離方法所得蟲卵較干凈，但費(fèi)時費(fèi)力，一般都要在12小時以上，而且每個高倍鏡視野下還見肝細(xì)胞；徐克繼等(徐克繼，裴曉康，樊培方.自病兔肝臟分離血吸蟲純卵的方法[J].上醫(yī)學(xué)報，1958(1)75-77)所描述的提取純蟲卵的方法，同樣耗費(fèi)時間長，且純化后蟲卵仍含有不少的肝組織碎片；國外Rodrigues所述的用低速及超聲處理的蟲卵，雖然蟲卵純化得較好，但損失較多，且活力幾乎喪失。
我們在前人研究基礎(chǔ)上進(jìn)行了反復(fù)實驗，探索出一種從感染兔肝中快速分離日本血吸蟲未成熟蟲卵的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的分離時間長、所獲蟲卵純度不高的不足，提供一種快速分離日本血吸蟲未成熟蟲卵的方法。
本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的將感染32天的動物肝臟分離并搗碎，組織勻漿先后過80目、160目、260目、320目絹篩，收集320目絹篩內(nèi)濾渣，加0.25％的胰酶在37℃下處理1h，再過260目絹篩除去較大的碎片，320目絹篩收集蟲卵；在進(jìn)行酶消化的同時收集80目篩內(nèi)殘留物再次搗碎，勻漿先后過80目、160目、260目、320目絹篩，收集各篩內(nèi)濾渣并用0.5％的胰酶在37℃下處理1h，同樣過260目絹篩除去較大的碎片，320目絹篩收集蟲卵，合并兩次收集的蟲卵，離心棄上清后于-70℃低溫冰箱中保存。
本發(fā)明的技術(shù)效果在于1、將肝臟勻漿反復(fù)過篩以除去肝組織碎片，這樣免除了傳統(tǒng)方法中自然沉淀數(shù)小時，然后反復(fù)換水，沉淀至上液澄清所耗費(fèi)的漫長時間，大大提高了工作效率。
2、加胰酶處理可將較大肝臟碎片消化成細(xì)小碎片，有助于肝細(xì)胞碎片的去除，對于提高蟲卵純度起關(guān)鍵作用。
3、收集80目篩內(nèi)殘留物再次搗碎并過篩，能將包裹于結(jié)締組織中的蟲卵充分分離出來，有效提高了蟲卵的收率。
3、由于所獲蟲卵純度高，且整個分離過程在2小時內(nèi)完成，從而所得蟲卵結(jié)構(gòu)完整且保持良好的生物活性，能滿足蟲卵抗原提取及分析等實驗室研究的基本需要。


圖1 32天未成熟蟲卵鏡檢圖(10×10倍)圖2 過320目的濾液鏡檢圖(10×10倍)具體實施方案實施例一日本血吸蟲未成熟蟲卵快速分離方法的研究采用腹部鋪片法，每只新西蘭兔感染日本血吸蟲尾蚴2000～2500條，在潔凈通風(fēng)條件下喂養(yǎng)。感染后32天以割頸動脈法處死動物，取肝臟置于消毒器皿中，快速去除膽管、血管及結(jié)締組織，用水快速洗凈血污，將肝臟剪成碎塊，加水適量，一并倒入可調(diào)式高速勻漿器內(nèi)以10000r/min快速搗碎3次，每次1分鐘、間隔3分鐘，得肝臟組織勻漿置于潔凈器皿內(nèi)。
組織勻漿先后過80目、160目、260目、320目絹篩，收集320目絹篩內(nèi)濾渣，加0.25％的胰酶(按100ml濾渣加0.25g胰酶)在37℃下處理1h，每隔10min用吸管反復(fù)吸打混勻，處理后過260目絹篩除去較大的碎片，320目絹篩收集蟲卵，用蒸餾水反復(fù)沖洗，盡量將其中肝組織碎片除去。
在進(jìn)行酶消化的同時收集80目篩內(nèi)殘留物倒入可調(diào)高速勻漿器內(nèi)再次搗碎，勻漿先后過80目、160目、260目、320目絹篩，收集各篩內(nèi)濾渣并用0.5％的胰酶(按100ml濾渣加0.5g胰酶)在37℃下處理1h，同樣過260目絹篩除去較大的碎片，320目絹篩收集蟲卵。
合并兩次收集的蟲卵，在顯微鏡(10×10倍)下觀察可見分離后的未成熟蟲卵結(jié)構(gòu)完整、背景干凈無纖維蛋白殘留物、蟲卵純度達(dá)到99％以上(參見圖1)，所獲未成熟蟲卵活力高，經(jīng)RNA提取，未發(fā)現(xiàn)有降解現(xiàn)象；鏡檢過320目絹篩后的濾液，僅見被分離出來的纖維蛋白雜物，未見殘留蟲卵(參見圖2)。
此外，采用此分離法對感染約2500條尾蚴的新西蘭兔肝實行蟲卵分離，每只可獲日本血吸蟲未成熟純卵0.4ml左右。與現(xiàn)有技術(shù)相比，蟲卵收率也大幅度提高。
將分離后的純卵分裝于潔凈的Eppendorf管中，離心后棄上清，標(biāo)記后置于-70℃低溫冰箱中保存。
權(quán)利要求
1.一種快速分離日本血吸蟲未成熟蟲卵的方法，其特征在于包括以下步驟1)動物感染后32天處死，取肝臟并快速去除膽管、血管及結(jié)締組織，將肝臟剪成碎塊后倒入可調(diào)式高速勻漿器內(nèi)，加水適量并以10000r/min快速搗碎3次，每次1分鐘、間隔3分鐘，得肝臟組織勻漿置于潔凈器皿內(nèi)。2)組織勻漿先后過80目、160目、260目、320目絹篩，收集320目絹篩內(nèi)濾渣，加0.25％的胰酶在37℃下處理1h，每隔10min用吸管反復(fù)吸打混勻，處理后過260目絹篩除去較大的碎片，320目絹篩收集蟲卵，用蒸餾水反復(fù)沖洗，盡量將其中肝組織碎片除去。3)在進(jìn)行酶消化的同時收集80目、160目篩內(nèi)殘留物倒入可調(diào)高速勻漿器內(nèi)再次搗碎，勻漿先后過80目、160目、260目、320目絹篩，收集各篩內(nèi)濾渣并用0.5％的胰酶在37℃下處理1h，每隔10min用吸管反復(fù)吸打混勻，處理后過260目絹篩除去較大的碎片，320目絹篩收集蟲卵。4)合并兩次收集的蟲卵，顯微鏡下檢查純度并保存于-70℃。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速分離日本血吸蟲未成熟蟲卵的方法，采用反復(fù)過篩和加胰酶處理相結(jié)合的技術(shù)，整個分離過程在2小時內(nèi)完成。所獲蟲卵純度達(dá)99％以上，蟲卵結(jié)構(gòu)完整且保持了良好的生物活性，能滿足抗原提取及分析等實驗室研究的基本需要。與現(xiàn)有技術(shù)相比，蟲卵收率也大幅度提高。
文檔編號C12N5/06GK101055234SQ20071003462
公開日2007年10月17日 申請日期2007年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月26日
發(fā)明者汪世平, 周松華, 何卓, 劉雪琴 申請人:汪世平, 周松華