專利名稱：：日本血吸蟲微衛(wèi)星位點(diǎn)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)和遺傳學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一類血吸蟲微衛(wèi)星DNA，及其在日本血吸蟲群體遺傳學(xué)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：SSR(SimpleSequenceRepeat)又稱微衛(wèi)星DNA，是一種新興的分子標(biāo)記，它是由2-5個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，它廣泛分布于整個(gè)真核生物基因組的不同座位上。不同個(gè)體同一座位重復(fù)單位的重復(fù)數(shù)目可能不相同，因而形成多態(tài)性，即SSR分子標(biāo)記。SSR比起RFLP和RAPD等其他的分子標(biāo)記，具有多態(tài)性高，分析簡(jiǎn)便，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化高通量篩選，成本低等優(yōu)點(diǎn)，知道了其序列后，只要合成引物，做一次PCR反應(yīng)就可得到結(jié)果，是一種理想的分子標(biāo)記，已被應(yīng)用于人類及其他物種的遺傳圖譜地建立。近年來，從日本血吸蟲全基因組中發(fā)掘微衛(wèi)星位點(diǎn)的研究越來越引起人們的重視，許多學(xué)者己經(jīng)做了大量的研究。但由于缺少日本血吸蟲全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，許多研究所采用的位點(diǎn)均是曼氏血吸蟲的微衛(wèi)星位點(diǎn)，這給研究和應(yīng)用工作帶了問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一類血吸蟲微衛(wèi)星DNA。本發(fā)明的另一目的在于提供對(duì)應(yīng)于所述的血吸蟲微衛(wèi)星DNA的引物。本發(fā)明的另一目的在于提供所述的血吸蟲微衛(wèi)星DNA在日本血吸蟲群體遺傳學(xué)中的應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸具有選自S6QIDN0:l-17任一所示的核苷酸序列。4本發(fā)明的第二方面，提供所述的多核苷酸的用途，其作為微衛(wèi)星標(biāo)志物用于血吸蟲遺傳關(guān)系的確定；血吸蟲基因的定位；血吸蟲各種或各亞種間的保守性分析；血吸蟲的進(jìn)化分析；或血吸蟲的品種或地域種群鑒定。在另一優(yōu)選例中，所述的血吸蟲是日本血吸蟲OS"cAWo:yow"7'apo"/cww)。在本發(fā)明的第三方面，提供一種特異性擴(kuò)增選自SEQIDNO:l-17任一所示的微衛(wèi)星位點(diǎn)序列(其也可擴(kuò)增存在于該相應(yīng)的微衛(wèi)星位點(diǎn)上(即與該微衛(wèi)星位點(diǎn)基因座位相同)，但簡(jiǎn)單重復(fù)序列數(shù)目與該SEQIDNO:l-17所示的微衛(wèi)星位點(diǎn)的簡(jiǎn)單重復(fù)序列數(shù)目不同(即序列的長(zhǎng)度可不同)的序列)的引物(對(duì))。在另一優(yōu)選例中，所述的引物是引物對(duì)，所述的引物對(duì)具有選自以下序列對(duì)所示的序列SEQIDNO:18和SEQIDNO:19;SEQIDNO:20和SEQIDNO:21;SEQIDNO:22禾卩SEQIDNO:23;SEQIDNO:24禾nSEQIDNO:25;SEQIDNO:26和SEQIDNO:27;SEQIDNO:28和SEQIDNO:29;SEQIDNO:30和SEQIDNO:31;SEQIDNO:32和SEQIDNO:33;SEQIDNO:34和SEQIDNO:35;SEQIDNO:36禾PSEQIDNO:37;SEQIDNO:38禾tlSEQIDNO:39;SEQIDNO:40禾卩SEQIDNO:41;SEQIDNO:42禾nSEQIDNO:43;SEQIDNO:44和SEQIDNO:45;SEQIDNO:46和SEQIDNO:47;SEQIDNO:48和SEQIDNO:49;或SEQIDNO:50禾卩SEQIDNO:51。在本發(fā)明的第四方面，提供所述的引物的用途，用于測(cè)定血吸蟲基因組中是否存在對(duì)應(yīng)于所述的微衛(wèi)星位點(diǎn)(具有與該微衛(wèi)星位點(diǎn)相同的序列，或者位于該相應(yīng)的位點(diǎn)(即與該微衛(wèi)星位點(diǎn)基因座位相同)，但簡(jiǎn)單重復(fù)序列數(shù)目與所述的微衛(wèi)星位點(diǎn)的簡(jiǎn)單重復(fù)序列數(shù)目不同(即序列的長(zhǎng)度可不同))的多核苷酸。在本發(fā)明的第五方面，提供一種確定兩種或多種樣品中血吸蟲之間的遺傳關(guān)系的方法，所述方法包括(1)以所述的微衛(wèi)星位點(diǎn)序列作為標(biāo)記；(2)用特異性擴(kuò)增(l)的微衛(wèi)星位點(diǎn)序列的引物，分別對(duì)所述兩種或多種樣品中血吸蟲的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)比較兩種或多種樣品中血吸蟲的擴(kuò)增產(chǎn)物的異同，從而確定兩種或多種樣品中血吸蟲之間的遺傳關(guān)系。在另一優(yōu)選例中，通過電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶數(shù)目和/或位置情況，擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶數(shù)目和/或位置一致性越高，表示兩種或多種血吸蟲之間的遺傳關(guān)系越近；擴(kuò)增產(chǎn)物的條目數(shù)目和/或位置差異越大，表示兩種或多種血吸蟲之間的遺傳關(guān)系越遠(yuǎn)。在本發(fā)明的第六方面，提供一種用于確定血吸蟲遺傳關(guān)系、定位血吸蟲基因、血吸蟲各種或各亞種間保守性分析、血吸蟲進(jìn)化分析或血吸蟲品種鑒定的檢測(cè)試劑盒，所述的試劑盒中含有特異性擴(kuò)增選自SEQIDNO:l-17任一所示的微衛(wèi)星位點(diǎn)序列的引物(對(duì))。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有選自下組的材料PCR擴(kuò)增試劑，電泳試劑，或序列分析軟件。在本發(fā)明的第七方面，提供一種用于遺傳分析的多核苷酸集，所述的多核苷酸集包括SEQIDNO:1-17所示的微衛(wèi)星位點(diǎn)序列。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸集作為微衛(wèi)星標(biāo)志物的集合用于血吸蟲遺傳關(guān)系的確定血吸蟲基因的定位；血吸蟲各種或各亞種間的保守性分析；血吸蟲的進(jìn)化分析；或血吸蟲的品種鑒定。在另一方面，提供一類特異性擴(kuò)增所述多核苷酸集中的微衛(wèi)星位點(diǎn)序列的引物(對(duì))。在另一優(yōu)選例中，所述的引物是引物對(duì)，所述的引物對(duì)具有選自以下序列對(duì)所示的序列SEQIDNO:18和SEQIDNO:19;SEQIDNO:20和SEQIDNO:21;SEQIDNO:22禾卩SEQIDNO:23;SEQIDNO:24禾卩SEQIDNO:25;SEQIDNO:26和SEQIDNO:27;SEQIDNO:28和SEQIDNO:29;SEQIDNO:30和SEQIDNO:31;SEQIDNO:32和SEQIDNO:33;SEQIDNO:34禾tlSEQIDNO:35;SEQIDNO:36禾卩SEQIDNO:37;SEQIDNO:38禾PSEQIDNO:39;SEQIDNO:40和SEQIDNO:41;SEQIDNO:42禾BSEQIDNO:43;SEQIDNO:44和SEQIDNO:45;SEQIDNO:46和SEQIDNO:47;SEQIDNO:48和SEQIDNO:49;或SEQIDNO:50和SEQIDNO:51。在另一方面，提供一種確定兩種或多種樣品中血吸蟲之間的遺傳關(guān)系的方法，所述方法包括(1)從所述的用于分子連鎖遺傳分析的多核苷酸集中選出一個(gè)或多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)序列作為標(biāo)記；(2)用對(duì)應(yīng)于相應(yīng)微衛(wèi)星位點(diǎn)序列的引物，分別對(duì)所述兩種或多種樣品中血吸蟲的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)比較兩種或多種樣品中血吸蟲的擴(kuò)增產(chǎn)物的異同，從而確定兩種或多種樣品中血吸蟲之間的遺傳關(guān)系。在另一方面，提供一種用于確定血吸蟲遺傳關(guān)系、定位血吸蟲基因、血吸蟲各種或各亞種間保守性分析、血吸蟲進(jìn)化分析、血吸蟲品種或地域種群鑒定的檢測(cè)試劑盒或系統(tǒng)，所述的試劑盒或系統(tǒng)中含有特異性擴(kuò)增所述多核苷酸集中一個(gè)或多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)序列的引物(對(duì))。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜。其中，M:DNA標(biāo)志物，1-96:96個(gè)武漢流行區(qū)的單個(gè)樣本在位點(diǎn)sjpn8上的的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2.雜合子樣本基因掃描映描圖。圖3.純合子樣本基因掃描映描圖。圖4.江西省流行區(qū)各樣本之間的遺傳距離。圖5.7個(gè)不同流行區(qū)(銅陵、貴池、都昌、常德、岳陽(yáng)、沙市、西昌)日本血吸蟲樣本種群間的遺傳差異(AMOVA)的分析。圖6.7個(gè)不同流行區(qū)(銅陵、貴池、都昌、常德、岳陽(yáng)、沙市、西昌)種群的UPGMA譜系圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，開發(fā)出了一類適用于對(duì)血吸蟲樣本進(jìn)行功能基因組研究、基因定位、親緣鑒定、或品種鑒定的多核苷酸集，所述的多核苷酸集中包含有多個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(微衛(wèi)星位點(diǎn)序列，SSR)，利用對(duì)應(yīng)于這些簡(jiǎn)單重復(fù)序列的特異性引物可以檢測(cè)到血吸蟲種群基因的多態(tài)性。因此，基于該多核苷酸集中的一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列可以分析血吸蟲的遺傳關(guān)系等。本發(fā)明人還基于所述簡(jiǎn)單重復(fù)序列設(shè)計(jì)了特異性的引物，所述引物擴(kuò)增效果良好，擴(kuò)增產(chǎn)物唯一。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"含有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......構(gòu)成"、"基本上由......構(gòu)成"、禾P"由......構(gòu)成"。如本文所用，所述的"簡(jiǎn)單重復(fù)序列"，"串聯(lián)重復(fù)序列"，"SSR位點(diǎn)(序列)"，"微衛(wèi)星序列"，"微衛(wèi)星位點(diǎn)"，"微衛(wèi)星DNA"可互換使用，均是指具有選自SEQIDNO:1-17任一所示的核苷酸序列。如本文所用，所述的"多核苷酸集"是一種多核苷酸的集合，其中含有SEQIDNO:l-17所示的多核苷酸。在用于遺傳分析時(shí)，可以從所述的多核苷酸選出一條或多條所述的多核苷酸，作為SSR標(biāo)記物。如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。簡(jiǎn)單重復(fù)序列如本文所用，所述的"簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)"又稱為"串聯(lián)重復(fù)序列(ShortTandemRepeats,STR),或"微衛(wèi)星DNA(MicrosatelliteDNA)"，是指一種短序列，例如一種單、二、三、四、或五-核苷酸，其在某一特定的核苷酸序列中至少重復(fù)一次。對(duì)于釆用SSR位點(diǎn)為遺傳標(biāo)記的種群遺傳學(xué)研究，選擇出合適的SSR位點(diǎn)顯得尤為重要。首先，其單元結(jié)構(gòu)要求簡(jiǎn)單，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)復(fù)雜(重復(fù)的堿基多，或者有其非重復(fù)堿基的插入)將會(huì)對(duì)后續(xù)分析帶來一定的偏差；其次，微衛(wèi)星位點(diǎn)所在的位置應(yīng)該遠(yuǎn)離基因編碼區(qū)，如果處于或接近基因編碼區(qū)，這些位點(diǎn)就可能會(huì)在種群的傳代過程中丟失，不能真實(shí)地反映群體的遺傳特征；第三，所選取的微衛(wèi)星位點(diǎn)原始序列要具有高度的特異性。此外，在被研究樣本大小的選擇上也有很高的要求，如果選取的樣本數(shù)量太小，可能會(huì)失去一些等位基因，從而給樣本之間遺傳差異的計(jì)算帶來偏差。因此，合適的SSR位點(diǎn)的選擇需要經(jīng)過大量的分析和試驗(yàn)工作。本發(fā)明所述的各SSR位點(diǎn)具有選自SEQIDNO:1-17任一所示的核苷酸序列。這些核苷酸序列的集合構(gòu)成所述的多核苷酸集。本發(fā)明所述的SSR位點(diǎn)能有效的反映出某個(gè)種群所獨(dú)有的遺傳學(xué)特征，其具有以下特征所述位點(diǎn)都為3-4個(gè)堿基的重復(fù)序列且不包含復(fù)雜結(jié)構(gòu)；所述位點(diǎn)的原始序列均為日本血吸蟲基因組特異；所述位點(diǎn)的微衛(wèi)星的重復(fù)次數(shù)在10-25次；并且，所述位點(diǎn)都處在全基因組中的位置遠(yuǎn)離編碼區(qū)。引物盡管所述的多核苷酸集中的各SSR位點(diǎn)在不同的種群中可以是不同的(即含有簡(jiǎn)單重復(fù)序列的重復(fù)數(shù)目不同)，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)這兩端的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過PCR技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴(kuò)增出來，利用測(cè)序或電泳分析等技術(shù)就可獲得其長(zhǎng)度多態(tài)性。因此，本發(fā)明提供了可用于擴(kuò)增所述的SSR位點(diǎn)的引物。所述的引物根據(jù)這些SSR位點(diǎn)兩端的保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。引物的設(shè)計(jì)方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法。通常，可以針對(duì)一個(gè)SSR位點(diǎn)，根據(jù)其兩端序列設(shè)計(jì)不同種引物，通過PCR試驗(yàn)確定最合適的引物。更特別的，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，采用相近的Tm溫度，以便使這些引物能夠在高通量的擴(kuò)增和檢測(cè)中使用。此外，確保引物擴(kuò)增的位點(diǎn)的唯一性是必要的。一般而言，18-26bp的寡核苷酸引物具有較好的特異性。采用所述的引物，可擴(kuò)增出血吸蟲(特別是日本血吸蟲)基因組中相應(yīng)的SSR位點(diǎn)。并且，釆用相同的引物對(duì)，以不同來源的血吸蟲的基因組DNA為模板，可獲得包含多態(tài)性SSR結(jié)構(gòu)(如SSR重復(fù)次數(shù)不同、或長(zhǎng)度不同等)的多核苷酸。應(yīng)用本發(fā)明的簡(jiǎn)單重復(fù)序列及其相應(yīng)的引物具有多種用途。包括但不限于用于血吸蟲遺傳關(guān)系的確定；血吸蟲基因的定位；血吸蟲各種或各亞種間的保守性分析；血吸蟲的進(jìn)化分析；或血吸蟲的品種鑒定。9血吸蟲各蟲種通過對(duì)這些日本血吸蟲SSR位點(diǎn)在其它種血吸蟲中進(jìn)行擴(kuò)增，尋找能夠在日本血吸蟲以外的其它血吸蟲中得以擴(kuò)增的位點(diǎn)。如果位點(diǎn)能夠被成功擴(kuò)增，說明這個(gè)位點(diǎn)在多種血吸蟲中共同存在，這個(gè)位點(diǎn)就能被其它血吸所利用。血吸蟲的進(jìn)化分析微衛(wèi)星標(biāo)記可以作為物種間關(guān)系研究的手段，進(jìn)行物種間的進(jìn)化分析。根據(jù)遺傳距離確定物種間的進(jìn)化關(guān)系。血吸蟲的品種鑒定利用本發(fā)明人開發(fā)的SSR標(biāo)記，對(duì)血吸蟲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，尋找每一個(gè)品種所對(duì)應(yīng)的品種特異性SSR標(biāo)記，就能夠?qū)崿F(xiàn)血吸蟲品種在形態(tài)特征結(jié)合分子標(biāo)記的前提下進(jìn)行品種鑒定。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，本發(fā)明的SSR位點(diǎn)可被應(yīng)用于進(jìn)行不同血吸蟲流行疫區(qū)之間血吸蟲種群的比較，分析各血吸蟲種群之間的遺傳差異，或在這些種群之間建立譜系關(guān)系圖?；蛘咦鳛榉肿訕?biāo)記，應(yīng)用于血吸蟲品種或地域種群鑒定。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，本發(fā)明的SSR位點(diǎn)可被應(yīng)用于流行病學(xué)上。其應(yīng)用方法例如某個(gè)區(qū)域(以前該地區(qū)并無(wú)血吸蟲病的記錄-新增疫區(qū))爆發(fā)血吸蟲病，可以隨機(jī)從感染的人體或者動(dòng)物體內(nèi)獲取日本血吸蟲成蟲樣本(組成一個(gè)新的種群)，利用本發(fā)明的微衛(wèi)星位點(diǎn)，對(duì)上述樣本進(jìn)行高通量的基因掃描，分析其遺傳學(xué)特征。再通過其與已了解的種群結(jié)構(gòu)特征的對(duì)比，判斷該新增疫區(qū)的血吸蟲種群的來源，通過切斷該來源或傳播血吸蟲的宿主(如陽(yáng)性釘螺)的遷徙路徑，從而可達(dá)到對(duì)該新增疫區(qū)日本血吸蟲病的監(jiān)測(cè)和控制的目的。遺傳分析方法在得知了本發(fā)明提供的各SSR位點(diǎn)或其對(duì)應(yīng)的特異性引物后，本領(lǐng)域人員可采用多種本領(lǐng)域已知的技術(shù)來確定血吸蟲的遺傳關(guān)系(或親緣關(guān)系)，定位血吸蟲的基因，對(duì)血吸蟲各種或各亞種間進(jìn)行保守性分析，進(jìn)行血吸蟲進(jìn)化分析，或進(jìn)行血吸蟲的品種鑒定，或血吸蟲地域種群鑒定。由于SSR位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增是特異性擴(kuò)增，其穩(wěn)定性和重現(xiàn)性都較好。檢測(cè)微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物的方法可以采用本領(lǐng)域人員熟知的技術(shù)，最常用最簡(jiǎn)便的方法是采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。通過比較擴(kuò)增條帶的數(shù)目和/或大小來確定擴(kuò)增產(chǎn)物的差異。該方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉。另一種更為精細(xì)的方法是通過測(cè)序儀的基因掃描，從而可很好地分辨出PCR產(chǎn)物大小上1-2堿基的差異?；驋呙杩舍娪帽绢I(lǐng)域人員已知的一些軟件，例如GenMapper4.0軟件。經(jīng)過大量試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)明的微衛(wèi)星位點(diǎn)能滿足高通量基因掃描的要求。檢測(cè)試劑盒或系統(tǒng)本發(fā)明還提供了一種用于確定血吸蟲遺傳關(guān)系、定位血吸蟲基因、血吸蟲各種或各亞種間保守性分析、血吸蟲進(jìn)化分析、血吸蟲品種或地域種群鑒定的檢測(cè)試劑盒或系統(tǒng)，所述的試劑盒或系統(tǒng)中含有可特異性擴(kuò)增選自SEQIDNO:1-17任一所示的微衛(wèi)星位點(diǎn)序列的引物(對(duì))。所述的引物(對(duì))也可擴(kuò)增處于SEQIDNO:l-17任一所示的微衛(wèi)星位點(diǎn)同一基因座位上且含有簡(jiǎn)單重復(fù)序列的重復(fù)數(shù)目不同的微衛(wèi)星位點(diǎn)。此外，所述的試劑盒中還含有各種分析血吸蟲遺傳關(guān)系、定位血吸蟲基因、血吸蟲各種或各亞種間保守性分析、血吸蟲進(jìn)化分析或血吸蟲品種鑒定所需的其它材料。例如可以包含選自下組的材料PCR擴(kuò)增試劑，電泳試劑，PCR產(chǎn)物純化試劑，或序列分析軟件。這些試劑均可以是本領(lǐng)域人員常規(guī)使用的。此外，所述的試劑盒中還可含有的使用說明書，以說明所述試劑盒的使用方法，給出較合適的使用條件。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果1.開發(fā)出一類適用于對(duì)血吸蟲樣本進(jìn)行功能基因組研究、基因定位或品種鑒定的微衛(wèi)星位點(diǎn)，所述的微衛(wèi)星位點(diǎn)能有效得闡明日本血吸蟲種群之間的遺傳差異。2.針對(duì)各微衛(wèi)星位點(diǎn)找到了合適的引物，所述引物擴(kuò)增效果良好，擴(kuò)增產(chǎn)物唯一。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。實(shí)施例lSSR的獲得以及引物設(shè)計(jì)1.成蟲樣本DNA的抽提采用DNA的酚抽提和乙醇沉淀法1)取單條蟲置入200pl提取緩沖液洗滌蟲體3次，2000g離心2min分離洗液；2)吸干洗滌液，加入20pl抽提緩沖液，用RNAase-free的滅菌小碾磨棒，碾磨蟲體至勻漿；3)加入提取緩沖液至終體積504)加入0.5|alRNAase(lOug/)_il),5|ilSDS(10%)，0.5pl蛋白質(zhì)消化酶，用槍反復(fù)混勻；5)在復(fù)式水浴恒溫振蕩器中110轉(zhuǎn)/分56°C消化lh;6)加入等體積50pl苯酚氯仿異丙醇為25:24:l的混合液，混勻，10000g，離心5min;7)取上清，加入50)al氯仿異丙醇為24:l的混合液，混勻，10000g，離心5min;8)取上清，加入80(il無(wú)水乙醇，混勻，-30。C過夜；9)加入1ml70%乙醇，10000g，離心15min;10)取下層溶液加入IOplddH20，待用。或釆用蛋白酶K消化法1)用200jli1GNT緩沖液洗漆蟲體3次，2000g，離心2min分離洗滌液；2)吸干洗滌液，加入20plGNT緩沖液，用一根RNAase-free的滅菌小碾磨棒，碾磨蟲體至勻漿；3)加入40plGNT緩沖液，旋轉(zhuǎn)10s;14)加入lpl蛋白酶消化酶，用移液器反復(fù)混勻，在復(fù)式水浴恒溫振蕩器中110轉(zhuǎn)/分于56'C消化lh;5)10000g，離心5min，室溫放置，轉(zhuǎn)移上清至一只干凈1.5mlEP管中；6)加入50plNID緩沖液，振蕩30s，置室溫3min;7)旋轉(zhuǎn)混合30s，95°C15min滅活蛋白酶消化酶；8)10000g,離心5min,取上清至一千凈1.5mlEP管中，待用。2.微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選及引物的獲得從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲取初始數(shù)據(jù)，并經(jīng)過如下原則的篩選a)3-4個(gè)堿基重復(fù)(例如CGG，TACC);b)各位點(diǎn)不包含復(fù)雜結(jié)構(gòu)；c)序列為日本血吸蟲基因組特異；d)微衛(wèi)星的重復(fù)次數(shù)在10-25次；e)位點(diǎn)所處的位置應(yīng)該遠(yuǎn)離編碼區(qū)；f)位點(diǎn)側(cè)翼的序列在日本血吸蟲全基因組中是單一的。本發(fā)明人針對(duì)重復(fù)單元為TAA的序列進(jìn)行了篩選，獲取50余條合格位點(diǎn)的原始序列。經(jīng)過進(jìn)一步分析、實(shí)驗(yàn)和選擇，最后獲得17條具有典型性的有效的微衛(wèi)星序列，分別命名為Sjpnl-Sjpn17,它們的序列依次如SEQIDNO:1-SEQIDNO:17所示。采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并初步PCR篩選，最終確定H對(duì)有效引物，如表1。表1日本血吸蟲17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的弓<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>所設(shè)計(jì)的引物對(duì)均通過BLAST進(jìn)行確證。以SjpnlO為例，將所設(shè)計(jì)的引物在日本血吸蟲全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)做Blast,由Blast結(jié)果可知SjpnlO位點(diǎn)位于Contig號(hào)位SJC—C00056977,位點(diǎn)序列在日本血吸蟲全基因組中具有唯一性。實(shí)施例2.以位點(diǎn)sjpnl為例的遺傳分析1.以Sjpnl序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，如下F:TGAGCACAACTGTATATCCCAAAR:TGGGCAGACATACCAGGTTC2.PCR反應(yīng)，在日本血吸蟲樣本的全基因組DNA上擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段。PCR循環(huán)條件為95°C5min;94°C45s,55°C45s，72°C45s，30個(gè)循環(huán)；72°C10min。PCR反應(yīng)體系為25ng基因組DNA，2個(gè)單位的SBSTaq聚合酶，雙向引物各10pm，1.25mMMgC12，1(il10X反應(yīng)緩沖液，0.5pidNTPs(2.5mM，TaKaRa)。3.常規(guī)方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。4.遺傳學(xué)特征分析，例如分析多個(gè)(如銅陵、貴池、都昌、常德、岳陽(yáng)、沙市、西昌)的遺傳學(xué)特征。可選擇的遺傳分析方法如下(1).對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定.通過電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶數(shù)目和/或位置情況，擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶數(shù)目和/或位置一致性越高，表示兩種血吸蟲之間的遺傳關(guān)系越近；擴(kuò)增產(chǎn)物的條目數(shù)目和/或位置差異越大，表示兩種血吸蟲之間的遺傳關(guān)系越遠(yuǎn)。(2).樣本的基因掃描PCR產(chǎn)物用ABI3730XL自動(dòng)測(cè)序儀分離，以ABIGenescan-500LIZ(AppliedBiosystems)分子內(nèi)標(biāo)測(cè)定PCR產(chǎn)物的DNA片段的確切長(zhǎng)度。并用ABI3730XL和GenMapper4.0軟件(AppliedBiosystems)進(jìn)行初始數(shù)據(jù)處理。其它位點(diǎn)的遺傳分析方法與sjpnl類似。實(shí)施例3.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的初步檢測(cè)和基因掃描1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的初步檢測(cè)在對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因掃描(Genscan)之前，對(duì)所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，確保基因掃描實(shí)驗(yàn)的成功。所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物應(yīng)有陽(yáng)性的目的條帶，并且目的條帶的帶型要單一，不得有拖帶等現(xiàn)象。圖1為武漢流行區(qū)的96個(gè)單個(gè)樣本在位點(diǎn)sjpn8上的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，每個(gè)泳道均出現(xiàn)單一目的條帶，大小約為250bp。2.GeneM叩per4.0的運(yùn)行根據(jù)不同位點(diǎn)擴(kuò)增出來PCR產(chǎn)物大小設(shè)置不同的控制面板(Panel)，并運(yùn)行GeneM叩per4.0，所述操作可參考使用說明書。3.基因型(Genetypes)由于日本血吸蟲是二倍體生物，故其單個(gè)樣本的基因型有兩種雜合子為兩個(gè)不同的等位基因；純合子僅只有一個(gè)等位基因。(i).雜合子如圖2所示三個(gè)樣本均為雜合子，每個(gè)樣本均出現(xiàn)清晰的二個(gè)等位基因的峰圖。(ii).純合子如圖3所示二個(gè)樣本均為純合子，每個(gè)樣本均出現(xiàn)清晰的單個(gè)等位基因的峰圖。由GenMapper4.0導(dǎo)出數(shù)據(jù)存為Excel格式，根據(jù)各微衛(wèi)星位點(diǎn)的基準(zhǔn)(即該微衛(wèi)星重復(fù)部分兩側(cè)的側(cè)翼序列的大小)計(jì)算出微衛(wèi)星重復(fù)部分的長(zhǎng)度大小，進(jìn)而計(jì)算出微衛(wèi)星TAA重復(fù)單元的次數(shù)。TAA重復(fù)單元的次數(shù)用于后續(xù)的遺傳學(xué)分析。實(shí)施例4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析1.等位基因個(gè)數(shù)，觀測(cè)雜合度和期望雜合度等位基因的個(gè)數(shù)(Na,Numberofallele)和觀察雜合度(Ho，Observedheterozgosity)是用于分析多態(tài)性的指標(biāo)。Na和Ho的差異范圍反映種群間的遺傳變異程度。分析了7個(gè)種群樣本，發(fā)現(xiàn)二倍體的Na為520;Ho為0.1381.000(表2)，差異較大，反映了種群間存在高水平的遺傳變異且各個(gè)位點(diǎn)上存在多個(gè)等位基因。根據(jù)各位點(diǎn)觀察雜合度的值，可以利用軟件GenAlEx6計(jì)算出各位點(diǎn)的期望雜合度He(ExpectedheterozgosityHe)，各位點(diǎn)的期望雜合度與觀察到的雜合度無(wú)顯著性差異。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注*Na:等位基因的個(gè)數(shù)；Ho:觀察雜合度；He:期望雜合度。已有報(bào)道，在曼氏血吸蟲基因組上的ll個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的觀察雜合度(Observedheterozgosity，Ho)為0.331.00，等位基因的個(gè)數(shù)為26;已有報(bào)道日本血吸蟲平均的Ho為0.050.82，平均等位基因的個(gè)數(shù)為2.7510.75。本發(fā)明采用的17個(gè)新微衛(wèi)星位點(diǎn)的Ho為0.1381.000，等位基因的個(gè)數(shù)為520，結(jié)果表明日本血吸蟲等位基因數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過曼氏血吸蟲的等位基因數(shù)，雜合度的范圍及平均的雜合度也存在一定的差異，說明這17個(gè)新微衛(wèi)星位點(diǎn)可揭示更多的遺傳變異信息，中國(guó)大陸的日本血咴蟲和曼氏血吸蟲具有明顯不同的遺傳特征。提示其原因是日本血吸蟲和曼氏血吸蟲在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中，受到不同生態(tài)環(huán)境的影響，產(chǎn)生了明顯的進(jìn)化差異。2.同一種群內(nèi)樣本之間的遺傳差異利用GenClonel.O軟件(參見Arnaud-HaondS等，GENCLONE:acomputerprogramtoanalyzegenotypicdata,testforclonalityanddescribespatialclonalorganization[J].MolEcolNotes,2007,7(1):15-17)對(duì)種群內(nèi)遺傳差異最明顯的江西都昌流行區(qū)所有樣本迸行了分析，GenClone1.0計(jì)算的是任意2個(gè)樣本間等位基因之間的差異，所以在17個(gè)位點(diǎn)之中(日本血吸蟲為二倍體生物，對(duì)應(yīng)有2個(gè)等位基因，雜合子為2個(gè)不同的等位基因，純合子為2個(gè)相同的等位基因)，任意2個(gè)樣本之間最大的遺傳距離為34。結(jié)果顯示絕大多數(shù)兩個(gè)樣本之間的遺傳距離分布在2532之間，其中遺傳距離為30的頻率高達(dá)70%(圖4)，顯示江西都昌種群內(nèi)各個(gè)樣本之間的遺傳差異明顯。其他種群內(nèi)各樣本之間的遺傳差異也較大。3.種群之間遺傳差異的分析遺傳差異的分析(AMOVA)是尸統(tǒng)計(jì)(F^:F-statistic)的一種工具，它對(duì)共顯性等位基因間的遺傳距離矩陣進(jìn)行分析，結(jié)果用來衡量在種群間的遺傳差異占整個(gè)遺傳差異的比例，從而說明種群之間遺傳差異的程度。對(duì)7個(gè)種群分析的結(jié)果顯示種群內(nèi)產(chǎn)生遺傳差異占整個(gè)遺傳差異的比例為90%，種群之間產(chǎn)生差異所占的比例較高，為10%(圖5)，證實(shí)了種群之間的差異較為明顯。其中，Permutation(置換次數(shù)—9999;Rst為O.103556(P值為0.00(X<0.05)。d.用于研究的感染的釘螺數(shù)、該流行區(qū)陽(yáng)性釘螺的感染率和有效的基因型數(shù)目及單一多位點(diǎn)基因型(MLG)數(shù)目的分析在江西都昌種群內(nèi)，其單一多位點(diǎn)基因型數(shù)目為61(雄為28，雌為33)，而采集于該流行區(qū)的釘螺數(shù)目?jī)H為ll只；而湖北沙市種群內(nèi)，其單一多位點(diǎn)基因型(MLG)數(shù)目為29(雄為15，雌為14)，而釆集于該流行區(qū)的釘螺數(shù)目卻為30只(表3)。表3感染的釘螺數(shù)，該流行區(qū)陽(yáng)性釘螺的感染率和有效的基因型數(shù)目及單-多位點(diǎn)基因型(MLG)數(shù)目<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注每個(gè)流行區(qū)都分性別進(jìn)行分析，所用到的軟件為GENALEXcf去除所有的缺失數(shù)據(jù)M又分析16個(gè)位點(diǎn)(不包括P7位點(diǎn))。上述結(jié)果提示單一多位點(diǎn)基因型(MLG)數(shù)目跟流行區(qū)陽(yáng)性釘螺的感染率相關(guān)，江西都昌流行區(qū)陽(yáng)性釘螺的感染率高達(dá)6.5%，而湖北沙市流行區(qū)陽(yáng)性釘螺的感染率卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.01%。高感染率，可能導(dǎo)致該種群內(nèi)最趨近于隨機(jī)交配的遺傳方式。e.七個(gè)流行區(qū)種群的UPGMA譜系分析UPGMA譜系圖用來闡明各種群之間的遺傳距離。7個(gè)種群的UPGMA譜系圖顯示江西都昌，安徽銅陵，湖北沙市和湖南常德為一簇，其遺傳距離在0.01780.0363間；安徽貴池和湖南岳陽(yáng)為另外一簇，其遺傳距離為0.0247;而四川西昌單獨(dú)為一簇，并且四川西昌與其他兩簇的遺傳距離在0.01920.0693間(圖6)。UPGMA譜系圖表明了各個(gè)流行區(qū)之間存在著遺傳差異，其中四川流行區(qū)和其他流行區(qū)遺傳差異尤為明顯。實(shí)施例5.七個(gè)流行區(qū)種群之間遺傳差異的解釋本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)中國(guó)大陸的7個(gè)流行區(qū)種群之間存在一定的遺傳差異，其中四川流行區(qū)種群明顯區(qū)別于其它種群。這一差異可以用地理位置和生態(tài)屏蔽來解釋。四川流行區(qū)位于三峽上游，其陽(yáng)性釘螺的遷徙及混合受到地理位置的限制，因此,可能會(huì)導(dǎo)致其種群內(nèi)某些基因不易與下游地區(qū)種群的基因雜合。相對(duì)地，其他流行區(qū)都位于湖泊區(qū)，陽(yáng)性釘螺的遷徙相對(duì)容易，其基因型就會(huì)比較豐富。此外，滅螺產(chǎn)生的選擇壓力也可能會(huì)導(dǎo)致基因型的改變。另外，中國(guó)大陸的日本血吸蟲野外樣本明顯的基因雜合性在側(cè)面證實(shí)了日本血吸蟲在基因組和轉(zhuǎn)錄組上存在基因多樣性。本發(fā)明分析了微衛(wèi)星DNA作為遺傳標(biāo)記在日本血吸蟲種群遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用，建立了一種適合于群體遺傳學(xué)研究的，簡(jiǎn)便快速的單個(gè)日本血吸蟲成蟲樣本基因組DNA抽提的方法。利用17個(gè)新的微衛(wèi)星位點(diǎn)為遺傳標(biāo)記對(duì)于7個(gè)日本血吸蟲種群的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，闡明了中國(guó)大陸日本血吸蟲具有明顯的遺傳多樣性，在中國(guó)不同流行區(qū)之間可能具有基因多態(tài)性，存在復(fù)雜的種群遺傳變異，從而為今后日本血吸蟲病的監(jiān)測(cè)和疫苗的研究提供了支持。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所，國(guó)家人類基因組南方研究中心，華東理工大學(xué)<120>H本血吸蟲微衛(wèi)星位點(diǎn)及其應(yīng)用<130>082356<160>51<70>Patentlnversion3.3<210>1<211>448<212>DNA<213>日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)<220><221>misc一feature<222>(401亍.(414)<223>nisa，c,g,ort<400>1atactgaactattttacagactcttatagtaaactatcccctgaagtacttgcatatatt60tgtttggtattcgtctccatactcttg&gcacaactgtataaacacatat120catttttgtgt3ag38ttC3ctaatttgcaagattttgaagcacatgagg180aacttattggattcaaacattaataat&&t240gtaccagcaggagcatcaatatgcacttctgaacttatcgtttatacata300agtactgtacatttccgaacctggtatgtctgcccaaagtatgcctgtacgcttgatttt360taatggtcagccctattccttatgtaatagac&ccatgcannnnnnnnnnnnnntaccgg420ggatcctctagagtcgacctgcaggcat448<210〉2<211>439<212〉隨<213>日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)<400〉2aagaaaacactctattgaaaataattaattagagaatatttgtttatcaataccgttccccctcttttttttatccatgacccaataggtt.attggattcaatttagtgttaataettaatataaataaataaata犯ttcaatatcccttcgtgttgaagtgagaattttacteictgatcgggatctgactgtctttgattcaatgtcttgttgtttactaaaataaaaagtttattctgtgsatg犯aacaagggaaa60agtgtttaatatgtcacttatcctgttcat120catttaatagtaatattcatgatactattt180aat犯taataataataataataataataaa240aatgcagtttattemaattgtttttgttgt300caatgttattgataatg犯gaattcaccgt360gatgaaat犯aagacatacactcccaagca420439<210〉3<211>柳<212〉DNA<213>日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)〈400〉3ccaaactt.atactctgtaatasttgtgtttacagacaaatgaataaagtttaatatcccc60tacatctattgggtaatcacttaggcacatgttcctctctcactctctctggcattgact120acagcg"ttcaaaatccagtgttg犯taaatccgtattattgccatagttaca犯ataatt180tatgcatgtaataatagtgstaataat膽taataataataataataataataataataat240aataataataataataataatggtctacatcctaatttttcattttgtaacagccttttt300cattcaacttctttcataatttccatUaatattgaacaacaacattaacattaactgca360taacttacaatcataattactattattactattattattattactattattattattact化0attactattattattagtagtagtattgttattactgtaa460<21。>4<211〉442<212>籠<213>日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)<化0>4caatctggttatg3C3Ctt3tcgtctctgaattaacaataaacctgaagctttgttttactttctatUtattttaaccgtgttgatsataacctcat33ataatgatagcaatcaatcaaagggcggcaUUUagttaatttatttcgaatcaaaactactgatactaacttgtgattaataataatacgaccagttgtattctggattcctactctcatgatgattastaataatacctgccaacaCg3C犯C3g3tEitatatatactaatttagaat犯tcatggtatatactacggatgcatgtcaagctccaatactactacctaataataattacaagtgcatatgtactgtttcagttcct60120180240300360420442<210>5<211>442<212〉隱<213>日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)，0〉5g犯t3ttSCtttgctgat,tattagaaatgagttcaacgataacaattacagaaeigacsctcatgaatcttgataagataaattcatatgtcacgggattacgagcaaaatt3g3t3CC3gcatcaattaaatttacttattaaaataataagaaattagagtatctttaacat犯taccgataa犯aga3taataataatcagattgacgttctttattcagaaattagtUtggtgcaatacacgtataatctaaatataat犯taatacagtactatcattttcttgasaataaaagtaaattaaccactggcacatatggacaagaagaaacsatagattcacattcgtaggcataaacgtatat犯aaatttcagtaatcaaaataaatttcatta60120180240300360420442<210>6<211>448<212〉隱<213>日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)<400>6caacattgacctttttatgaatttattactatgatttctaaataataatgcacagtatacagttggtgactg3CtUggtaacagttttgcggcgttcatctactaacagataat犯taatttaccttatcgtcaUtggttcattcttgttttactctttttttttctataataataatgttctacagcBgaatttactgttctgattacttatattgtctttctaaaataataatatgtaccaccatggttactgttctcactgcttcacttctgttcgtcaccaaagcatttataataataataatatatgttcagtcatxacttgatggtcatctgttgcaaaagtttatcgctttcgatactttaataataatctgaagaaacatcttcttggtctttcatat60120180240300360420448〈210〉7〈211>472<212>DNA<213>閂本血吸蟲(Schistosomajaponicum)<400〉7tgtattttagttatcctgtatgttgctaggttattcaaacgtaatcagtcgccagcgcct60gaattctcattcaagt犯atgctaattgggcttagtttatttgaaaacgtatcagatacc120caaagagag3gagggggaga3gaUagaccaatagtccatcggtaagtagcgcaccaast180aatggaaattactatcccaataataataatgataataataat,aataataataataataat240aataat犯taat犯taataataataataataataggaggaggaggagaaagaagaattag300tcg犯at犯acatgg"Uatcatagttttcaagggtgatacacagtaaatttgatgggtga360ggtggaggtatgtgaagttacatactgaaataatctacatgagtgtg卿gtgagat犯a420atgtctatataaaca犯aagaaatcgcaagg犯ataacactcgaacaagtta472<210〉8<211〉460<212〉DNA<213〉H本rfil吸蟲(Schistosomajaponicum)<400〉8tatgctaattttgaccgatatcaccatcaattacaaaaatatgcacgtaaagaaaagggt60aaataaatggagaaaaaaattaggcaaagaaaaagtactcacaaagattgaattttgtta120agaagtttttgtactctacataaaaataaagtgtgcattatgcacagagaataagataat180gctaatgctaatgctaatgctaat,aataataataataataataataataataataataat240aataataataataataataaat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