專利名稱：具有免疫原性的日本血吸蟲多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有免疫原性的日本血吸蟲多肽及 其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血吸蟲病是一種嚴重危害人、畜健康的寄生蟲病，其易感動物包括人、牛、羊等家 畜及野生動物，涉及40多種哺乳動物。家畜感染血吸蟲不僅給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成重大損失， 而且患病家畜還是我國人體血吸蟲病最主要的傳染源，血防形勢依然嚴峻。多年臨床實踐 證明，化療在血吸蟲病未消滅地區(qū)只能暫時地降低發(fā)病，而不能徹底阻斷傳播。國際經(jīng)驗表 明化療必須要與一種長期的輔助措施相結(jié)合才可達到預(yù)期效果。因此，研制與發(fā)展血吸蟲 疫苗是防治血吸蟲病具有戰(zhàn)略意義的輔助措施。尋找新的疫苗候選抗原仍是當今血吸蟲疫 苗研究的重點之一。血吸蟲的生長發(fā)育非常特殊復(fù)雜，它是吸蟲綱中唯一的雌雄異體蟲體，雌雄蟲合 抱是雌蟲發(fā)育成熟、產(chǎn)卵的基礎(chǔ)。抱雌溝蛋白是Gupta等人在曼氏血吸蟲中發(fā)現(xiàn)的一種在 血吸蟲雌雄蟲之間傳遞的性別特異性物質(zhì)。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所金亞美、程國 鋒、傅志強、朱建國等對日本血吸蟲抱雌溝蛋白進行了研究，首先克隆獲得日本血吸蟲抱雌 溝蛋白基因，并發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄表達的性別特異性和發(fā)育時相差異性。該抱雌溝蛋白基因為雄 蟲特異性表達基因，在日本血吸蟲尾蚴感染宿主后第14天，即雌雄蟲發(fā)育至將合抱前的雄 蟲體內(nèi)可見轉(zhuǎn)錄表達。利用RNAi技術(shù)和血吸蟲體外培養(yǎng)體系對抱雌溝蛋白的功能進行研 究，發(fā)現(xiàn)抱雌溝蛋白具有影響血吸蟲雌雄蟲合抱的功能，該研究也是國內(nèi)外首次明確某種 物質(zhì)可以影響血吸蟲雌雄蟲的合抱。噬菌體展示技術(shù)起源于1985年Smith GP等的研究，它是將外源肽或蛋白編碼基 因插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置與其融合，使外源蛋白隨噬菌體的重新組裝 而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。到目前為止，還沒有出現(xiàn)與日本血吸蟲抱雌溝蛋白相結(jié)合的受體分子作為疫苗應(yīng) 用的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有免疫原性的日本血吸蟲多肽，該多肽可 作為抗血吸蟲的疫苗候選抗原。此外，還需要提供一種具有免疫原性的日本血吸蟲多肽在制備預(yù)防血吸蟲病的疫 苗或制備治療血吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種具有免疫原性的日本血吸蟲多肽，所述多肽能 與日本血吸蟲抱雌溝蛋白相互作用，該多肽具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種編碼上述具有免疫原性的日本血吸蟲多肽的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述核苷酸序列為SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述核苷酸序列的噬菌體。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述噬菌體的宿主細胞。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種抗血吸蟲疫苗，包含上述具有免疫原性的日 本血吸蟲多肽。優(yōu)選的，所述抗血吸蟲疫苗還包含作為表達載體的噬菌體。在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述具有免疫原性的日本血吸蟲多肽產(chǎn)生的抗 體。在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述具有免疫原性的日本血吸蟲多肽在制備預(yù)防 血吸蟲病的疫苗或制備治療血吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述具有免疫原性的日本血吸蟲多肽在制備診斷 血吸蟲病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明具有免疫原性的日本血吸蟲多肽可以作為診斷抗原對血吸蟲病畜進行診 斷。在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述噬菌體在制備預(yù)防或治療血吸蟲病的疫苗中 的應(yīng)用。噬菌體既作為表達載體又作為免疫佐劑，能有效增強疫苗的免疫原性。本發(fā)明具有免疫原性的日本血吸蟲多肽，在兩次小鼠免疫保護性實驗中，使免疫 組小鼠的減蟲率與肝臟減卵率分別達到40. 53% /40. 2%和35. 31%/76. 45%，表明本發(fā)明 具有免疫原性的日本血吸蟲多肽對血吸蟲病有良好的免疫預(yù)防效果。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明。圖1是本發(fā)明實施例1日本血吸蟲成蟲可溶性抗原特異性抗體檢測結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明實施例5的OD26tlnm與噬菌體滴度的線性關(guān)系圖；圖3是本發(fā)明實施例6噬菌體克隆樣品SDS-PAGE電泳圖；圖4是本發(fā)明實施例6噬菌體克隆樣品Western blot檢測結(jié)果圖；圖5是本發(fā)明實施例7動物實驗中特異性抗體檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具 體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。本發(fā)明在日本血吸蟲成蟲噬菌體展示cDNA文庫的基礎(chǔ)上，選擇日本血吸蟲抱雌 溝蛋白作為探針，利用噬菌體展示技術(shù)篩選日本血吸蟲成蟲噬菌體展示cDNA文庫，以期篩 選到與日本血吸蟲抱雌溝蛋白相互作用的受體分子，為開發(fā)抗血吸蟲新疫苗和藥物提供候 選抗原分子。實施例1抗日本血吸蟲成蟲可溶性抗原抗體的制備1.日本血吸蟲成蟲可溶性抗原的制備1)新西蘭白兔以腹部貼片法感染2000條日本血吸蟲尾蚴，42d后剖殺，以門靜脈灌注法收集蟲體，于液氮中凍存?zhèn)溆谩?)從液氮中取出兩管日本血吸蟲蟲體，用PBS (IXPBS，PH 7. 0,0. 5Mm PMSF,0. ImM EDTA)裂解蟲體。3)利用玻璃勻漿器將蟲體磨碎，放置冰浴中超聲裂解15min，_70°C反復(fù)凍融三次。4)再冰浴超聲裂解15min。5) 12000g離心lh，收集上清為成蟲可溶性抗原(SWA)。6)用分光光度計檢測SWA的0D260和0D280值。7)計算 SWA 蛋白濃度，蛋白濃度=1. 55X0D260-0. 68X0D280o2.抗日本血吸蟲抗原抗體的制備1)免疫前取血并分離血清-20°C保存?zhèn)溆茫?)用PBS稀釋日本血吸蟲可溶性抗原，每只新西蘭白兔后肢肌肉注射血吸蟲成蟲 可溶性抗原500ug與福氏完全或不完全佐劑；3)每隔兩周免疫一次，共進行三次免疫，每次免疫后一周耳靜脈取血，用瓊脂糖擴 散實驗檢測抗體產(chǎn)生水平；4)三免兩周后，剖殺收集并分離血清，-20°C保存?zhèn)溆茫?)用日本血吸蟲成蟲可溶性抗原作為檢測抗原進行ELISA實驗，檢測抗體產(chǎn)生水 平，結(jié)果如圖1所示，在圖1中，A 免疫前血清抗體水平；B 感染后血清抗體水平。由圖1 可知，用日本血吸蟲成蟲可溶性抗原免疫后，新西蘭白兔血清中抗日本血吸蟲成蟲可溶性 抗原的抗體水平明顯高于免疫前血清抗體水平，該抗日本血吸蟲成蟲可溶性抗原抗體用于 下面免疫原性檢測實驗。實施例2日本血吸蟲成蟲(Sj44d)噬菌體展示cDNA文庫滴度測定噬菌體的滴度(效價)就是一毫升培養(yǎng)液中所含活噬菌體的數(shù)量。由于在含有特 異宿主細菌的瓊脂平板上，噬菌體產(chǎn)生肉眼可見的噬菌斑，因此能進行噬菌體的計數(shù)。但因 噬菌斑計數(shù)方法其實際效率難以接近100% ( 一般偏低，因為有少數(shù)活噬菌體可能未引起 感染)，所以為了準確地表達病毒懸液的濃度(滴度或效價)，一般不用病毒粒子的絕對數(shù) 量而是用噬菌斑形成單位(Plague-forming units，簡寫成pfu)表示。噬菌體滴度測定的 具體步驟如下1)將宿主菌BLTM03接種于50ml M9LB培養(yǎng)液中，37°C、200rpm/min振蕩培養(yǎng)使其OD6tltlnm值達到0. 5左右；2)取原始噬菌體文庫10 μ L用LB液體培養(yǎng)液按1 100比例進行梯度稀釋102、 104、106、107、108、109、IOiciUO11 ；3)取噬菌體文庫的各梯度稀釋液100 μ L加入250 μ L BLT5403 (OD600nm約為0. 5)， 混勻后37°C孵育20min ；4)再加入3. 75mL冷卻至55°C的頂層瓊脂，混勻后平鋪于含Amp+的LB固體培養(yǎng) 基上，37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 池；5)計數(shù)平板上的噬菌斑個數(shù)，噬菌體滴度(pfu/mL)=噬菌斑個數(shù)X稀釋倍 數(shù) XlOo實施例3日本血吸蟲成蟲(Sj44d)噬菌體展示cDNA文庫的篩選
以日本血吸蟲成蟲噬菌體展示cDNA文庫為基礎(chǔ)(日本血吸蟲噬菌體展示cDNA文 庫由本實驗室保存，其庫容量為4. 98X 106pfu，重組率為93. 8% )，選擇日本血吸蟲抱雌溝 蛋白作為探針，篩選日本血吸蟲成蟲噬菌體展示cDNA文庫，以期篩選到與日本血吸蟲抱雌 溝蛋白相關(guān)的受體分子，用親和淘洗方法篩選的具體步驟如下1)將純化的日本血吸蟲抱雌溝蛋白用TBS稀釋濃度為1 μ g/mL ；3)將日本血吸蟲抱雌溝蛋白稀釋液以100 μ L/孔加入ELISA板，4°C包被過夜；4)次日，傾去包被液，拍干，用TBST清洗5次，每次放于搖床振蕩IOmin ；5)用 3% BSA 每孔加入 150 μ L 37°C封閉 Ih ；6)傾去封閉液，拍干，用TBST清洗5次，每次放于搖床振蕩IOmin ；7)將原始文庫(或每輪篩選后洗脫液擴增產(chǎn)物)用TBST稀釋至噬菌體濃度為 101Qpfu/mL，每孔加入 100 μ L 37°C孵育 Ih ；6)傾去未結(jié)合的噬菌體，拍干，用TBST清洗5次，每次放于搖床振蕩lOmin。7)每孔加入200 μ L 3M尿素，放于搖床上室溫振蕩lOmin，棄去反應(yīng)液。8)每孔加入200 μ L 4M尿素，室溫孵育20min。(經(jīng)預(yù)實驗證實，另外4種洗脫液 1% SDSUOmM EDTA、5M NaCl以及2M鹽酸胍洗脫后經(jīng)原位擴增均可擴增出大量噬菌體，洗 脫效率顯著低于4M尿素)9)收集洗脫液，立刻對洗脫液進行滴度測定和擴增；10)挑取噬菌體克隆PCR鑒定克隆外源片斷的大小分布情況，以檢測噬菌體的富 集情況；11)測定擴增噬菌體滴度并按上述方法進行下一輪篩選。共進行3輪篩選。其中，洗脫液的擴增與滴度測定的步驟如下1)將宿主菌BLTM03接種于50ml M9LB培養(yǎng)液中，37°C、200rpm/min振蕩培養(yǎng)使其OD6tltlnm值達到0. 5左右；2)取洗脫液50ul加入到BLT5403中(OD6tltlnm約為0. 5)，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)；3)待菌液完全澄清后，收取擴增噬菌體液，4SOOOg低溫高速離心IOmin ；4)取擴增噬菌體液10 μ L用LB液體培養(yǎng)液按1 100比例進行梯度稀釋，按照實 施例2方法進行滴度測定用于下一輪篩選，其余加入5% 20%甘油放置-20°C保存?zhèn)溆?。?jīng)過三輪親和淘洗，特異性噬菌體得到較高程度富集(90倍)，從篩選后擴增 平板上隨機挑取陽性噬菌體克隆進行測序及生物信息學(xué)分析，最終獲得由日本血吸蟲 SJCHGC06360蛋白部分編碼序列(SEQ ID NO 1所示氨基酸序列)組成的多肽。實施例4噬菌體樣品的擴增及純化1)將宿主菌BLTM03接種于50mL M9LB培養(yǎng)液，37°C、200rpm/min振蕩培養(yǎng)使其OD600nm值為0. 5左右；2)分別加入各個克隆噬菌體液50 μ L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)待菌液完全澄清后，收取擴 增噬菌體液；3)4°C、8000g低溫高速離心lOmin，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中并加入1/6體積的 PEG/NaCl，混勻后4°C沉淀過夜；4) 40C、12000g低溫高速離心20min，棄去上清；5)用ImL噬菌體浸出液重懸沉淀，12000g低溫高速離心5min ；
6)將上清轉(zhuǎn)移至1. 5mL離心管中，再加入1/6體積的PEG/NaCl，混勻后4°C沉淀 lh；7) 40C、12000g低溫高速離心lOmin，將沉淀溶于100 μ L 1 X PBS中，4°C保存?zhèn)溆?。實施?噬菌體克隆的滴度測定1)取純化的噬菌體克隆10 μ L用LB液體培養(yǎng)基按1 100比例進行梯度稀釋，按 照實施例2的方法進行噬菌體滴度測定。2)同時取該噬菌體的各梯度稀釋液，紫外分光光度計檢測各噬菌體梯度稀釋后的 OD260nm、OD280nm 禾B OD32Onm 值03)以所采用噬菌體克隆的各稀釋度噬菌體液的0D26(tam、OD280nm或OD32tlnm值為橫坐 標，以噬菌體的滴度為縱坐標，分析噬菌體的實測滴度和紫外吸收值之間的線性關(guān)系，建立 初步測定噬菌體滴度的線性關(guān)系圖。圖2為OD26tlnm與噬菌體滴度的線性關(guān)系圖。4)根據(jù)建立的線性關(guān)系圖計算噬菌體克隆的滴度。實施例6噬菌體克隆的免疫原性檢測1) SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖3所示，在圖3中，M 標志蛋白；1 空噬菌體載體；2 SJCHGC06360部分氨基酸序列(SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的多肽)的噬菌體克隆，該噬 菌體克隆表達的融合蛋白如箭頭所指的蛋白條帶。2)轉(zhuǎn)移電泳剪與膠塊同樣大小硝酸纖維素膜和六層濾紙，并將硝酸纖維素膜放 入緩沖液中侵泡，濾紙放入去離子水中侵泡；打開盒子，正極向下，按順序依次疊加放置三 層濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠、三層濾紙；將盒子放在模子里，加生物冰，在槽中加滿轉(zhuǎn)移緩 沖液，180mA，轉(zhuǎn)移2 汕；3)電泳轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)移至考馬司亮藍染液中染色，以檢查蛋白質(zhì)是否轉(zhuǎn) 移完全；4)將轉(zhuǎn)移好的硝酸纖維素膜放入3%牛血清白蛋白中4°C封閉過夜；5)棄去封閉液，用TBST洗三次，每次放于搖床振蕩5min ；6)加入1 200稀釋的抗日本血吸蟲成蟲可溶性抗原抗體作為一抗，室溫孵育 lh；7) TBST洗三次，每次放于搖床振蕩5min ；8)加入1 2000稀釋的HRP標記的羊抗兔抗體，室溫孵育Ih ；9) TBST洗三次，每次放于搖床振蕩5min ；10)把濾膜放入沉淀性TMB底物顯色液中顯色，室溫下輕搖，蛋白條帶的顏色深度 達到要求后，立即用水略為漂洗，然后將濾膜轉(zhuǎn)移到TBS溶液中，拍照、記錄實驗結(jié)果。噬菌體克隆Wfestern blot檢測結(jié)果如圖4所示，在圖4中，M 標志蛋白；1 空噬 菌體載體；2 :SJCHGC06360部分氨基酸序列(SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的多肽)的噬菌 體克隆。由圖4可知，SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的噬菌體克隆具有免疫原性。實施例7噬菌體克隆的免疫保護性實驗1.動物免疫實驗1)購買BalB/C鼠，隨機分組，每組10只。2)用日本血吸蟲抱雌溝蛋白篩選日本血吸蟲成蟲噬菌體展示文庫獲得的 SJCHGC06360部分氨基酸序列噬菌體克隆進行免疫保護試驗，同時設(shè)空白對照組。
3)按表分別將各組噬菌體克隆PBS稀釋，與206佐劑按照450 μ L 550 μ L比例 混勻，并使每組的樣品總量為1. lmL。4)每只BalB/C鼠0. ImL背部皮下三點注射，每只小鼠注射的噬菌體量為1013pfu。5)每隔兩周免疫一次，共進行三次免疫，免疫前和三免一周后分別尾靜脈采血，分 離血清-20°C保存。6)三免兩周后，以每鼠30條尾蚴腹部皮膚貼片攻擊感染。7) 42d后摘眼球取血，肝門靜脈灌注沖蟲，計數(shù)蟲體數(shù)目，收集肝臟和糞便。8)分別分離收集血液的血清，_20°C保存?zhèn)溆谩?.計數(shù)減蟲率統(tǒng)計各組蟲體數(shù)目，計數(shù)減蟲率(減蟲率=對照組蟲體數(shù)目-實驗組蟲體數(shù)目/ 對照組蟲體數(shù)目)。結(jié)果如下表1所示，從表1的統(tǒng)計數(shù)據(jù)可知，在兩次動物實驗中，與空白對照組相 比，SJCHGC06360部分氨基酸序列(SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的多肽)的噬菌體克隆的 減蟲率分別達到40. 53%和40. 2% ο表1免疫實驗中各組的減蟲率動物實驗蟲體數(shù)免疫原動物數(shù)平均蟲體數(shù)減蟲率(％)第一次912. 7±7. 31PBS+206 佐劑第二次，1028. 1 ±8.12SJCHGC06360部分氨基酸序列第一次107. 6±3. 9840. 53噬菌體克隆第二次1016. 8±5.640.23.肝臟蟲卵計數(shù)1)分別稱取每組每只BalB/C鼠肝臟的重量；2)將每只肝臟加入5mL PBS，勻質(zhì)機充分勻漿；3)再加入 5mL 10% Na0H，56°C消化 1. 5h ；4)將消化好的肝臟勻漿充分混勻，每組適度稀釋充分混勻，解剖鏡下計數(shù)肝臟蟲 卵數(shù)，每只三次重復(fù)；5)計算肝臟平均卵荷數(shù)(EPG)，肝臟平均卵荷數(shù)EPG =每次鏡檢體積的肝臟平均 蟲卵數(shù)目X肝臟總體積/肝臟總重量，并計算每組的肝臟減卵率(肝臟減卵率=對照組肝 臟EPG-實驗組肝臟EPG/對照組肝臟EPG)。結(jié)果如下表2所示，從表2的統(tǒng)計數(shù)據(jù)可知，在兩次動物實驗中，與空白對照組相 比，SJCHGC06360部分氨基酸序列(SEQID NO :1所示氨基酸序列的多肽)的噬菌體克隆的 肝臟減卵率分別達到35. 31%和76. 45%。表2免疫實驗中各組的肝臟減卵率
權(quán)利要求
1.一種具有免疫原性的日本血吸蟲多肽，其特征在于，所述多肽能與日本血吸蟲抱雌 溝蛋白相互作用，該多肽具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述的具有免疫原性的日本血吸蟲多肽的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列為SEQID N0:2所 示的核苷酸序列。
4.一種包含權(quán)利要求2所述核苷酸序列的噬菌體。
5.一種包含權(quán)利要求4所述噬菌體的宿主細胞。
6.一種抗血吸蟲疫苗，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的具有免疫原性的日本血吸 蟲多肽。
7.權(quán)利要求1所述的具有免疫原性的日本血吸蟲多肽產(chǎn)生的抗體。
8.權(quán)利要求1所述的具有免疫原性的日本血吸蟲多肽在制備預(yù)防血吸蟲病的疫苗或 制備治療血吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的具有免疫原性的日本血吸蟲多肽在制備診斷血吸蟲病的產(chǎn)品中 的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求4所述的噬菌體在制備預(yù)防或治療血吸蟲病的疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種具有免疫原性的日本血吸蟲多肽，所述多肽能與日本血吸蟲抱雌溝蛋白相互作用，該多肽具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了該具有免疫原性的日本血吸蟲多肽在制備預(yù)防血吸蟲病的疫苗或制備治療血吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的具有免疫原性的日本血吸蟲多肽，對血吸蟲病有良好的免疫預(yù)防效果，適于成為抗血吸蟲的新疫苗。
文檔編號C12R1/92GK102040658SQ20091020169
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月19日
發(fā)明者何金桃, 劉金明, 吳啟進, 林矯矯, 石耀軍, 鄒翔, 金亞美 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所