專利名稱：：大腸桿菌熱敏性腸毒素雙突變體作為疫苗黏膜免疫佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，本發(fā)明涉及大腸桿菌熱敏性腸毒素雙突變體，其編碼基因，含有該基因的載體或細胞，含有該蛋白的佐劑組合物，以及該蛋白的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：黏膜免疫是機體免疫防御體系中重要的一環(huán)，通過黏膜進行免疫預防不僅能誘導黏膜部位產(chǎn)生免疫抗體，還可刺激全身性的免疫應(yīng)答，因此黏膜免疫接種是預防呼吸道、消化道系統(tǒng)疾病的最佳免疫途徑。但由于許多疫苗在黏膜接種時誘導產(chǎn)生的抗體水平低，不能產(chǎn)生足夠的免疫保護，因此需要合適的黏膜佐劑配合，才能誘導出具較高水平的黏膜IgA抗體。目前研究的黏膜免疫佐劑有很多種，其中由細菌代謝產(chǎn)物，熱敏性腸毒素和霍亂菌毒素作為疫苗黏膜免疫佐劑的研究尤為令人關(guān)注。Enterotoxic^yc/er/c力/acoh'(ETEC)所產(chǎn)生的熱敏性腸毒素(heat-labileenterotoxin，LT)是引起人及哺乳動物腹瀉的毒素之一，由1個A亞基和5個B亞基所組成。B亞基主要可調(diào)控LT與細胞膜上的GM1結(jié)合，A亞基具有ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性，是主要的毒力因子。完整的LTA亞基可被胰酶裂解為A1和A2，A2位于A1的C末端，二者以二硫鍵相連，其中A1是毒性部位，A2與LTB亞基相連。進入耙細胞后，二硫鍵被還原，LT表現(xiàn)出毒性。許多研究表明，LT是一種有潛力的黏膜免疫佐劑，但由于LT具有很強的毒性而限制了其在臨床上的應(yīng)用。目前人們正試圖通過定點突變技術(shù)，達到降低LT毒性、同時又保留其佐劑功能的目的。研究發(fā)現(xiàn)與LT的毒性相關(guān)的位點主要集中在A亞基上，通過改變氨基酸位點可達到降低LT毒性的目的。很多位點的突變都會影響其ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性，比較常見的有第7、44、49、50、63、72、110、112、146等位點的突變體，這些突變體分別表現(xiàn)出不同程度的殘余毒性和不同程度的佐劑活性，結(jié)論不一?，F(xiàn)有技術(shù)中的LT突變體研究主要集中在單一位點突變體構(gòu)建上，而單一位點突變體毒性可能沒有完全喪失，并且出現(xiàn)回復突變而重新獲得毒力的機率較大。而構(gòu)建多位點的LT突變體，理論上其回復突變的可能性就會降低，然而多位點的突變是否會影響LT作為黏膜免疫佐劑的活性還未可知，且還需要尋找合適的多突變位置組合，以使LT在毒性降到最低的情況下發(fā)揮盡可能強的免疫佐劑活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種毒性低、免疫佐劑活性優(yōu)異的大腸桿菌熱敏性腸毒素雙突變體，其編碼基因，含有該基因的載體或細胞，含有該蛋白的佐劑組合物，以及該蛋白的生產(chǎn)方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白，所述的蛋白包括大腸桿菌熱敏性腸毒素蛋白的A亞基和B亞基，且該A亞基的氨基酸序列相對于野生型大腸桿菌熱敏性腸毒素的A亞基的氨基酸序列，其第63位為K，且第192位為G;其第72位為R,且第192位為G;或其第63位為K，第72位為R，且第192位為G。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白含有1個大腸桿菌熱敏性腸毒素蛋白的A亞基，和5個大腸桿菌熱敏性腸毒素蛋白的B亞基。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白基本上由大腸桿菌熱敏性腸毒素A亞基和B亞基構(gòu)成。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白基本上由1個A亞基和5個B亞基復合而成。在本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的核酸，所述的核酸編碼所述的蛋白。在本發(fā)明的第三方面，提供一種載體，所述的載體含有所述的核酸。在本發(fā)明的第四方面，提供一種細胞，所述的細胞內(nèi)含有所述的載體，或其基因組中整合有所述的核酸。在本發(fā)明的第五方面，提供一種生產(chǎn)所述的蛋白的方法，包括在適于表達的條件下，培養(yǎng)所述的細胞，從而表達所述的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括(1)在細胞內(nèi)表達大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白的A亞基和B亞基；(2)收集(l)的細胞，用變性劑重懸后將細胞破碎；(3)將(2)的細胞破碎產(chǎn)物混勻，離心收集上清；(4)從(3)獲得的上清中分離含有A亞基與B亞基的蛋白，復性，獲得所需蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的變性劑是NTAO。在另一優(yōu)選例中，所述的NTAO含有Tris-HCl,NaCl，和甘油。在另一優(yōu)選例中，所述的NTAO的配方是20mmol/LTris-HCl,0.5mol/LNaCl，10%甘油。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞是大腸桿菌細胞。在本發(fā)明的第六方面，提供所述的蛋白的用途，用于制備黏膜免疫的佐劑。在本發(fā)明的第七方面，提供一種用于黏膜免疫的組合物，所述的組合物含有:有效量的所述的蛋白，作為黏膜免疫的佐劑。在另一優(yōu)選例中，含有所述的蛋白的有效量為0.0001-20wty。(更佳的為0.001-10wt%)。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物中還含有有效量(如0.0001-20wt%:更佳的為O.001-10wt%)的黏膜免疫的疫苗。圖1顯示了pET30a-LTK63/G192的瓊脂糖凝膠電泳分析。其中，1:LTK63/G192I;2:LTK63/G192II;3:PCR擴增LTK63/G192基因；4:DL2000;5:重組質(zhì)粒雙酶切鑒定；6:pET30a-LTK63/G192重組質(zhì)粒PCR鑒定。圖2顯示了pET30a-LTR72/G192的瓊脂糖凝膠電泳分析。其中，1:LTR72/G192I;2:LTR72/G192II;3:LTR72/G192;4:PCR擴增LTR72/G192基因；5:重組質(zhì)粒雙酶切鑒定；6:DL2000。圖3A顯示了LTK63/G192誘導表達。其中，1:誘導后；2:誘導前；3:蛋白marker。圖3B顯示了LTK63/G192蛋白純化。其中，1:蛋白marker;2:LTK63/G192蛋白純化后；3:雜蛋白。圖3C顯示了Western-Blot檢測。其中，1:LTK63/G192;2:LTR72/G192;3:蛋白marker0圖4顯示了LT和LT各突變體的Patent-mouse活體毒性檢測結(jié)果。PBS組的G/C(腸重/尸重)值為0.071±0.0057;LT，0.101±0.0035;LTK63，0.073±0.0057;LTR72，0.081±0.0084;LTG192，0.091±0.0053，LTK63/R72，0.075±0.0031;LTK63/G192,0.080±0.0027;LTR72/G192，0.081±0.0027誤差是土sn=5。圖5顯示了ELISA檢測抗體水平的結(jié)果。圖5A顯示了血清Anti-NDVIgG檢測；圖5B顯示了鼻洗液Anti-NDVIgA檢測；其中，a:NDV;b:NDV+LT;c:NDV+LTK63;d:NDV+LTR72;e:NDV+LTG192;f:NDV+LTK63/G192;g:NDV+LTR72/G192;h:NDV+LTK63/R72。"口"第0天采樣；"B"第11天采樣；圓第25天采樣；S第35天采樣。具體實施例方式本發(fā)明人在研究中意外地發(fā)現(xiàn)，將大腸桿菌熱敏性腸毒素第63位突變?yōu)镵且第192位突變?yōu)镚(LTK63/G192)，或者將大腸桿菌熱敏性腸毒素第72位突變?yōu)镽且第192位突變?yōu)镚(LTR72/G192)后，獲得的大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體的毒性顯著降低，且具有優(yōu)異的免疫佐劑活性。此外，由于對大腸桿菌熱敏性腸毒素進行了雙位點突變，獲得的突變體不易發(fā)生回復突變，作為佐劑效果更穩(wěn)定。本發(fā)明人設(shè)計了多種針對大腸桿菌熱敏性腸毒素蛋白A亞基的單位點突變或多位點突變形式，并對這些突變方式進行了深入的研究。經(jīng)毒性分析和酶活性試驗，對各突變體的生物學活性進行了檢測，證實LTK63/G192和LTR72/G192這兩個突變體毒性顯著降低，且黏膜佐劑活性優(yōu)異，與無關(guān)抗原經(jīng)滴鼻途徑免疫接種小鼠，證實可顯著提高血清抗體和局部分泌型抗體，因此突變體LTK63/G192、LTR72/G192可開發(fā)為動物疫苗的黏膜佐劑。在本發(fā)明中，除非另外說明，術(shù)語"大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白"、"大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體多肽"、"大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體"，"大腸桿菌不耐熱腸毒素雙突變體"或"LT突變體"可互換使用，都指具有對應(yīng)于野生型大腸桿菌熱敏性腸毒素的氨基酸序列而言，第63位突變?yōu)镵，第192位突變?yōu)镚的序列；或?qū)?yīng)于野生型大腸桿菌熱敏性腸毒素的氨基酸序列而言，第72位突變?yōu)镽，第192位突變?yōu)镚的序列的蛋白；或者是對應(yīng)于野生型大腸桿菌熱敏性腸毒素的氨基酸序列而言，第63位突變?yōu)镵,第72位突變?yōu)镽且第192位突變?yōu)镚的序列。當然，一些非活性相關(guān)位點上還可發(fā)生氨基酸的等同替換，例如某些氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換。如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，"大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白或多肽"是指大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化該蛋白。本發(fā)明的蛋白可使用重組技術(shù)，從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母)中產(chǎn)生。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白包括A亞基，且該亞基的氨基酸序列相對于SEQIDNO:2所示的序列(其編碼序列如SEQIDNO:1)，其第63位為K，且第192位為G;或其第72位為R，且第192位為G。作為更優(yōu)選的方式，所述的大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白還包括B亞基(SEQIDNO:4，其編碼序列如SEQIDNO:3)。更佳地，所述的蛋白基本上由大腸桿菌熱敏性腸毒素A亞基和B亞基構(gòu)成。最佳的，所述的蛋白基本上由1個A亞基和5個B亞基復合而成，這種結(jié)構(gòu)的蛋白具有更理想的免疫佐劑效果。將突變引入到野生型大腸桿菌熱敏性腸毒素蛋白序列中的方法是本領(lǐng)域人員已知的。例如，通過設(shè)計含突變位點的引物來PCR擴增野生型的大腸桿菌熱敏性腸毒素蛋白的編碼序列，從擴增產(chǎn)物中篩選出被引入突變的基因產(chǎn)物，利用該基因產(chǎn)物生成突變型的蛋白。此外，也可利用人工合成的方式合成序列中含有突變位點的蛋白。本發(fā)明還包括編碼所述蛋白的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。術(shù)語"編碼蛋白的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。本發(fā)明的大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)編碼所述蛋白的多核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的多核苷酸。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或本發(fā)明蛋白的編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science,1984;224:1431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列來表達或生產(chǎn)重組的大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，所述的大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白在大腸桿菌中表達，由于大腸桿菌熱敏性腸毒素本身來源于大腸桿菌，因此利用大腸桿菌進行表達所獲得的蛋白活性良好。在本發(fā)明的較佳實例中，對本發(fā)明的突變體蛋白的表達進行了改進，從而獲得與天然狀態(tài)下的LT蛋白A亞基和B亞基的比例以及空間結(jié)構(gòu)基本相同的LT突變體蛋白。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，A亞基和B亞基同時在細菌內(nèi)被表達后，A亞基基本形成包涵體，B亞基由于較小，一部分形成包涵體，另一部分表達為可溶形式。為保證A、B亞基不被分離或比例失調(diào)，故選擇離心所得的細菌沉淀直接使用變性劑(優(yōu)選NTAO)重懸，充分攪拌后離心收集上清。這樣A亞基和B亞基仍然在一起，且不打亂A亞基和B亞基之間的比例；復性后，大腸桿菌不耐熱腸毒素結(jié)構(gòu)不被破壞。而如根據(jù)現(xiàn)有常規(guī)的操作，在離心獲得細胞沉淀后，先進行破菌處理再用變性劑處理包涵體，則將使得大部分B亞基被去除，從而使得后續(xù)獲得的蛋白構(gòu)型與天然狀態(tài)不同。本發(fā)明中，所述的多核苷酸序列可插入到表達載體中。術(shù)語"表達載體"指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、酵母質(zhì)?；蚱渌d體。只要能在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明的多核苷酸序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的重組表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間?？衫闷湮锢淼?、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。在本發(fā)明的較佳實例中，本發(fā)明人利用重疊延伸PCR擴增技術(shù)體外獲得大腸桿菌不耐熱腸毒素雙突變體LTK63/G192和LTR72/G192全基因片段，酶切和測序結(jié)果表明構(gòu)建的表達載體pET30a-LTK63/G192、pET30a-LTR72/G192閱讀框架正確，且相應(yīng)位點氨基酸獲得了替換。誘導表達產(chǎn)物用SDS-PAGE檢測，各個突變體均表達出約33.0Ku和13.OKu的兩個蛋白帶，與LTA、LTB亞基分子量相吻合；Western-blot檢測，兩個蛋白帶均可與抗His抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性試驗分析，兩個突變體蛋白酶活性均低于野生型LT蛋白，但仍保留一些酶活性。Patent-mouse毒性試驗檢測，LTK63/G192和LTR72/G192突變體蛋白的毒性均很低。用該兩個蛋白作為NDV的佐劑經(jīng)滴鼻途徑免疫小鼠，結(jié)果顯示LTK63/G192和LTR72/G192均有較高的佐劑活性。本發(fā)明還提供了所述的大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白的用途，用于制備黏膜免疫的佐劑，其具有性能穩(wěn)定，可誘導機體產(chǎn)生高的抗體水平，且毒性低的特點。在所述的大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體中，B亞基由于可調(diào)控LT與細胞膜上的GM1結(jié)合，從而具有免疫佐劑的活性，然而因B亞基本身分子量小，單獨用于作為佐劑，在進入體內(nèi)后易于導致免疫原性降低或消失，效果不理想，而B亞基與降低毒性的A亞基的組合用于作為免疫佐劑具有良好的活性，免疫原性高。因此，本發(fā)明還提供了一種用于黏膜免疫的組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。本發(fā)明的組合物可以被制成適合于黏膜給藥的任何形式。大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白在組合物中的含量例如可以是0.0001-20wt%;更佳的為0.001-10wt%。使用該組合物時，是將安全有效量的大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約l微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約l微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥方式，受試者身體狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。此外，所述的組合物中還含有有效量的疫苗，其在組合物中的含量例如0.0001-20wt%;更佳的為0.001-10wt《。從而在本發(fā)明的大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白的輔佐下，產(chǎn)生良好的疫苗免疫效果。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于-(1)證實了LTK63/G192和LTR72/G192這兩個突變體毒性顯著降低，且黏膜佐劑活性優(yōu)異，明顯優(yōu)于LTK63/G72。(2)對LT突變體的表達工藝進行了優(yōu)化，從而獲得的蛋白更接近于其天然的存在方式，具有良好的活性。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。材料與方法1.菌株與質(zhì)粒菌株與質(zhì)粒以P1/P2為引物，以產(chǎn)生大腸桿菌熱敏性腸毒素的大腸桿菌為模板，PCR擴增獲得野生LT基因，用7^0/和^//酶切后連接入經(jīng)過相同酶切的pET30a(Novagen)中，獲得質(zhì)粒pET30a-LT。菌株采用常規(guī)的大腸桿菌DH5a,BL21(DE3)。2.實驗動物68周齡昆明系雌性小白鼠由復旦大學醫(yī)學院實驗動物部提供，雞新城疫低毒力活疫苗(Lasota)購自上海松江生物藥品有限公司。3.突變體表達載體構(gòu)建(1)引物設(shè)計參考已登錄LT全基因序列，設(shè)計引物對P1/P2，用于擴增LT全基因，引物兩端分別添加^"/和^//限制性酶切位點(框線部分表示)和保護堿基；以其第63氨基酸位點為中心設(shè)計引物P3/P4，使其第63位氨基酸密碼子由Ser密碼子TCT轉(zhuǎn)換為Lys密碼子AAA(下劃線表示)；以LT的第72位氨基酸為中心的核苷酸序列為依據(jù)設(shè)計突變引物對P5/P6，將72位GCA替換為CGT(下劃線表示)；以LT的第192位氨基酸為中心的核苷酸序列為依據(jù)設(shè)計P7/P8突變引物對，將192位AGA替換為GGA(下劃線表示)，引物由上海生工合成。Pl:P2:P3:P4:P5:P610);5'-AGpCATGG^CAATGGCGACAGATTATACC-3'(SEQIDNO:5);5'-AC^TCGAC|GTTTTTCATACTGATTGCCGC-3'(SEQIDNO:6);5'-CGGATATGTTTCCACTAAACTTAGTTTGAGAAGTGCTC-3'(SEQIDN0:7);5'-GAGCACTTCTCAAACTAAGTTTAGTGGAAACATATCCG-(SEQIDN0:8);5'-GAGAAGTGCTCACTTACGTGGACAGTCTATATTATCAGG-3'(SEQIDNO:9);5'-CCTGATAATATAGACTGTCCACGTAAGTGAGCACTTCTC-3'(SEQIDNO:P7:5'-GGTTGTGGAAATTCATCAQGAACAATCACAGGTGATACTTG-3'(SEQIDNO:11);P8:5'-CAAGTATCACCTGTGATTGTTCgTGATGAATTTCCACAACC-3(SEQIDNO:12)。(2)LTK63突變基因表達載體構(gòu)建a.突變體基因片段I和II的制備在100)al反應(yīng)體系中加入dNTPs、Exra《、IOX緩沖液、相應(yīng)引物對、無菌水、模板pET30a-LT。其中LTK63基因片段I擴增所用引物對為P1/P4，片段II擴增所用引物對為P2/P3。反應(yīng)條件完畢，回收PCR產(chǎn)物。b.突變體LTK63基因的制備取a.中PCR產(chǎn)物混合，加入dNTPs、Ex&《、IOX緩沖液、無菌水先進行8個PCR循環(huán)，再加dNTPs、ExTfl《、IOX緩沖液、無菌水及引物對P1/P2進行新PCR循環(huán)，反應(yīng)完畢，回收PCR產(chǎn)物。c.表達載體構(gòu)建及重組質(zhì)粒的鑒定上述PCR產(chǎn)物和pET30a分別用iVcoI和^/I進行雙酶切，割膠回收，以適當摩爾比加入DNALigationKit連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a。挑克隆提取質(zhì)粒，作PCR和酶切鑒定。陽性重組質(zhì)粒測序，驗證讀碼框及突變位點是否正確。(3)LTR72突變基因表達載體構(gòu)建片段I擴增所用引物對為P1/P5，片段II擴增所用引物對為P2/P6，其余操作如LTK63突變基因表達載體構(gòu)建。(4)LTK63/G192突變基因表達載體構(gòu)建a.突變體基因片段I和II的制備在反應(yīng)體系中加入dNTPs、Ex7^<7、IOX緩沖液、相應(yīng)引物對、無菌水、模板pET30a-LTK63。其中LTK63/G192基因片段I擴增所用引物對為Pl/P8，片段II擴增所用引物對為P2/P7。反應(yīng)完畢，回收PCR產(chǎn)物。b.第63位和192突變基因(LTK63/G192)的制備取前述獲得的PCR產(chǎn)物混合，加入dNTPs、Ex10X緩沖液、無菌水先進行8個PCR循環(huán)，再加dNTPs、Ex7^、10X緩沖液、無菌水及引物對P1/P2進行新PCR循環(huán)，反應(yīng)完畢，回收PCR產(chǎn)物。c.表達載體構(gòu)建及重組質(zhì)粒的鑒定上述PCR產(chǎn)物和pET30a分別用yVcoI和進行雙酶切，割膠回收，加入常規(guī)的DNA連接試劑盒連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。挑取單克隆并提取質(zhì)粒，常規(guī)方法進行PCR和酶切鑒定。陽性重組質(zhì)粒測序，驗證讀碼框及突變位點，從而獲得具有正確的突變位點的重組表達載體pET30a-LTK63/G192。(5)LTR72/G192突變基因表達載體構(gòu)建除了模板和引物發(fā)生相應(yīng)變化，其余操作如LTK63/G192突變基因表達載體構(gòu)建。4.重組蛋白的表達、純化及WesternBlot檢測表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，經(jīng)過PCR鑒定后，用IPTG誘導表達蛋白，菌液離心去培養(yǎng)上清，使用NTA0(20mmol/LTris誦HCl,0.5mol/LNaCl，10%甘油)重懸細菌沉淀，超聲波破碎菌體，4t:磁力攪拌器攪拌過夜，離心收集上清。本實驗的特點在于LT為A亞基和B亞基組成，A、B亞基表達后組合成完整LT蛋白。故本實驗離心所得的細菌沉淀直接使用Urea-NTAO重懸，4'C磁力攪拌器攪拌過夜，離心收集上清。這樣A亞基和B亞基仍然在一起，且不打亂A亞基和B亞基之間的比例，這樣通過復性后，大腸桿菌不耐熱腸毒素結(jié)構(gòu)不被破壞。復性采用常規(guī)方法，在含2M尿素的NTA0中透析。純化用Ni-NTAResin裝柱，用FPLC系統(tǒng)進行純化。純化的蛋白于4。C透析復性24小時，PBS透析，BCA法定量。Westernblot檢測將純化蛋白進行常規(guī)的SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，分別用抗CT抗體和His-tag抗體(均購自NEWLANB0RS公司)為一抗，檢測樣品的蛋白。5.重組蛋白的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性檢測ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性檢測根據(jù)文獻SomanG等，UseofSubstituted(Benzylidineamino)guanidinesintheStudyofGuanidinoGroupSpecificADP-ribosyltransferase[J];Biochemistry,1986，25:4113-4119禾卩DeHaan等，MucosalimmunogenicityandadjuvantactivityoftherecombinantAsubunitoftheEs"c力ei"/c力iaco7/heat—labileenterotoxin[J]。Immunology,1999，97(4):706-713的方法進行。用氨基胍重碳酸鹽和對二乙氨基苯甲醛反應(yīng)生成DEA-BAG(;T"二乙基氨基-(benzylidineamino)胍)，用已知的8個不同濃度的DEA-BAG檢測355nm的光吸收，畫出標準的濃度-光吸收值曲線。各取750ng蛋白用胰蛋白酶處理，37'C水浴1小時。用大豆胰蛋白酶抑制劑抑制反應(yīng)。加入等量的DEA-BAG溶液，用NAD啟動反應(yīng)，3(TC水浴2小時。各用等量的D0WEX-50W樹脂吸附出未反應(yīng)的DEA-BAG。過濾，355nm處檢測各個反應(yīng)濾液的光吸收，各個蛋白做3各重復。根據(jù)標準曲線計算反應(yīng)液中DEA-BAG的濃度，計算出所消耗的DEA-BAG的量。以LT所消耗的DEA-BAG的量為100°/。酶活性，計算出各個蛋白的相對酶活性。6.重組蛋白的毒性檢測Patent-mouse毒性檢測試驗，根據(jù)馮強等，大腸桿菌不耐熱腸毒素的表達及純化保存策略[J];生物工程學報，2003，19(5):532-537的方法進行。所得數(shù)據(jù)用t-檢驗測定顯著性差異，P〉0.05為不顯著，P《0.01為極顯著，0.01<P《0.05為顯著。7.蛋白佐劑活性的檢測a.小鼠免疫實驗5-6周齡雌性小鼠，隨機分成8組，5只/組。一組只用5只羽份(參照疫苗使用說明書)的新城疫疫苗(溶于O.1MPBS中)滴鼻免疫，其余各組用5羽份的新城疫疫苗和各種毒素蛋白4化(溶于0.1MPBS中)免疫。分別在l，12，26天進行第一、二、三次免疫。在0，11，25，35天斷尾采血，同時用500WPBS(0.1%BSA)洗鼻。血樣4。C過夜，5000rpm/min離心5min收集血清用于檢測。-2(TC保存。b.間接ELISA檢測不同處理組抗體水平用新城疫LaSota株病毒包被ELISA反應(yīng)板(100u，常規(guī)方法檢測血清IgG、鼻洗液中IgA抗體水平。實施例實施例1表達載體構(gòu)建的PCR擴增及酶切分析分別以前述構(gòu)建的突變體表達載體pET30a-LTK63和pET30a-LTR72為模板，以Pl/P4為引物擴增出大小約為600bp的LTK63/G192I和LTR72/G192I基因；以P2/P3為引物擴增出大小約為530bp的LTK63/G192II和LTR72/G192II基因。用各對片段I和II為模板，以Pl/P2為引物用重疊區(qū)擴增基因拼接法擴增出約1100bp的LTK63/G192和LTR72/G192，大小均與預期的相當。測序結(jié)果顯示，pET30a-LTK63/G192中LT基因片段的第63位氨基酸由Ser密碼子突變?yōu)長ys，第192氨基酸由Arg突變?yōu)镚ly;pET30a-LTR72/G192中LT基因片段的第72氨基酸密碼子由Ala突變?yōu)锳rg，第192氨基酸密碼子由Arg突變?yōu)镚ly。表達載體pET30a-LTK63/G192和pET30a-LTR72/G192構(gòu)建的瓊脂糖凝膠電泳分析如圖1和圖2所示。實施例2重組菌的誘導表達、純化及Western-Blot檢測經(jīng)測序閱讀框架正確的各突變體菌株分別接種到液體培養(yǎng)基中，用終濃度為lmmol/L的IPTG誘導表達，兩個突變體均表達出約33.OKu和13.OKu的兩條蛋白帶；重組表達蛋白用常規(guī)的Ni-NTA樹脂進行純化，用咪唑洗脫，電泳檢測得到大約33.0Ku和13.0Ku的兩條帶，用抗His-tag抗體作為一抗，檢測重組蛋白。LTK63/G192蛋白表達情況見圖3A，LTK63/G192蛋白純化的SDS-PAGE見圖3B，LTK63/G192蛋白禾口LTR72/G192兩個蛋白的Western-Blot檢測見圖3C。實施例3ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性檢測用DEA-BAG作為底物，用NAD啟動反應(yīng)，反應(yīng)終止后測355nm處的光吸收值，按照標準公式計算底物的消耗量，以LT所消耗的底物量作為酶活性100%，計算出其他各個蛋白的相對酶活性，以等體積的不含蛋白的PBS作為對照。結(jié)果如表1示。表1ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性檢測結(jié)果毒素蛋白ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶ft)對照(PBS)6.54LT100LTK6311.71LTR7212.06LTG1928.71LTK63/G1928.76LTR72/G1928.78由上表可見，LTK63/G192和LTR72/G192的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性比LTK63和LTR72更低。實施例4LT突變體的毒性檢測分別用PBS、野生型LT蛋白及各個突變體蛋白飼喂小鼠(Patent-mouse)，取其腸重與尸重的比值，計算各組平均數(shù)及標準差，各突變蛋白組均與PBS、野生型LT做卜檢驗，結(jié)果如表2和圖4。表2Patent-mouse活體毒性檢測的卜檢驗結(jié)果fPLTK636.392尸<0.01LTR724.714尸<0.01LTG1923.0520.01<尸<0.05LTK63/R7212.404尸<0.01LTK63/G19211.430P<0.01LTR72/G1927.548P<0.01結(jié)果顯示，各個突變體與野生型LT相比，毒性均顯著降低。實施例5佐劑活性研究各組小鼠分別用新城疫疫苗(NDV)、或新城疫疫苗和各個毒素蛋白在1、12、26天進行第一、二、三次免疫。在0、11、25、35天斷尾采血收集血清，同時用500WPBS(0.1%BSA)洗鼻。用ELISA檢測各個血清樣品的IgG和鼻洗液樣品的IgA，在450nm光波下讀取0D值。取三免后各組加毒素蛋白的讀數(shù)與只用NDV免疫組的讀數(shù)進行直檢驗。K>0.05差異不顯著，0.01<尸<0.05差異顯著，尸<0.01差異極顯著。結(jié)果如圖5和表3-表4所示。表3:三免后加毒素蛋白+NDV組與NDV組的IgG水平的t-值檢驗<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表4:三免后各個加毒素蛋白+NDV組與NDV組的IgA水平的f-值檢驗<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>結(jié)果顯示，與單用NDV相比，同時用LTK63/G192或LTR72/G192可顯著提高動物體內(nèi)IgG和IgA水平，即它們有良好的免疫佐劑活性；而LTK63/R72不顯著。實施例6組合物一種用于黏膜免疫的組合物，所述的組合物含有4ug的前述純化的LT突變體蛋白LTR72/G192，作為黏膜免疫的佐劑；1-2頭份的新城疫疫苗(溶解在PBS中，O.5ml);以及0.5mL的0.1MPBS。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海市農(nóng)業(yè)科學院<120>大腸桿菌熱敏性腸毒素雙突變體作為疫苗黏膜免疫佐劑<130>080406<160〉12<170>Patentlnversion3.3<210>1<211〉720<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichiacoli)<400>1aMggcgacagattataccgtgctgactctagacccccag3tg8aataaaacgttccgga60ggtcttatgcCC卿gggC3t犯tg3gtacttcgatagagg犯ctcaaatg犯tattaat120ctttatgatcacgcg,ggggctUgtceiggitatgatgacggatatgtt180tccacttctcttagtttgagaagtgctcacttagcaggacagtctatattatc3ggatat240tccacttactat3tatatgttateigcgacatgtttaatgtt犯tgatgta300ttaggcg"UtacagccctcacccatatgaacaggaggtUctgcgttaggtggeiatacca360tattctcagatatatggatggtatcgtgttaaUttggtgtgattgatgaacgattacat420cgtaacaggg肌tatagagaccggtattacatatagctccggcagaggat480ggttac,ttagcaggtttcccaccggatcaccaagcttgg柳ga卿accctggatt540cacaaggttgtcacaggtgatacttgtaat600gagg卿cccagaatctgagctcaggg犯tatcaatcaaaagtt卿agg660cagatattttcagsctatcagtc柳ggttgacgitatataacagaattcggg3tgaatt3720<210〉2<211>240<212〉PRT<213〉大腸桿菌(Escherichiacoli)<400〉2AsnGly1LysArgArgGlyGinThr50SerLeu65SerThrAspSerThr35GlyArgTyrValAsnAspArgGly20GinPheSerTyrValLeuTyrArg5GlyLeuMetMetAsnlieValArgTyr55AlaHisLeu70lieTyrVal85LeuGlyValAlsAspProArg25AsnLeu40AspAspAlaGlylieAlaTyrSerSerArg10GlyHisTyrAspGlyTyrGinSer75ThrAla90ProHisProProAsnGluHisAla45ValSer60lieLeuProAsnProTyrAspGlulie15TyrPheAsp30ArgGlyThrThrSerLeuSerGlyTyr80MetPheAsn95GluGinGluValArgTyr145GlyGluThrlieAsp225SerVal130ArgTyrProlieTyr210Tyr100AlaLeuGly115AsnPheGlyAspArgTyrArgLeuAla165TrplieHis180ThrGlyAsp195LeuArgGluGinSerGluGlyValTyr150GlyHisThrTyrVal230lielie135ArgPheAlaCysGin215AspPro120AspAsnProProAsn200Serlie105TyrGluLeuProGin185GluLysTyrSerArgAsnAsp170GlyGluValAsnGinLeulie155HisCysThrLysArg235lieHis140AlaGinGlyGinArg220lieTyr125ArgProAlaAsnAsn205GinArg110GlyAsnAlaTrpSer190LeulieAspTrpArgGluArg175SerSerPheGluTyrGluAsp160GluArgThrSerLeu240<210〉3<211>372<212>DNA<213〉大腸桿菌(Escherichiacoli)<400>3atgaat犯agtgttttattt3cggcgttactatcctctctatatgcacac60ggagctccccagactattacag犯cteitgttcgg幼tstcgc犯caicac3犯tatat8Cg120agatactatcatatacggaatcgatggcaggc3aa3gaga^tggttgitc180attacattta,gcggcgaeiac3tttcaggtcg犯gtcccgggcagtcaacatat3g3c240tcccagaaaaaagccattga鄉(xiāng)gatg卿gacacattaagaatcacatatctgaccgag300accaaaattgata犯ttatgtgtatggaatccaattcaattgcggcaatc360a_c372<210>4<211>124<212〉PRT<213>大腸桿菌<400>4MetAsnLys1LeuTyrAlaTyrArgAsn35ThrGluSer50SerGlyGlu65ValHis20ThrMetThr(Escherichiacoli)LysCysTyrValLeuPheThr510GlyAlaProGinThrlieThr25GinlieTyrThrlieAsnA印40AlaGlyLysArgGluMetVal55PheGinValGluValProGly7075AlaLeuLeuSerSer15GluLeuCysSerGlu30LyslieLeuSerTyr45lielieThrPheLys60SerGinHislieAsp8021SerGinLysLysAlalieGluArgMetLysAspThrLeuArglieThr859095TyrLeuThrGluThrLyslieAspLysLeuCysValTrpAsnAsnLys100105110ThrProAsnSerlieAlaAlalieSerMetLysAsn115120<210〉<211〉<212><213〉<220〉<221〉<223>529DNA人工序列misc—feature引物<400>5agccatgggcaatggcgacagattatacc29<210><211><212〉<213><220〉<221><223〉629陽人工序列misc_feature引物<400〉6acgtcgacgt"ttcatactgattgccgc29<210〉<211〉<212〉<213><220〉〈221〉<223〉738DNA人工序列misc—feature引物<400〉7cggatatgtttccactaaacttagtttgagaagtgctc38<210〉8<211〉38〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>8gagcacttctcaaactaagtttagtggaaacatatccg38<210〉9<211>39<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223〉引物<400>9gagaagtgctcacttacgtggacagtctatattatcagg39<210>10<211〉39<212〉DNA<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400>10cctgataatatagactgtccacgtaagtgagcscttctc39<210〉11<211>41<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉11ggttgtggaa3ttcatc3ggaacaatcacaggtgatacttg41<210>12<211>41<212>DNA<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400〉12caagtatcacctgtgattgttcctgatgaatttccacaacc4權(quán)利要求1.一種分離的大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白，其特征在于，所述的蛋白包括大腸桿菌熱敏性腸毒素蛋白的A亞基和B亞基，且該A亞基的氨基酸序列相對于野生型大腸桿菌熱敏性腸毒素的A亞基的氨基酸序列，其第63位為K，且第192位為G；其第72位為R，且第192位為G；或其第63位為K，第72位為R，且第192位為G。2.如權(quán)利要求l所述的蛋白，其特征在于，所述的蛋白含有l(wèi)個大腸桿菌熱敏性腸毒素蛋白的A亞基，和5個大腸桿菌熱敏性腸毒素蛋白的B亞基。3.—種分離的核酸，其特征在于，所述的核酸編碼權(quán)利要求1或2所述的蛋白。4.一種載體，其特征在于，所述的載體含有權(quán)利要求3所述的核酸。5.—種細胞，其特征在于，所述的細胞內(nèi)含有權(quán)利要求4所述的載體，或其基因組中整合有權(quán)利要求3所述的核酸。6.—種生產(chǎn)權(quán)利要求1或2所述的蛋白的方法，其特征在于，包括在適于表達的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的細胞，從而表達權(quán)利要求1或2所述的蛋白。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，包括(1)在細胞內(nèi)表達大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白的A亞基和B亞基；(2)收集(l)的細胞，用變性劑重懸后將細胞破碎；(3)將(2)的細胞破碎產(chǎn)物混勻，離心收集上清；(4)從(3)獲得的上清中分離含有A亞基與B亞基的蛋白，復性，獲得所需蛋白。8.權(quán)利要求1或2所述的蛋白的用途，其特征在于，用于制備黏膜免疫的佐劑。9.一種用于黏膜免疫的組合物，其特征在于，所述的組合物含有有效量的權(quán)利要求1或2所述的蛋白，作為黏膜免疫的佐劑。10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述的組合物中還含有有效量的黏膜免疫的疫苗。全文摘要本發(fā)明公開了一種分離的大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白，所述蛋白的A亞基相對于野生型大腸桿菌熱敏性腸毒素的A亞基，其氨基酸序列第63位為K，且第192位為G；或其第72位為R，且第192位為G。本發(fā)明還公開了所述蛋白的編碼基因，含有所述基因的載體或細胞，含有所述蛋白的佐劑組合物，以及所述蛋白的生產(chǎn)方法。文檔編號C12N1/21GK101560247SQ20081003603公開日2009年10月21日申請日期2008年4月15日優(yōu)先權(quán)日2008年4月15日發(fā)明者劉惠莉,唐思靜,潔潘,趙艷敏,饒柏忠申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院