專利名稱：：一種滅活的白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明提供了一種白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗的制備方法。
背景技術(shù)：
：原發(fā)性胃癌為我國(guó)高發(fā)的惡性腫瘤。在胃癌治療歷史上，手術(shù)切除是主要手段，但術(shù)后常復(fù)發(fā)。胃癌晚期(in期)患者，常缺乏有效的延長(zhǎng)病人生命的治療方法。若這些胃癌患者經(jīng)一些有效的輔助治療措施使胃癌腫瘤縮小后，再行切除，有可能使胃癌治療有一個(gè)突破。90年代新興的腫瘤基因治療已成為腫瘤生物治療的重要措施之一，并被譽(yù)為繼手術(shù)、化療和放療之后的另一種具有潛在前途的治療方法。近年來腫瘤基因治療的研究無論從深度上還是廣度上都取得了很大進(jìn)展。在獲得美國(guó)重組DNA咨詢委員會(huì)(RAC)、NIH專家委員會(huì)和FM批準(zhǔn)的基因治療臨床試驗(yàn)方案中，以腫瘤為最多，充分顯示基因治療在腫瘤研究中的迫切性。目前所開展的腫瘤基因治療中，以腫瘤免疫基因治療的研究為最多。腫瘤細(xì)胞耙向的細(xì)胞因子基因治療是以主動(dòng)免疫治療為基礎(chǔ)，即將細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中，以制備出免疫原性更強(qiáng)的新型瘤苗，并由于細(xì)胞因子的持續(xù)分泌，從而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，達(dá)到治療腫瘤的目的。研究表明，細(xì)胞因子基因治療不僅在一定程度上克服了以往臨床直接應(yīng)用細(xì)胞因子需反復(fù)多次且副作用明顯的缺點(diǎn)，而且也取得了直接應(yīng)用所不具有的療效。白細(xì)胞介素-2是由活化T細(xì)胞所分泌的一種細(xì)胞因子，具有刺激多種免疫效應(yīng)細(xì)胞活化的作用，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。在腫瘤免疫中起到重要作用。十多年前已開始將重組白細(xì)胞介素-2應(yīng)用于臨床惡性腫瘤病人。這種白細(xì)胞介素-2的系統(tǒng)性應(yīng)用在黑色素瘤及其它一些腫瘤病人中取得一定的效果，報(bào)道有效率為1520%。這種療法主要是基于白細(xì)胞介素-2可使T細(xì)胞活化，從而有助于殺傷腫瘤細(xì)胞。然而由于白細(xì)胞介素-2在血液中的半衰期較短，而反復(fù)多次大劑量的應(yīng)用又產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，因而限制了白細(xì)胞介素-2的臨床應(yīng)用。1990年，兩個(gè)研究小組分別報(bào)道了應(yīng)用基因工程技術(shù)，將白細(xì)胞介素-2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至腫瘤細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，可分泌白細(xì)胞介素-2的腫瘤細(xì)胞喪失了致瘤性。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)接種白細(xì)胞介素-2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞后可抵抗后續(xù)野生型腫瘤的攻擊。這些數(shù)據(jù)表明(l)基因修飾的腫瘤細(xì)胞自身可與T細(xì)胞相互作用，(2)腫瘤細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-2可替代輔助T細(xì)胞的作用，來激活腫瘤特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞[11]。類似的研究結(jié)果在多種腫瘤模型中相繼得到證實(shí)，包括腸癌(CT26)、纖維肉瘤(CMS5)、肥大細(xì)胞瘤(P815)、黑色素瘤(M-3y等。我們?cè)趧?dòng)物腫瘤模型研究中也發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-2基因修飾的小鼠腫瘤細(xì)胞H22及MM45T丄i均顯著降低其致瘤性，并能有效保護(hù)后續(xù)野生型腫瘤的攻擊。與此同時(shí)，在全世界范圍內(nèi)，應(yīng)用白細(xì)胞介素-2基因工程瘤苗的臨床試驗(yàn)不斷獲得批準(zhǔn)，在細(xì)胞因子基因修飾腫瘤細(xì)胞的臨床試驗(yàn)方案中，以白細(xì)胞介素-2基因應(yīng)用最多。目前已有23個(gè)相關(guān)治療方案獲得批準(zhǔn)，涉及到的腫瘤類型包括黑色素瘤、腎癌、腸癌、前列腺癌、頭頸部腫瘤及肺癌等。在所應(yīng)用的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)應(yīng)用最早，對(duì)其研究也很深入。該系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)是可以前病毒形式穩(wěn)定整合至宿主基因組中，從而使目的基因的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)成為可能。盡管這種整合形式有可能導(dǎo)致宿主基因組的插入突變(insertionmutation),但采用安全的exvivo治療方案，可使插入突變對(duì)機(jī)體帶來的潛在危險(xiǎn)降至最低。此外，作為第二代復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，LXSN系統(tǒng)更為安全，產(chǎn)生有復(fù)制能力的野生型病毒的可能性很小。該載體系統(tǒng)也是被美國(guó)FDA獲得批準(zhǔn)可應(yīng)用于臨床試驗(yàn)的載體之一。自1990年應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體于臨床基因治療以來，尚無發(fā)現(xiàn)該病毒的毒副反應(yīng)報(bào)道。本發(fā)明提供了一種白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗的制備方法，為癌癥的治療提供了一種新的治療途徑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗的制備方法。包括4mRNA的抽提及cDNA的合成、PCR擴(kuò)增IL-2基因、IL-2cDNA的克隆、含IL-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的組建、白細(xì)胞介素-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞制備、人胃癌細(xì)胞株M認(rèn)-45的感染，白細(xì)胞介素-2表達(dá)活性的基因工程人胃癌細(xì)胞的建立及瘤苗的滅活。無。具體實(shí)施例方式第一步含信號(hào)肽的白細(xì)胞介素-2cDNA的制備。1.PHA剌激的人外周血細(xì)胞人外周血用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，共約"106細(xì)胞，經(jīng)植物血凝素(PHA)10ng/ml剌激30小時(shí)，使細(xì)胞因子基因表達(dá)，以備抽提mRNA。2.mRNA的抽提及cDNA的合成(1)mRNA的抽提離心收集細(xì)胞，懸浮于1.5mlRNA抽提緩沖液，用注射器反復(fù)抽打勻槳細(xì)胞，然后再補(bǔ)加3ml抽提緩沖液，充分混合，離心1000cpm5分鐘，收集上清。取Oligo(dT)-CelluloseSpunColumn,混合內(nèi)容物，350g離心兩分鐘，棄去柱內(nèi)液體，取4ml上清上柱，混勻，棄去液體。然后用高鹽緩沖液洗三遍，低鹽緩沖液洗二遍，最后用經(jīng)65°C預(yù)熱的洗脫緩沖液洗脫三次，每次用0.25ml，收集洗脫液，然后乙醇沉淀poly(A)+RNA(mRNA)。(2)cDNA的合成將mRNA溶于20plddH20中，65°C10分鐘，置于冰上備用。在第一條鏈反應(yīng)混合液內(nèi)加入lmlDTT和熱變性的RNA，37'C保溫1小時(shí)，再將此反應(yīng)液加入第二條鏈反應(yīng)混合液中，12°C和22°C各保溫1小時(shí)，最后加lplKlenow酶，37°C30分鐘，65°C10分鐘后再用酚和氯仿抽提，經(jīng)SephacrylS-300柱純化后-20。C保存。2.PCR擴(kuò)增IL-2基因取制備好的PBLcDNA10pl，加入5'和3'擴(kuò)增引物各lpl(30pmo1)、10X反應(yīng)緩沖液5pl、dNTP4pl、加水至50^1，94°C5分鐘變性，力tlPfu酶1U(2.5U)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng).(94'C45"、55TM5"、72TM'20")。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物用等體積苯酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀。3.IL-2cDNA的克隆為了鑒定PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性，須先將產(chǎn)物克隆入pUC18或pBluescriptDNA，經(jīng)DNA序列測(cè)定確認(rèn)為IL-2cDNA無誤后再將這一片段回收，并與表達(dá)載體重組。故將PCR產(chǎn)物溶于TE，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶水解后，與用同樣酶水解過的載體DNA重組，轉(zhuǎn)化TG1后涂于LB/AP平板，37'C培養(yǎng)過夜。4.質(zhì)粒DNA小量抽提將一個(gè)單菌落接入含AP(50pg/ml)的3mlLB中，37。C培養(yǎng)過夜。將菌液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，5000rpm離心2分鐘，沉淀菌體。用100pl溶液I懸浮菌體，再加20(^1溶液I1，溫和顛倒混勻,置于冰上，待溶液澄清后，加入150nl溶液m，充分混勻。15000rpm10分鐘離心，收集上清，用等體積苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，加2.5倍乙醇混勻，沉淀。離心15000rpm10分鐘，將沉淀用70%乙醇洗一次，水泵抽干，最后溶于20plTE，用200pg/mlRNase處理1小時(shí)，-20。C存放。5.質(zhì)粒DNA的大量抽提(1)接種培養(yǎng)將一個(gè)單菌落接種于3mlLB(含AP)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)晚期(OD600"0.6)，取500ial接種入50ml含抗菌素的LB中，同樣培養(yǎng)至對(duì)數(shù)晚期，再取15ml接種入含相應(yīng)抗菌素的1.5LLB中，培養(yǎng)過夜。(2)質(zhì)粒抽提將1.5L培養(yǎng)物離心5500rpml0分鐘，收集菌體。用吸水紙將離心管壁上殘余液體擦干。將菌體懸浮于30ml溶液I中，置室溫中IO分鐘。加液體Il60ml，混合均勻后置冰上10分鐘。加溶液ni45ml，置冰浴10分鐘后，15000rpm離心IO分鐘。紗布過濾后取上清，加等體積異丙醇沉淀，15000rpm離心10分鐘，用70%乙醇洗一次，真空千燥。將沉淀溶于20mlTE，加入等體積5MLiCl沉淀大分子RNA，在水浴中放置IO分鐘，4。C15，000rpm離心10分鐘，取上清，用等體積異丙醇沉淀。離心，干燥，溶于5mlTE，加入RNase至200叫/ml，37°C30分鐘。加等體積13%PEG(8000)/1.6MNaCl沉淀DNA，冰浴放30分鐘。離心沉淀，干燥后用TE5ml溶解，用苯酚、苯酚/氯仿/異戊醇、氯仿/異戊醇各抽提一次。最后加1/10體積3MNaAc及2倍乙醇沉淀。-20。C保存。用時(shí)再離心沉淀，溶于TE。(3)CsCl超離心純化DNA:如上述堿法抽提的DNA，經(jīng)LiCl純化后，用于CsCl超速離心，按lg/ml的用量，加入固體CsCl，3(TC溶解。每10mlDNA加入0.8ml溴乙錠溶液(10mg/ml)，CsC溶液的最終密度是1.55g/ml，折射率1.3860，溴化乙錠濃度約為704pg/ml。室溫8000rpm5分鐘，浮在溶液上的是溴化乙錠和蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物。將浮渣下的清亮溶液用注射器吸入用于超離心的離心管中，用輕石蠟油補(bǔ)滿其余部分，并封口。45000轉(zhuǎn)/分離心2448小時(shí)(20。C)。離心完畢，在普通光照下可見兩條DNA區(qū)帶，下部區(qū)帶由閉環(huán)質(zhì)粒DNA組成，用針頭插入此帶，吸出至1.5ml管中，用等體積的經(jīng)水飽和的正丁醇反復(fù)抽提,直至粉紅色從水相和有機(jī)相中消失。將水相加3倍TE稀釋，加2.5倍無水乙醇沉淀。離心后用70%乙醇洗一次，抽干后溶于TE，-20"保存。6.限制性內(nèi)切酶反應(yīng)根據(jù)不同的限制性內(nèi)切酶選擇相匹配的緩沖液。一般取0.5l|agDNA，限制性內(nèi)切酶5U，反應(yīng)體積20(^1，37°C保溫12小時(shí)，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙錠0.5lpg/ml)鑒定酶切結(jié)果。7.凍融法回收酶切片段在紫外燈下將DNA片段從瓊脂糖凝膠中切下來，加入100nlTE，在干冰乙醇內(nèi)凍結(jié)后置37°C15分鐘，反復(fù)三次，15000rpm離心10分鐘后吸出上清，加入1/10體積NaAc和2倍體積乙醇沉淀，離心收集，沉淀經(jīng)水泵抽干后，溶于TE，即可進(jìn)行連接反應(yīng)。8.DNA連接將等克分子數(shù)的待連接DNA混合，加入5XT4連接酶緩沖液4nl，加水至20nl，加入T4DNA連接酶2U，12'C連接過夜，即可用于轉(zhuǎn)化。9.重組DNA的轉(zhuǎn)化(l)感受態(tài)細(xì)胞制備將培養(yǎng)過夜的受體菌25(Hil接種于5(VlLB中，37°C1.53小時(shí)至對(duì)數(shù)中期，菌液置冰浴IO分鐘，5000rpm離心5分鐘，沉淀菌體用1/2體積經(jīng)預(yù)冷的100mMMgCl2懸浮，冰浴20分鐘，4°C5000rpm離心5分鐘，將菌體懸浮于1/151/10體積的1OOmMCaCl2中，冰浴中放60分鐘，即可用于轉(zhuǎn)化。(2)重組DNA的轉(zhuǎn)化將連接過夜的DNA加入lOOpl感受態(tài)細(xì)胞，混勻，冰浴中放置40分鐘，間或輕輕混勻，42'C2分鐘，涂布于含抗菌素的LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜。10.雙鏈DNA測(cè)序(1)雙鏈變性樣品DNA約1.5-2ng，溶于8^1ddH20，加2MNaOH2pl，置室溫10分鐘，力卩3^13MNaAc中和，再加7nlddH20后，加60^1乙醇沉淀，離心15000rpm10分鐘，抽干后溶于10^1ddH20。(2)退火反應(yīng)10pl變性模板，加2iid引物，2pl退火緩沖液，65""C，5分鐘，緩慢冷卻至室溫。.(3)延伸反應(yīng)將退火后的反應(yīng)液加入lplddH20標(biāo)記混合物3^1、T7聚合酶2jxl(3U)、和同位素(ct-32p)標(biāo)記的dATP，室溫反應(yīng)5分鐘。(4)終止反應(yīng)取上述反應(yīng)液4.5pl至預(yù)先分裝好的4管分別標(biāo)記有G、A、T、C的終止混合物中(各2.5^1)，混勻，37°C5分鐘，加5jal終止液。在電泳上樣前樣品置7580°C2分鐘變性。第二步含IL-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的組建。將pLXSN用EcoRI和BamHl酶切，與經(jīng)同樣酶切的IL-2相連接，重組載體經(jīng)酶切鑒定后含有正確的插入片段，命名為L(zhǎng)(IL-2)SN。第三步產(chǎn)生含白細(xì)胞介素-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞的建立逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是一種很有效的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)包裝細(xì)胞包裝，可產(chǎn)生出高滴度的病毒顆粒，并能高效感染耙細(xì)胞，通過整合至宿主細(xì)胞基因組而獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。本研究采用安全性較高的第二代包裝細(xì)胞PA317對(duì)含IL-2基因的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體L(IL-2)SN進(jìn)行包裝，產(chǎn)生出具有高滴度且不具有復(fù)制能力的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。1.磷酸鈣-DNA共沉淀法轉(zhuǎn)染前一天，將lx106PA317細(xì)胞從培養(yǎng)瓶分至6cm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染前先將32plCaCl2(2M)與220pl質(zhì)粒DNA(lOpg)充分混勻，再加25(^12xHBS，滴加同時(shí)輕柔搖動(dòng)，置室溫30miri，以形成細(xì)小均勻的沉淀顆粒。然后將上述溶液加到含有細(xì)胞的培養(yǎng)皿，于37C°，5%C02靜置20min。再加無血清DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)3天后更換培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)3天后用0.5mg/mlG418進(jìn)行篩選。約14天時(shí)可見抗G418的細(xì)胞克隆形成，挑選單個(gè)克隆進(jìn)行擴(kuò)增。2.病毒滴度測(cè)定病毒滴度測(cè)定以NIN313/TK—為指示靶細(xì)胞。lx105靶細(xì)胞培養(yǎng)1天后，加入經(jīng)過稀釋的含病毒上清液，并加入Polybrene(8Hg/ml)。37°C，5%(]02培養(yǎng)3天后，更換培養(yǎng)液，并加入G418(0.5mg/ml)進(jìn)行篩選。1014天后可見抗G418細(xì)胞克隆形成，Giemsa染色后，計(jì)算克隆數(shù)確定病毒滴度。3.病毒上清的保存選擇病毒滴度大于lx104CFU/ml的PA317克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，收集24小時(shí)新鮮上清，于-70C。凍存?zhèn)溆谩?.野生型病毒檢測(cè)4.1NIH3T3細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)將NIH3T3細(xì)胞以lxlOV孔接種入6孔板中，用DMEM培養(yǎng)液(含10%新生小牛血清)在37。C，5%0)2中培養(yǎng)24小時(shí)。去除6孔板中培養(yǎng)液后，每孔加入0.5ml待檢樣品及1.5mlDMEM培養(yǎng)液，并加入終濃度為8|iig/ml的Polybrene，繼續(xù)37°C，5%0)2培養(yǎng)，擴(kuò)增傳代廣3周。作為陽(yáng)性對(duì)照，在6孔板中，每孔加入0.5mlv)/AM培養(yǎng)上清，其余同上。在第一周末及第三周末分別收集NIH3T3細(xì)胞24小時(shí)培養(yǎng)上清，過濾后用于標(biāo)記拯救試驗(yàn)；同時(shí)消化部分培養(yǎng)細(xì)胞，用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。4.2S+L—分析將PG4或MiCL細(xì)胞株以105個(gè)/孔接種于6孔板中，加2.5ml培養(yǎng)液，過夜后每孔加入20|ag/ml的DEAEDextran;30min后去除Dextran，各孔加入0.5ral上清，其中陽(yáng)性對(duì)照為Mo—MuLV病毒上清，以I:IO，1:102，1:103，1:104稀釋，另兩孔為陰性對(duì)照及PA317細(xì)胞上清，37°C溫育2h后去樣品另加2.5ml新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)廣2周后觀察結(jié)果。4.3聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)用常規(guī)酚、氯仿法抽提細(xì)胞基因組DNA，以空白NIH3T3細(xì)胞的基因組DNA為陰性模板，以i)/AM上清培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞基因組DNA為陽(yáng)性模板。建立常規(guī)的PCR體系25^1(模板DNAl叫、L25mMdNTP2^1、10xBuffer2.5^1、e/K基因引物2pl、Taq酶2(al)，進(jìn)行40次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(94。C:45"，64°C:45")，最后72°C延長(zhǎng)5分種。PCR產(chǎn)物在2y。瓊脂糖凝膠電泳上觀察結(jié)果，陽(yáng)性模板擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)為375bp。PCR靈敏度檢測(cè):將陽(yáng)性模板DNA按1:10、1:102、1:103、1:104、1:105、1:106稀釋，并同時(shí)加入陰性模板DNA，使每pl溶液中DNA總量為lpg，而陽(yáng)性模板DNA依次為1:10—'、1:10—2、1:10—3、1:10—4、1:10—5、1:10—^g，從上述溶液中各取2plDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。此實(shí)驗(yàn)將能從106個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)出1個(gè)帶有朋r基因的陽(yáng)性細(xì)胞，靈敏度為10—6。4.4標(biāo)記拯救試驗(yàn)將lxl06Musdunni細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，置37°C，5%0)2中培養(yǎng)24小時(shí)。去除培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液后，每孔加入2mlNIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清(前述)及3mlDMEM培養(yǎng)液，并加入終濃度為8嗎/ml的Polybrene，置37°C，5%。02培養(yǎng)2周。為設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照，去除培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液后，加入2mlv)/AM培養(yǎng)上清培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清，其余同上。收集前述Musdunni細(xì)胞培養(yǎng)上清，過濾后取lml加入到在6孔板中培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞，置37°C，5%C02中培養(yǎng)24小時(shí)，用含G418(0.6嗎/ml)的培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)810天。在標(biāo)記拯救試驗(yàn)中，如待測(cè)上清中存在有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒，則可將Musdunni中的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝出來，收集上清感染NIH3T3細(xì)胞，缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒可整合到宿主基因組中，使NIH3T3細(xì)胞帶有Nec/基因，因此能在含G418的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)并形成克隆者為陽(yáng)性；不能生長(zhǎng)者為陰性。第四步白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞種子細(xì)胞庫(kù)的建立1.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)呈80%融合時(shí)，加入L(IL-2)SN重組逆轉(zhuǎn)錄病毒上清(病毒滴度lxl06CFU/ml)，并加入Polybrene至終濃度為8|ig/ml,置37°C，5%0)2培養(yǎng)24小時(shí)，按1:2，l:4傳代后加入終濃度為0.5mg/ml的G418，篩選培養(yǎng)約二周后，可見G418抗性細(xì)胞呈克隆化生長(zhǎng)。挑取單個(gè)克隆至24孔板中繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，建立克隆化細(xì)胞系。2.基因組DNA的抽提分別將1X1()6轉(zhuǎn)導(dǎo)及末軒導(dǎo)腫瘤細(xì)胞用PBS洗二次，0.25%胰酶消化，800轉(zhuǎn)離心6分鐘，加O.9ml細(xì)胞裂解液(STE20)^1，20%SDS15|al，蛋白酶K10mg/ml)，37"C保溫過夜后，苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)抽提二次，氯仿異戊醇24:1抽提一次，按1/10體積加入5MNaCl，按2倍體積加入無水乙醇混勻后得DNA沉淀，70。/。乙醇洗一次后TE溶解備用.3.細(xì)胞總RNA抽提按異硫氰酸胍-酚氯仿一步抽提法抽提細(xì)胞總RNA。分別取各種細(xì)胞lX107,PBS冼二次，加PBSlml后平分移入兩支l.5mlEppendorf管中，1200rpm離心棄上清后，細(xì)胞加溶液D50(Hil迅速吸打使細(xì)胞裂解以抑制RNA酶活性。加50pl2MNaAc(pH4.0)，500|nlDEPC&0飽和的新鮮重蒸酚，200pl氯仿異戊醇(49:1)，混勻后置冰浴15分鐘，12000rpm離心15分鐘。吸出含RNA水相，加l倍體積異丙醇混勻，-2(TC過夜。12000rpm離心15分鐘，沉淀加150nl溶液D溶解后，加等體積異丙醇，-2(TC放置1小時(shí)以上，12000rpm離心15分鐘。沉淀用75%乙醇洗一次后用50^1DEPC水溶解，65。C水浴10分鐘，_70°。凍存?zhèn)溆谩?.PCR先94。C5分鐘，接60。C5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)反應(yīng)(72。C1'30"，94°C45"，60°C45〃)，最后72。C10分鐘。反應(yīng)體系為30pl(10X反應(yīng)緩沖液3pl，5'及3'引物各lnl(25pmo1)，1.25腿oldNTP2^1,樣品DNAl叫力口ddH20至30^1)。反應(yīng)結(jié)束后1.52%凝膠水平或6%PAGE垂直凝膠電泳鑒定。5.RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取各細(xì)胞總RNA各5ial(liagAa)，加入RNA酶抑制劑RNasinO.5^1，隨機(jī)引物2pl，65°C5分鐘后置冰浴上加入RNasin0.5pl，5XBuffer4^1,dNTP7pl，Mo-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶lnl后置37。C1.5小時(shí)。加入終止液后備用。PCR反應(yīng)各取上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2pl作為模板，按上述PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，p-actin引物作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。6.Southern印跡雜交(1)DNA酶解取各細(xì)胞基因組DNA各3(Vg，溶于17^il水中，力卩2plSacI酶切緩沖液(10X),混勻后加入lnlSacI(30U/nl)，37。C保溫過夜。(2)電泳及轉(zhuǎn)移上述酶解液5nl加2pl溴酚蘭上樣緩沖液后，上1%瓊脂糖凝膠電泳，70V、30mA電泳23小時(shí)。EB染色觀察是否酶解完全。如果酶解不完全，則再加入lplSacl繼續(xù)保溫23小時(shí)使其完全酶解。然后按上述條件進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將膠浸泡于變性液(1.5MNaCl，0.5MNaOH)中40分鐘，然后在中和液(1MTris.Cl，1.5MNaCl)中浸泡30分鐘。轉(zhuǎn)移至尼龍膜方法按分子克隆手冊(cè)進(jìn)行。(3)探針制備以含細(xì)胞因子基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒為模板，按上述PCR方法制備Neo及IL-2的DNA探針，dNTP用寶靈曼的PCRDIGlabelingmix(No.1585550)替代。雜交及檢測(cè)采用寶靈曼公司推薦方法進(jìn)行。7.Northern印跡雜交各細(xì)胞總RNA50嗎用于電泳。轉(zhuǎn)移至尼龍膜及雜交均參見MolecularCloning。探針用ot32P-dATP.(購(gòu)自Amersham公司)標(biāo)記。8.白細(xì)胞介素-2活性檢測(cè)(1)待測(cè)樣品稀釋用RPMI1640培養(yǎng)液將待測(cè)樣品進(jìn)行1:2、1:4、1:8、1:16倍稀釋，加到96孔板中，每孔100nl。同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性(rlL-2標(biāo)準(zhǔn)品)及陰性(培養(yǎng)液)對(duì)照，三個(gè)孔。(2)細(xì)胞培養(yǎng)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CTLL-2細(xì)胞，用PBS洗滌23次，配成lxl()S細(xì)胞/ml，以lOO^il/孔加到待測(cè)樣品中，置于37C。，5%0)2中培養(yǎng)16~24小時(shí)。(3)MTT染色從各孔中輕輕吸取10(^1培養(yǎng)上清，棄去。各孔中再加入10^1MTT溶液，繼續(xù)37C。中孵育46小時(shí)后，各孔加入100nl酸化異丙醇，充分震蕩吹打后靜置20分種。(4)比色用波長(zhǎng)570nm的酶標(biāo)儀檢測(cè)。(5)結(jié)果判定IL-2活性是以細(xì)胞培養(yǎng)上清所具備的維持IL-2反應(yīng)細(xì)胞增殖能力來確定的。IL-2的活性單位可通過與IL-2標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比而判定。方法為將待測(cè)上清和IL-2標(biāo)準(zhǔn)品均稀釋成不同的倍數(shù)后觀察IL-2反應(yīng)細(xì)胞的增殖情況，求出IL-2標(biāo)準(zhǔn)品組中反應(yīng)細(xì)胞最高增殖數(shù)50%時(shí)的稀釋倍數(shù)，同時(shí)求出待測(cè)標(biāo)本相應(yīng)的稀釋度。兩個(gè)稀釋度倒數(shù)之比乘以IL-2標(biāo)準(zhǔn)品的活性單位，即是待測(cè)標(biāo)本的IL-2活性單位。9.白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞種子細(xì)胞凍存0.25%胰酶消化白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞種子細(xì)胞后，移入5ml培養(yǎng)液中，以800rpm離心5分鐘，將上清吸盡，按lx106細(xì)胞加lml凍存液(含30%小牛血清及10%DMS0),移入凍存管中。先放在4C。降溫30分鐘，然后移入氣態(tài)的液氮中繼續(xù)降溫30分鐘，最后將凍存管放入液氮生物容器內(nèi)的液氮里保存。第五步瘤苗的滅活1.細(xì)胞收集及洗滌常規(guī)擴(kuò)增培養(yǎng)的白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞，用PBS洗滌兩次后，以0.25%胰酶消化，收集lx108細(xì)胞至400ml離心瓶中，內(nèi)含400mlpH7.4無鈣、鎂磷酸緩沖液(PBS)。以1000rpm離心10分鐘清洗，共清洗三次，最后將PBS上清吸盡，按lx107細(xì)胞加lml凍存液，移入凍存管中。2.6()0)照射滅活白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞在6()0)治療儀(THERATRON780-C)下，按40G、60G、IOOG輻射強(qiáng)度分別進(jìn)行照射，照射后的細(xì)胞命名為白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗(HG-l/IL-2)。3.HG-l/IL-2凍存先放在4C。降溫30分鐘，然后移入氣態(tài)的液氮中繼續(xù)降溫30分鐘，最后將凍存管放入液氮生物容器內(nèi)的液氮里保存。4.HG-l/IL-2細(xì)胞存活率測(cè)定將復(fù)蘇后的HG-l/IL-2，用5ml完全培養(yǎng)液懸浮。取4滴于載玻片上，用0.1%臺(tái)酚蘭(溶于0.9%生理鹽水)染色23分鐘，觀察結(jié)果。細(xì)胞中有深藍(lán)色顆粒浸潤(rùn)即為死亡細(xì)胞，透亮的則為活細(xì)胞。4滴樣品各隨機(jī)取視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/100。4滴樣品的平均值即為某一天的活細(xì)胞數(shù)，將總細(xì)胞數(shù)x存活率即得總活細(xì)胞數(shù)。實(shí)施例1白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞經(jīng)不同劑量的6QCo輻射后在體外均喪失了增殖能力，且隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞存活率下降，活細(xì)胞數(shù)減少。如表2所示，輻射一周后細(xì)胞的存活率約為50%，且不同輻射劑量間無差異。經(jīng)60G和100G照射的細(xì)胞，在培養(yǎng)至第25天時(shí)細(xì)胞全部死亡。將上述三種劑量照射的基因工程人胃癌細(xì)胞(HG—1、IL一2)接種于裸鼠，均未產(chǎn)生腫瘤，說明致瘤性消失。表2.白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞s"Co照射后的存活率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>將6QCo照射后喪失增殖能力的白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞稱之為白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗，簡(jiǎn)稱HG-l/IL-2，該細(xì)胞制劑己經(jīng)滅活，但是否仍具有分泌白細(xì)胞介素-2的能力是其作為瘤苗作用的關(guān)鍵所在。如圖20所示，經(jīng)6()0)照射后，40G、60G和100G三個(gè)照射劑量均能持續(xù)分泌白細(xì)胞介素-2三周以上。其中照射后4天分泌量達(dá)到高峰，且不同輻射強(qiáng)度間無顯著差異。實(shí)施例2將復(fù)蘇后的HG-1/IL-2,用5ml完全培養(yǎng)液懸浮。取4滴于載玻片上，用0.1%臺(tái)酚蘭(溶于0.9%生理鹽水)染色23分鐘，觀察結(jié)果。細(xì)胞中有深藍(lán)色顆粒浸潤(rùn)即為死亡細(xì)胞，透亮的則為活細(xì)胞。4滴樣品各隨機(jī)取視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/100。4滴樣品的平均值即為某一天的活細(xì)胞數(shù)，將總細(xì)胞數(shù)x存活率即得總活細(xì)胞數(shù)。權(quán)利要求1.一種滅活的白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗的制備方法，其特征在于，該胃癌細(xì)胞株為MKN-45。2.如權(quán)利要求l所述，其特征在于，應(yīng)用^Co照射使其滅活。3.如權(quán)利要求l所述，其特征在于，該細(xì)胞株表達(dá)HLA-A2分子。4.如權(quán)利要求l所述，其特征在于，該白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞有如下步驟得到用含白細(xì)胞介素-2的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒上清感染MKN-45得到白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞，應(yīng)用^Co照射使其滅活。5.如權(quán)利要求l所述，其特征在于，該白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞疫苗可以用于治療胃癌。全文摘要本發(fā)明提供了一種滅活的白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗的制備方法。從經(jīng)PHA誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞中抽提mRNA，在體外合成cDNA，運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)克隆了含有信號(hào)肽的白細(xì)胞介素-2cDNA，并與缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LXSN進(jìn)行重組，構(gòu)建了含白細(xì)胞介素-2cDNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體L(IL-2)SN。采用安全性較高的第二代包裝細(xì)胞PA317對(duì)含IL-2基因的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體L(IL-2)SN進(jìn)行包裝，產(chǎn)生出具有高滴度且不具有復(fù)制能力的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染人胃癌細(xì)胞株MKN-45，建立了具有白細(xì)胞介素-2表達(dá)活性的基因工程人胃癌細(xì)胞，應(yīng)用⁶⁰Co照射，在摸索了不同的照射劑量后，制備了滅活白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗。文檔編號(hào)C12N15/867GK101560497SQ20081003602公開日2009年10月21日申請(qǐng)日期2008年4月14日優(yōu)先權(quán)日2008年4月14日發(fā)明者錢關(guān)祥,陳詩(shī)書申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院;上海新生源醫(yī)藥研究有限公司