專利名稱：一種白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明提供了一種白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗的制備工藝。
背景技術(shù)：
原發(fā)性胃癌為我國高發(fā)的惡性腫瘤。在胃癌治療歷史上，手術(shù)切除是主要手
段，但術(shù)后常復(fù)發(fā)。胃癌晚期(m期)患者，常缺乏有效的延長病人生命的治療方法。若這些胃癌患者經(jīng)一些有效的輔助治療措施使胃癌腫瘤縮小后，再行切除，有可能使胃癌治療有一個突破。
90年代新興的腫瘤基因治療巳成為腫瘤生物治療的重要措施之一，并被譽(yù)為繼手術(shù)、化療和放療之后的另一種具有潛在前途的治療方法。近年來腫瘤基因
治療的研究無論從深度上還是廣度上都取得了很大進(jìn)展。在獲得美國重組DNA咨詢委員會(RAC)、 NIH專家委員會和FDA批準(zhǔn)的基因治療臨床試驗方案中，以腫瘤為最多，充分顯示基因治療在腫瘤研究中的迫切性。目前所開展的腫瘤基因治療中，以腫瘤免疫基因治療的研究為最多。腫瘤細(xì)胞靶向的細(xì)胞因子基因治療是以主動免疫治療為基礎(chǔ)，即將細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中，以制備出免疫原性更強(qiáng)的新型瘤苗，并由于細(xì)胞因子的持續(xù)分泌，從而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，達(dá)到治療腫瘤的目的。研究表明，細(xì)胞因子基因治療不僅在一定程度上克服了以往臨床直接應(yīng)用細(xì)胞因子需反復(fù)多次且副作用明顯的缺點，而且也取得了直接應(yīng)用所不具有的療效。
白細(xì)胞介素-2是由活化T細(xì)胞所分泌的一種細(xì)胞因子，具有剌激多種免疫效應(yīng)細(xì)胞活化的作用，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。在腫瘤免疫中起到重要作用。十多年前已開始將重組白細(xì)胞介素-2應(yīng)用于臨床惡性腫瘤病人。這種白細(xì)胞介素-2的系統(tǒng)性應(yīng)用在黑色素瘤及其它一些腫瘤病人中取得一定的效果，報道有效率為15~20%。這種療法主要是基于白細(xì)胞介素-2可使T細(xì)胞活化，從而有助于殺傷腫瘤細(xì)胞。然而由于白細(xì)胞介素-2在血液中的半衰期較短，而反復(fù)多次大劑量的應(yīng)用又產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，因而限制了白細(xì)胞介素-2的臨床應(yīng)用。
1990年，兩個研究小組分別報道了應(yīng)用基因工程技術(shù)，將白細(xì)胞介素-2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至腫瘤細(xì)胞。動物實驗結(jié)果表明，可分泌白細(xì)胞介素-2的腫瘤細(xì)胞喪失了致瘤性。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)接種白細(xì)胞介素-2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞后可抵抗后
續(xù)野生型腫瘤的攻擊。這些數(shù)據(jù)表明(l)基因修飾的腫瘤細(xì)胞自身可與T細(xì)胞
相互作用，(2)腫瘤細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-2可替代輔助T細(xì)胞的作用，來激活腫瘤特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞[11]。類似的研究結(jié)果在多種腫瘤模型中相繼得到證實，包括腸癌(CT26)、纖維肉瘤(CMS5)、肥大細(xì)胞瘤(P815)、黑色素瘤(M-3)1等。
我們在動物腫瘤模型研究中也發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-2基因修飾的小鼠腫瘤細(xì)胞Hn及MM45T丄i均顯著降低其致瘤性，并能有效保護(hù)后續(xù)野生型腫瘤的攻擊。
與此同時，在全世界范圍內(nèi)，應(yīng)用白細(xì)胞介素-2基因工程瘤苗的臨床試驗不斷獲得批準(zhǔn)，在細(xì)胞因子基因修飾腫瘤細(xì)胞的臨床試驗方案中，以白細(xì)胞介素-2基因應(yīng)用最多。目前已有23個相關(guān)治療方案獲得批準(zhǔn)，涉及到的腫瘤類型包括黑色素瘤、腎癌、腸癌、前列腺癌、頭頸部腫瘤及肺癌等。
在所應(yīng)用的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)應(yīng)用最早，對其研究也很深入。該系統(tǒng)最大的優(yōu)點是可以前病毒形式穩(wěn)定整合至宿主基因組中，從而使目的基因的長期穩(wěn)定表達(dá)成為可能。盡管這種整合形式有可能導(dǎo)致宿主基因組的插入突變(insertion mutation),但采用安全的ex vivo治療方案，可使插入突變對機(jī)體帶來的潛在危險降至最低。此外，作為第二代復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，LXSN系統(tǒng)更為安全，產(chǎn)生有復(fù)制能力的野生型病毒的可能性很小。該載體系統(tǒng)也是被美國FDA獲得批準(zhǔn)可應(yīng)用于臨床試驗的載體之一。自1990年應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體于臨床基因治療以來，尚無發(fā)現(xiàn)該病毒的毒副反應(yīng)報道。
本發(fā)明提供了一種白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗的制備工藝，為癌癥的治療提供了一種新的治療途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗的制備工藝。包括
4mRNA的抽提及c副A的合成、PCR擴(kuò)增IL-2基因、IL-2 cDNA的克隆、含IL-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的組建、白細(xì)胞介素-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞制備、人胃癌細(xì)胞株MKN-45的感染，白細(xì)胞介素-2表達(dá)活性的基因工程人胃癌細(xì)胞的建立及瘤苗的滅活。


無。
具體實施例方式
第一步含信號肽的白細(xì)胞介素-2 cDNA的制備。
1. PHA剌激的人外周血細(xì)胞人外周血用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個核細(xì)胞，共約"106細(xì)胞，經(jīng)植物血凝素(PHA)10pg/ml剌激30小時，使細(xì)胞因子基因表達(dá)，以備抽提mRNA。
2. mRNA的抽提及cDNA的合成
(1) mRNA的抽提離心收集細(xì)胞，懸浮于1.5mlRNA抽提緩沖液，用注射器反復(fù)抽打勻漿細(xì)胞，然后再補(bǔ)加3ml抽提緩沖液，充分混合，離心1000cpm5分鐘，收集上清。取Oligo (dT)-Cellulose Spun Column,混合內(nèi)容物，350g離心兩分鐘，棄去柱內(nèi)液體，取4ml上清上柱，混勻，棄去液體。然后用高鹽緩沖液洗三遍，低鹽緩沖液洗二遍，最后用經(jīng)65°C預(yù)熱的洗脫緩沖液洗脫三次，每次用0.25ml，收集洗脫液，然后乙醇沉淀poly(A)十RNA(mRNA)。
(2) cDNA的合成將mRNA溶于20^1 ddH20中，65°C10分鐘，置于冰上備用。在第一條鏈反應(yīng)混合液內(nèi)加入lmlDTT和熱變性的RNA， 37'C保溫1小時，再將此反應(yīng)液加入第二條鏈反應(yīng)混合液中，12°C和22°C各保溫1小時，最后加lpl Klenow酶，37°C 30分鐘，65°C10分鐘后再用酚和氯仿抽提，經(jīng)Sephacryl S-300柱純化后-20°。保存。
2.PCR擴(kuò)增IL-2基因取制備好的PBLcDNA10pl，加入5'和3'擴(kuò)增引物各lnl( 30pmo1)、 10X反應(yīng)緩沖液5^U、 dNTP4pl、加水至50^1，94°C 5分鐘變性，力B Pfu酶1U(2.5U)，進(jìn)行30個循環(huán)反應(yīng).(94。C 45"、55°C45"、 72"C1'20")。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物用等體積苯酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀。
3. IL-2 cDNA的克隆為了鑒定PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性，須先將產(chǎn)物克隆入pUC 18或pBluescriptDNA ， 經(jīng)DNA序列測定確認(rèn)為IL-2 cDNA無誤后再將這一片段回收，并與表達(dá)載體重組。故將PCR產(chǎn)物溶于TE，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶水解后，與用同樣酶水解過的載體DNA重組，轉(zhuǎn)化TG1后涂于LB/AP平板，37。C培養(yǎng)過夜。
4. 質(zhì)粒DNA小量抽提將一個單菌落接入含AP(50iag/ml)的3ml LB中，37。C培養(yǎng)過夜。將菌液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，5000rpm離心2分鐘，沉淀菌體。用100pl溶液I懸浮菌體，再加200pl溶液I1，溫和顛倒混勻,置于冰上，待溶液澄清后，加入150^1溶液IIl，充分混勻。15000rpm 10分鐘離心，收集上清，用等體積苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，加2.5倍乙醇混勻，沉淀。離心15000rpm 10分鐘，將沉淀用70%乙醇洗一次，水泵抽干，最后溶于20plTE，用200ng/mlRNase處理1小時，-20"存放。
5. 質(zhì)粒DNA的大量抽提
(1) 接種培養(yǎng)將一個單菌落接種于3mlLB(含AP)中培養(yǎng)至對數(shù)晚期(OD600"0.6)，取500^1接種入50ml含抗菌素的LB中，同樣培養(yǎng)至對數(shù)晚期，再取15ml接種入含相應(yīng)抗菌素的1.5LLB中，培養(yǎng)過夜。
(2) 質(zhì)粒抽提將1.5L培養(yǎng)物離心5500rpmlO分鐘，收集菌體。用吸水紙將離心管壁上殘余液體擦干。將菌體懸浮于30ml溶液I中，置室溫中IO分鐘。加液體Il60ml，混合均勻后置冰上10分鐘。加溶液IIl45ml，置冰浴10分鐘后，15000rpm離心IO分鐘。紗布過濾后取上清，加等體積異丙醇沉淀，15000rpm離心10分鐘，用70%乙醇洗一次，真空干燥。將沉淀溶于20mlTE，加入等體積5M LiCl沉淀大分子RNA，在水浴中放置IO分鐘，4"15,000rpm離心10分鐘，取上清，用等體積異丙醇沉淀。離心，干燥，溶于5mlTE，加入RNase至200pg/ml， 37°C 30分鐘。加等體積13%PEG(8000)/1.6M NaCl沉淀DNA，冰浴放30分鐘。離心沉淀，干燥后用TE5ml溶解，用苯酚、苯酚/氯仿/異戊醇、氯仿/異戊醇各抽提一次。最后加1/10體積3MNaAc及2倍乙醇沉淀。-20°<:保存。用時再離心沉淀，溶于TE。
(3) CsCl超離心純化DNA: 如上述堿法抽提的DNA，經(jīng)LiCI純化后，用于CsCl超速離心，按lg/ml的用量，加入固體CsCl， 30。C溶解。每10mlDNA加入0.8ml溴乙錠溶液(10mg/ml)， CsC溶液的最終密度是1.55g/ml，折射率1.3860，溴化乙錠濃度約為704pg /ml。室溫8000rpm 5分鐘，浮在溶液上的是溴化乙錠和蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物。將浮渣下的清亮溶液用注射器吸入用于超離心的離心管中，用輕石蠟油補(bǔ)滿其余部分，'并封口。 45000轉(zhuǎn)/分離心24 48小時(20。C)。離心完畢，在普通光照下可見兩條DNA區(qū)帶，下部區(qū)帶由閉環(huán)質(zhì)粒DNA組成，用針頭插入此帶，吸出至1.5ml管中，用等體積的經(jīng)水飽和的正丁醇反復(fù)抽提,直至粉紅色從水相和有機(jī)相中消失。將水相加3倍TE稀釋，加2.5倍無水乙醇沉淀。離心后用70%乙醇洗一次，抽干后溶于TE， -20匸保存。
6. 限制性內(nèi)切酶反應(yīng)根據(jù)不同的限制性內(nèi)切酶選擇相匹配的緩沖液。 一般取0.5 lpg DNA，限制性內(nèi)切酶 5U，反應(yīng)體積20^1， 37°C保溫1 2小時，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙錠0.5 lpg/ml)鑒定酶切結(jié)果。
7. 凍融法回收酶切片段在紫外燈下將DNA片段從瓊脂糖凝膠中切下來，加入100ialTE，在干冰乙醇內(nèi)凍結(jié)后置37°C15分鐘，反復(fù)三次，15000rpm離心10分鐘后吸出上清，加入1/10體積NaAc和2倍體積乙醇沉淀，離心收集，沉淀經(jīng)水泵抽干后，溶于TE，即可進(jìn)行連接反應(yīng)。
8. DNA連接將等克分子數(shù)的待連接DNA混合，加入5XT4連接酶緩沖液4pl，加水至20pl，加入T4DNA連接酶2U， 12。C連接過夜，即可用于轉(zhuǎn)化。
9. 重組DNA的轉(zhuǎn)化
(l)感受態(tài)細(xì)胞制備將培養(yǎng)過夜的受體菌250nl接種于50|alLB中，37°C1.5 3小時至對數(shù)中期，菌液置冰浴IO分鐘，5000rpm離心5分鐘，沉淀菌體用1/2體積經(jīng)預(yù)冷的100mM MgCl2懸浮，冰浴20分鐘，4°C5000rpm離心5分鐘，將菌體懸浮于1/15 1/10體積的100mM CaCl2中，冰浴中放60分鐘，即可用于轉(zhuǎn)化。(2)重組DNA的轉(zhuǎn)化將連接過夜的DNA加入lOOpl感受態(tài)細(xì)胞，混勻，冰浴中放置40分鐘，間或輕輕混勻，42"C2分鐘，涂布于含抗菌素的LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜。10.雙鏈DNA測序
(1) 雙鏈變性樣品DNA約1.5-2(ag，溶于8^1 ddH20，加2M NaOH 2pl，置室溫10分鐘，加3^1 3M NaAc中和，再加7|ilddH20后，加60|al乙醇沉淀，離心15000rpm 10分鐘，抽干后溶于10^1 ddH20。
(2) 退火反應(yīng)10nl變性模板，加2pl引物，2pl退火緩沖液，65°C，5分鐘，緩慢冷卻至室溫。
(3) 延伸反應(yīng)將退火后的反應(yīng)液加入lplddH20標(biāo)記混合物3pl、T7聚合酶2pl(3U)、和0.5|iil同位素(ot-"P)標(biāo)記的dATP，室溫反應(yīng)5分鐘。
(4) 終止反應(yīng)取上述反應(yīng)液4.5^1至預(yù)先分裝好的4管分別標(biāo)記有G、 A、 T、 C的終止混合物中(各2.5pl)，混勻，37°C 5分鐘，加5pl終止液。在電泳上樣前樣品置75 8(TC2分鐘變性。
第二步含IL-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的組建。
將pLXSN用EcoRI和BamHI酶切，與經(jīng)同樣酶切的IL-2相連接，重組載體經(jīng)酶切鑒定后含有正確的插入片段，命名為L(IL-2)SN。
第三步產(chǎn)生含白細(xì)胞介素-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞的建立
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是一種很有效的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)包裝細(xì)胞包裝，可產(chǎn)生出高滴度的病毒顆粒，并能高效感染靶細(xì)胞，通過整合至宿主細(xì)胞基因組而獲得長期穩(wěn)定表達(dá)。本研究采用安全性較高的第二代包裝細(xì)胞PA317對含IL-2基因的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體L(IL-2)SN進(jìn)行包裝，產(chǎn)生出具有高滴度且不具有復(fù)制能力的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。1.磷酸鈣-DNA共沉淀法
轉(zhuǎn)染前一天，將lx106 PA317細(xì)胞從培養(yǎng)瓶分至6cm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染前先將32^1 CaCl2(2M)與220(^1質(zhì)粒DNA (IO嗎)充分混勻，再加250W 2xHBS，滴加同時輕柔搖動，置室溫30min，以形成細(xì)小均勻的沉淀顆粒。然后將上述溶液加到含有細(xì)胞的培養(yǎng)皿，于37C°， 5%C02靜置20min。再加無血清DMEM培養(yǎng)液， 培養(yǎng)3天后更換培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)3天后用0. 5mg/mlG418進(jìn)行篩選。約14天時 可見抗G418的細(xì)胞克隆形成，挑選單個克隆進(jìn)行擴(kuò)增。
2. 病毒滴度測定
病毒滴度測定以NIN313/TK—為指示靶細(xì)胞。lx105靶細(xì)胞培養(yǎng)1天后，加入 經(jīng)過稀釋的含病毒上清液，并加入Polybrene (8嗎>1)。 37°C， 5%0)2培養(yǎng)3天 后，更換培養(yǎng)液，并加入G418 (0.5mg/ml)進(jìn)行篩選。10 14天后可見抗G418 細(xì)胞克隆形成，Giemsa染色后，計算克隆數(shù)確定病毒滴度。
3. 病毒上清的保存
選擇病毒滴度大于lx104 CFU/ml的PA317克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，收集24小時 新鮮上清，于-70C。凍存?zhèn)溆谩?br> 4. 野生型病毒檢測
4. 1 NIH3T3細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)
將NIH3T3細(xì)胞以lxl()S/孔接種入6孔板中，用DMEM培養(yǎng)液(含10%新生小牛 血清)在37。 C， 5°/￡02中培養(yǎng)24小時。去除6孔板中培養(yǎng)液后，每孔加入0. 5ml 待檢樣品及1. 5ml DMEM培養(yǎng)液，并加入終濃度為8|ag/ml的Polybrene，繼續(xù) 37° C， 5%0)2培養(yǎng)，擴(kuò)增傳代1 3周。作為陽性對照，在6孔板中，每孔加入 0.5mli]/AM培養(yǎng)上清，其余同上。在第一周末及第三周末分別收集NIH3T3細(xì)胞 24小時培養(yǎng)上清，過濾后用于標(biāo)記拯救試驗；同時消化部分培養(yǎng)細(xì)胞，用于聚 合酶鏈反應(yīng)(PCR)。 4. 2 S+L—分析
將PG4或MiCL,細(xì)胞株以105個/孔接種于6孔板中，加2. 5ml培養(yǎng)液，過夜 后每孔加入20pg/ml的DEAE Dextran; 30min后去除Dextran，各孔加入0. 5ml 上清，其中陽性對照為Mo"MuLV病毒上清，以I:IO, 1:102， 1:103， 1:104稀釋， 另兩孔為陰性對照及PA317細(xì)胞上清，37° C溫育2h后去樣品另加2. 5ml新鮮 培養(yǎng)液，培養(yǎng)1 2周后觀察結(jié)果。 4.3聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)
用常規(guī)酚、氯仿法抽提細(xì)胞基因組DNA，以空白NIH3T3細(xì)胞的基因組DNA 為陰性模板，以x)/AM上清培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞基因組DNA為陽性模板。建立常規(guī)的PCR體系25^1 (模板DNA lpg、 1.25mM dNTP 2pl、 10xBuffer 2.5^1、 e/ K基 因引物2pl、Taq酶2nl)，進(jìn)行40次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(94° C:45" ， 64° C:45")， 最后72° C延長5分種。PCR產(chǎn)物在2y。瓊脂糖凝膠電泳上觀察結(jié)果，陽性模板擴(kuò) 增產(chǎn)物長度應(yīng)為375bp。
PCR靈敏度檢測:將陽性模板DNA按1:10、 1:102、 1:103、 1:104、 1:105、 1:106 稀釋，并同時加入陰性模板DNA，使每nl溶液中DNA總量為l嗎，而陽性模板 DNA依次為1:1(T、 1:10-2、 1:10-3、 1:10—4、 1:10—5、 l:10、g，從上述溶液中各取 2plDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。此實驗將能從106個細(xì)胞中檢測出1個帶有朋r 基因的陽性細(xì)胞，靈敏度為l(T。 4.4標(biāo)記拯救試驗
將lxl06Musdunni細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，置37° C， 5%032中培養(yǎng)24小 時。去除培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液后，每孔加入2ml NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清(前述)及3ml DMEM培養(yǎng)液，并加入終濃度為8叫/ml的Polybrene，置37° C， 5%0)2培養(yǎng)2周。 為設(shè)立陽性對照，去除培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液后，加入2mlv)/AM培養(yǎng)上清培養(yǎng)的NIH3T3 細(xì)胞培養(yǎng)上清，其余同上。收集前述Musdimni細(xì)胞培養(yǎng)上清，過濾后取lml加 入到在6孔板中培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞，置37° C， 5%C02中培養(yǎng)24小時，用含 G418(0.6pg/ml)的培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)8 10天。在標(biāo)記拯救試驗中，如待測上清中 存在有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒，則可將Musdunni中的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝出 來，收集上清感染NIH3T3細(xì)胞，缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒可整合到宿主基因組中，使 NIH3T3細(xì)胞帶有Nec/基因，因此能在含G418的培養(yǎng)液中生長并形成克隆者為陽 性；不能生長者為陰性。
第四步白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞種子細(xì)胞庫的建立
1. 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染
當(dāng)細(xì)胞生長呈80%融合時，加入L(IL-2)SN重組逆轉(zhuǎn)錄病毒上清(病毒滴度 lxl06CFU/ml)，并加入Polybrene至終濃度為8嗎/ml，置37° C， 5線培養(yǎng)24 小時，按1:2， 1:4傳代后加入終濃度為0. 5mg/ml的G418，篩選培養(yǎng)約二周后， 可見G418抗性細(xì)胞呈克隆化生長。挑取單個克隆至24孔板中繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，建 立克隆化細(xì)胞系。
2. 基因組DNA的抽提
10分別將1X106轉(zhuǎn)導(dǎo)及末軒導(dǎo)腫瘤細(xì)胞用PBS洗二次，0.25%胰酶消化，800 轉(zhuǎn)離心6分鐘，加0. 9ml細(xì)胞裂解液(STE20pl， 20%SDS 15pl，蛋白酶K10mg/ml)， 37'C保溫過夜后，苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)抽提二次，氯仿異戊醇24:1 抽提一次，按1/10體積加入5M NaCl,按2倍體積加入無水乙醇混勻后得DNA 沉淀，70。/。乙醇洗一次后TE溶解備用.
3. 細(xì)胞總RNA抽提 按異硫氰酸胍-酚氯仿一步抽提法抽提細(xì)胞總RNA。分別取各種細(xì)胞l X 107，
PBS冼二次，加PBS lml后平分移入兩支l. 5ml Eppendorf管中，1200rpm離心 棄上清后，細(xì)胞加溶液D 500nl迅速吸打使細(xì)胞裂解以抑制RNA酶活性。加 50nl 2M NaAc(pH4. 0)， 500^1 DEPC &0飽和的新鮮重蒸酚，200pl氯仿異戊 醇(49:1)，混勻后置冰浴15分鐘，12000rpm離心15分鐘。吸出含RNA水相，加 l倍體積異丙醇混勻，-2(TC過夜。12000rpm離心15分鐘，沉淀加150pl溶液D 溶解后，加等體積異丙醇，-2(TC放置1小時以上，12000rpm離心15分鐘。沉 淀用75%乙醇洗一次后用5(^1 DEPC水溶解，65。C水浴10分鐘，-70。C凍存?zhèn)?用。
4. PCR
先94'C5分鐘，接60'C5分鐘，然后進(jìn)行35個循環(huán)反應(yīng)(72'C1'30"， 94°C 45〃， 60°C45〃)，最后72。C10分鐘。反應(yīng)體系為30pl (10X反應(yīng)緩沖液3^1, 5' 及3'引物各lnl( 25pmo1)， 1.25mmoldNTP 2^1，樣品DNA lpg,加ddH20至 30)Ld)。反應(yīng)結(jié)束后1.5 2%凝膠水平或6% PAGE垂直凝膠電泳鑒定。
5. RT-PCR
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取各細(xì)胞總RNA各5iLil(liag/Vl)，加入RNA酶抑制劑 RNasinO. 5pl，隨機(jī)引物2pl， 65。C5分鐘后置冰浴上加入RNasin0. 5pl， 5X Buffer 4pl， dNTP 7|^1， Mo-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶1iLd后置37""C 1.5小時。加入終 止液后備用。
PCR反應(yīng)各取上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2pl作為模板，按上述PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增， p-actin引物作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。
6. Southern印跡雜交
(1) DNA酶解取各細(xì)胞基因組DNA各3(Vg，溶于17nl水中，力n2plSacI酶切緩沖液(10X),混勻后加入lpl Sacl (30U/>1) ， 37。C保溫過夜。
(2) 電泳及轉(zhuǎn)移上述酶解液5nl加2pl溴酚蘭上樣緩沖液后，上1%瓊 脂糖凝膠電泳，70V、 30mA電泳2 3小時。EB染色觀察是否酶解完全。如果酶 解不完全，則再加入lpl Sacl繼續(xù)保溫2 3小時使其完全酶解。然后按上述 條件進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將膠浸泡于變性液(1.5M NaCl， 0.5MNaOH)中40 分鐘，然后在中和液(1M Tris.Cl, 1.5M NaCl)中浸泡30分鐘。轉(zhuǎn)移至尼龍膜 方法按分子克隆手冊進(jìn)行。
(3) 探針制備以含細(xì)胞因子基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒為模板，按上 述PCR方法制備Neo及IL-2的DNA探針，dNTP用寶靈曼的PCR DIG labeling mix (No. 1585550)替代。雜交及檢測采用寶靈曼公司推薦方法進(jìn)行。
7. Northern印跡雜交
各細(xì)胞總RNA 50叫用于電泳。轉(zhuǎn)移至尼龍膜及雜交均參見Molecular Cloning。探針用a32 P-dATP.(購自Amersham公司)標(biāo)記。
8. 白細(xì)胞介素-2活性檢測
(1) 待測樣品稀釋用RPMI1640培養(yǎng)液將待測樣品進(jìn)行1:2、 1:4、 1:8、 1:16倍稀釋，加到96孔板中，每孔100pl。同時設(shè)立陽性(rlL-2標(biāo)準(zhǔn)品)及陰 性(培養(yǎng)液)對照，三個孔。
(2) 細(xì)胞培養(yǎng)取生長狀態(tài)良好的CTLL-2細(xì)胞，用PBS洗滌2 3次，配成 lxl()5細(xì)胞/ml，以100^1/孔加到待測樣品中，置于37C。 ， 5呢C02中培養(yǎng)16 24 小時。
(3) MTT染色從各孔中輕輕吸取100p-l培養(yǎng)上清，棄去。各孔中再加入10pl MTT溶液，繼續(xù)37C。中孵育4 6小時后，各孔加入lOO)nl酸化異丙醇，充分震 蕩吹打后靜置20分種。
(4) 比色用波長570nm的酶標(biāo)儀檢測。
(5) 結(jié)果判定IL-2活性是以細(xì)胞培養(yǎng)上清所具備的維持IL-2反應(yīng)細(xì)胞增 殖能力來確定的。IL-2的活性單位可通過與IL-2標(biāo)準(zhǔn)品對比而判定。方法為將 待測上清和IL-2標(biāo)準(zhǔn)品均稀釋成不同的倍數(shù)后觀察IL-2反應(yīng)細(xì)胞的增殖情況， 求出IL-2標(biāo)準(zhǔn)品組中反應(yīng)細(xì)胞最高增殖數(shù)50%時的稀釋倍數(shù)，同時求出待測標(biāo) 本相應(yīng)的稀釋度。兩個稀釋度倒數(shù)之比乘以IL-2標(biāo)準(zhǔn)品的活性單位，即是待測標(biāo)本的IL-2活性單位。
9.白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞種子細(xì)胞凍存
0. 25%胰酶消化白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞種子細(xì)胞后，移入5ml培 養(yǎng)液中，以800rpm離心5分鐘，將上清吸盡，按lx106細(xì)胞加lml凍存液(含 30%小牛血清及10%DMS0)，移入凍存管中。先放在4C。降溫30分鐘，然后移入氣 態(tài)的液氮中繼續(xù)降溫30分鐘，最后將凍存管放入液氮生物容器內(nèi)的液氮里保存。
第五步瘤苗的滅活
1. 細(xì)胞收集及洗滌
常規(guī)擴(kuò)增培養(yǎng)的白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞，用PBS洗漆兩次后， 以0.25%胰酶消化，收集lx108細(xì)胞至400ml離心瓶中，內(nèi)含400ml pH7.4無鈣、 鎂磷酸緩沖液(PBS)。以1000rpm離心10分鐘清洗，共清洗三次，最后將PBS 上清吸盡，按lx107細(xì)胞加lml凍存液，移入凍存管中。
2. 6()0)照射滅活白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞
在6GQ)治療儀(THERATRON780-C)下，按40G、 60G、 IOOG輻射強(qiáng)度分 別進(jìn)行照射，照射后的細(xì)胞命名為白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗 (HG-l/IL-2)。
3. HG-l/IL-2凍存
先放在4C。降溫30分鐘，然后移入氣態(tài)的液氮中繼續(xù)降溫30分鐘，最后將 凍存管放入液氮生物容器內(nèi)的液氮里保存。
4. HG-l/IL-2細(xì)胞存活率測定
將復(fù)蘇后的HG-l/IL-2，用5ml完全培養(yǎng)液懸浮。取4滴于載玻片上，用0.1% 臺酚蘭(溶于0.9%生理鹽水)染色2 3分鐘，觀察結(jié)果。細(xì)胞中有深藍(lán)色顆粒 浸潤即為死亡細(xì)胞，透亮的則為活細(xì)胞。4滴樣品各隨機(jī)取視野計數(shù)100個細(xì)胞， 細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/100。 4滴樣品的平均值即為某一天的活細(xì)胞數(shù)，將總細(xì)胞 數(shù)x存活率即得總活細(xì)胞數(shù)。
實施例1 細(xì)胞復(fù)蘇
從種子細(xì)胞庫的液氮生物容器內(nèi)取出1管細(xì)胞，立即放入40C。水浴中搖動融 化，將融化的細(xì)胞移到含5ml完全培養(yǎng)液的離心管中，以800rpm離心5分鐘。
13棄上清后，將細(xì)胞懸液移到含有37C。預(yù)溫完全培養(yǎng)液的瓶內(nèi)，置5%032培養(yǎng)箱 內(nèi)，37C。培養(yǎng)。
實施例2 細(xì)胞大量培養(yǎng)及收集
吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，用pH7.4無鈣、無鎂磷酸緩沖液洗瓶2次后，加入細(xì)胞消
化液，待細(xì)胞散開后，將消化的細(xì)胞懸液移入含有完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中(1x107
細(xì)胞/10ml培養(yǎng)液)。
將細(xì)胞懸液移至400ml無菌離心瓶內(nèi)，以1000rpm離心10分鐘，棄上清。
加入400ml pH7.4無鈣、無鎂磷酸緩沖液，使細(xì)胞均勻懸浮，以10G0rpm離心
IO分鐘，反復(fù)洗滌三次。
細(xì)胞冷凍保存液為98%右旋糖酐注射液及2M(W/V)人血白蛋白注射液。 根據(jù)細(xì)胞計數(shù)，按1x107細(xì)胞/lml凍存液/管計算，加入細(xì)胞冷凍保存液，
并使細(xì)胞均勻懸浮后分裝。管外貼有品名及批號。
將含細(xì)胞懸液的凍存管置60Co治療儀下，以100G輻射劑量進(jìn)行照射。 細(xì)胞制品冷凍保存管先放在化°降溫30分鐘，然后移入氣態(tài)的液氮中繼續(xù)
降溫30分鐘，最后將冷凍保存管移入液氮生物容器內(nèi)的液氮中保存。
權(quán)利要求
1.一種白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗的制備工藝，其特征在于，用基因工程技術(shù)，以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)，將人白細(xì)胞介素-2(IL-2)cDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入人胃癌細(xì)胞株MKN-45。
2. 如權(quán)利要求l所述，其特征在于，應(yīng)用61)0)照射使其滅活。
3. 如權(quán)利要求l所述，其特征在于，該細(xì)胞株表達(dá)HLA-A2分子。
4. 如權(quán)利要求l所述，其特征在于，該白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞有如下步驟得到用含白細(xì)胞介素-2的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒上清感染MKN-45得到白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞，應(yīng)用6QCo照射使其滅活。
5. 如權(quán)利要求l所述，其特征在于，該白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞疫苗可以用于治療胃癌。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種滅活的白細(xì)胞介素-2基因工程人胃癌細(xì)胞瘤苗的制備工藝。用基因工程技術(shù)，以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)，將人白細(xì)胞介素-2(IL-2)cDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入人胃癌細(xì)胞株MKN-45，經(jīng)⁶⁰Co照射滅活后制成，簡稱HG-1/IL-2。能分泌具有生物活性的IL-2，具有增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)能力，供臨床原發(fā)性胃癌患者使用。
文檔編號C12N13/00GK101560517SQ20081003602
公開日2009年10月21日 申請日期2008年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月14日
發(fā)明者錢關(guān)祥, 陳詩書 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院;上海新生源醫(yī)藥研究有限公司