專利名稱：改變稻米貯藏蛋白分布的表達(dá)載體及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體說，是涉及改變稻米貯藏蛋白分布 的表達(dá)載體及其制法和用途。
背景技術(shù)：
我國是一個(gè)人口眾多的發(fā)展中國家，為滿足我國不斷增長人口對(duì)農(nóng)作物的需 求，采用增加種植面積來達(dá)到增產(chǎn)的目的已經(jīng)不符合當(dāng)前我國的基本國策，而 通過在現(xiàn)有單產(chǎn)基礎(chǔ)上提高農(nóng)作物蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率獲得更有營養(yǎng)的農(nóng)作物，是 一種更為科學(xué)和經(jīng)濟(jì)的增產(chǎn)方式。水稻是我囯最重要的糧食作物，水稻的營養(yǎng)品質(zhì)與人民生活之間的關(guān)系最 為密切。水稻營養(yǎng)品質(zhì)主要指稻米蛋白質(zhì)和必需氨基酸含量。人體對(duì)于蛋白質(zhì) 的攝取主要以直接或間接方式從植物種子中獲得。中國是水稻種植和消費(fèi)大國， 對(duì)于這樣一個(gè)以稻米為主食的國家來說，許多地區(qū)的人們從植物種子中攝取的 蛋白質(zhì)較大部分來自于稻米。目前常規(guī)水稻栽培品種稻米總蛋白質(zhì)含量較低，一般為7%~9°/。。張瑞品等人認(rèn)為在以稻米為主食的地區(qū)，精米提供了至少40% 的蛋白質(zhì)，如果把我國稻米蛋白質(zhì)含量在現(xiàn)有基礎(chǔ)上再提高1%~2%,無疑對(duì)改 善我國人民的營養(yǎng)水平將是很大的貢獻(xiàn)(張瑞品等，水稻品質(zhì)育種，農(nóng)作物品 質(zhì)育種(劉后利主編)，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2001， pp: 27, 37)。對(duì)于有些 不能食用動(dòng)物蛋白的特殊疾病患者，高蛋白稻米對(duì)這樣的人群更為重要。水稻高蛋白育種對(duì)于動(dòng)物、水稻早期自身的生長以及環(huán)境等多方面都會(huì)帶 來一定的益處。以高蛋白水稻作為伺養(yǎng)家畜的飼料，減少和避免使用動(dòng)物飼料， 將更有助于家畜的生長，也可改變我國每年需進(jìn)口玉米、豆類飼料而消耗大量 外匯的狀況。稻米的貯藏蛋白在種子萌動(dòng)發(fā)芽中是一種氮源，具有非常重要的 作用。如果以高蛋白水稻稻谷作為種子，內(nèi)源氮素豐富，就有可能減少早期氮 肥的使用，從而將會(huì)降低肥料對(duì)環(huán)境的污染以及降低種植成本。種植高蛋白水 稻還可提高單位土地面積蛋白質(zhì)生產(chǎn)量，提高土地的生產(chǎn)率。水稻稻米蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值，不僅受含量的影響，更重要取決于組成它的各種必需氨基酸之間的平衡。在水稻稻米蛋白質(zhì)中，賴氨酸為第一限制性氨基 酸，蘇氨酸為第二限制氨基酸，甲硫氨酸、色氨酸僅次于前兩者。因此，這四 種必需氨基酸的含量的高低決定了稻米所含蛋白質(zhì)品質(zhì)的優(yōu)劣(張瑞品等，水稻品質(zhì)育種，農(nóng)作物品質(zhì)育種(劉后利主編)，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2001, pp: 27, 37)。在19世紀(jì)末，著名的植物蛋白化學(xué)之父TB Osborne基于種子蛋白 的特性提出了植物種子蛋白質(zhì)分類方法。根據(jù)溶解度不同，可將種子蛋白分為 四類溶于水的清蛋白，溶于稀鹽溶液的球蛋白，溶于醇溶液的醇溶蛋白和溶 于稀酸或稀堿溶液的谷蛋白。作為水稻種子重要的貯藏蛋白，谷蛋白在水稻種 子缺乏的重要氨基酸含量方面相對(duì)較好(趙則勝等，中國特種稻，上海上海 科學(xué)技術(shù)出版社.1995, pp: 149)。目前較多研究者都認(rèn)為水稻谷蛋白(Glutelin) 和豆球蛋白(Legumin)之間有相似之處，具有類似的分子結(jié)構(gòu)和類似的翻譯后 力口工程序(Shotwell， Oat globulins. In. Shewry PR, Casey R， eds. Seed proteins. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1999:pp389-400; Takaiwa等，Rich globulins. In. Shewry PR, Casey R，eds.Seed proteins. Dordrecht:Kluwer Academic Publishers, 1999, pp:401~405)，以及兩者的氨基酸序列具有較高的同源性。 趙文明研究認(rèn)為(實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1998， 21(2):239~243 ),在水稻谷蛋白P亞基 與豆球蛋白(Legumin) P亞基的氨基酸順序中，有47%的氨基酸順序完全相同。 這表明，水稻谷蛋白還是一個(gè)比較優(yōu)質(zhì)的貯藏蛋白。在20世紀(jì)80年代人們?cè)趯?duì)稻米蛋白質(zhì)分布的研究中發(fā)現(xiàn)，水稻胚乳中存 在兩種蛋白體，PB-I和PB-II。 PB-I含醇溶蛋白，不能被人體消化利用，而 PB-II主要含有谷蛋白和球蛋白，易于被消化。這兩種蛋白體主要富集于近糊粉 層的周圍，很少在米粒的中心區(qū)域出現(xiàn)。我們實(shí)驗(yàn)室選取開花后20天(谷蛋白 表達(dá)已過高峰時(shí)期)未成熟的水稻種子，在經(jīng)過常規(guī)制樣操作后釆用電鏡觀察， 結(jié)果也顯示蛋白體主要分布于稻米的周圍。張憲銀等(作物學(xué)報(bào)，2002, 28( 1 ): 110-114)也曾對(duì)水稻谷蛋白C /7基因啟動(dòng)子進(jìn)行研究，從他們的報(bào)道顯示由 GW啟動(dòng)子引導(dǎo)的g^報(bào)告基因也只在稻米的周邊顯色，這說明GW谷蛋白只在 稻米的周邊積累。在糙米加工成精米時(shí)，稻米中的大量蛋白質(zhì)會(huì)因此而流失。眾所周知，啟動(dòng)子是基因表達(dá)的重要控制元件。從目前利用基因工程改良 水稻稻米蛋白質(zhì)含量及質(zhì)量的現(xiàn)有報(bào)道研究分析，人們都是釆用水稻的谷蛋白 基因啟動(dòng)子，如GW或G/"5-7等與豆科作物貯藏蛋白基因融合構(gòu)成表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化水稻(Zhenwei等，Plant Physiol. 1995， 109:777 ~ 786; Sindhu等，Plant Science,1997， 130(2): 189 ~ 196; Tomoyuki等，Plant Physiol. 1999, 120: 1063 — 1073; Keiko等，Biosci Biotechnol Biochem, 1999, 63(2): 314 ~ 318 );最近還有報(bào)道將 Gfl啟動(dòng)子與來自于四棱豆(尸sop/K7aw7 ws fe/rago o/o^s丄.)小分子量高賴氨酸 基因(LRPcDNA)融合構(gòu)成表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻(唐俐等，作物學(xué)報(bào)，2006， 32 (8): 1248- 1251 )。但由于如上所說的水稻谷蛋白基因的產(chǎn)物都主要在稻米的 近糊粉層周圍表達(dá)，所以，利用谷蛋白(^/或G/"5-7等啟動(dòng)子與大豆球蛋白基 因融合構(gòu)建表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)基因操作導(dǎo)入水稻也只能達(dá)到提高稻米近糊粉層 周圍的蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量。而且目前這些研究大多都是將目的基因和抗性選擇 標(biāo)記基因構(gòu)建在一個(gè)表達(dá)載體上，不利于轉(zhuǎn)基因后代的生產(chǎn)應(yīng)用。為了改變稻米儲(chǔ)藏蛋白的分布，必須更換現(xiàn)有水稻中谷蛋白基因的啟動(dòng)子， 將它替換成在常規(guī)稻米中心部位能夠表達(dá)的基因，如ADPG焦磷酸化酶基因 4《、可溶性淀粉合成酶基因sm、淀粉分支酶基因Ae或是顆粒凝結(jié)型淀粉合 成酶(GBSSI )，即蠟質(zhì)蛋白基因wo^等的啟動(dòng)子。從目前已報(bào)道的文獻(xiàn)中，蠟質(zhì)蛋白基因(mz^)啟動(dòng)子多用于引導(dǎo)蠟質(zhì)基 因反義片段降低稻米直鏈淀粉含量(ShimadaH，etal， TheorAppl Genet， 1993， 86(6): 665 — 672; TeradaR， etal， Plant Cell Physiol, 2000, 41(7): 881 —888; 王新其等，上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002， 18(增刊)69~73;陳秀花等，科學(xué)通報(bào)， 2002, 47 (9): 684 ~ 688;劉巧泉等，Transgenic Res, 2003, 12: 71 ~82;李 建粵等，科學(xué)通報(bào)，2004， 49 (24): 2556~2561;沈革志等，植物生理與分子 生物學(xué)學(xué)報(bào)，2004, 30 (6): 637-643)，尚未有利用該啟動(dòng)子在稻米中心部位 表達(dá)的特性來改變水稻儲(chǔ)藏蛋白表達(dá)位點(diǎn)的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種改變稻米儲(chǔ)藏蛋白分布的表達(dá)載體 及其制法和用途，以克服現(xiàn)有技術(shù)中利用水稻谷蛋白基因啟動(dòng)子與豆科作物貯 藏蛋白基因或其他小分子量非貯藏蛋白基因融合構(gòu)成表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻，獲得 的轉(zhuǎn)化子及其后代稻米只能提高稻米近糊粉層周圍蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量的缺陷。本發(fā)明的改變稻米貯藏蛋白分布的表達(dá)載體，包括基因啟動(dòng)子、儲(chǔ)藏蛋白基 因片段、終止子及內(nèi)切酶敏感序列，其特征在于，所述基因啟動(dòng)子為在稻米中 心部位能夠表達(dá)的基因啟動(dòng)子。所述基因啟動(dòng)子優(yōu)選水稻蠟質(zhì)基因啟動(dòng)子。所述儲(chǔ)藏蛋白基因片段優(yōu)選水稻谷蛋白基因片段或谷蛋白基因cDNA編碼 序列或大豆球蛋白基因的cDNA編碼序列片段。所述水稻谷蛋白基因優(yōu)選GW谷蛋白全基因或GW谷蛋白基因的cDNA編 碼序列。所述大豆球蛋白基因優(yōu)選qy7球蛋白基因的cDNA編碼序列。 所述終止子優(yōu)選CaMV 35S基因終止子或Nos基因終止子。 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需通過特殊的試驗(yàn)即可知道，所述的水稻谷蛋白 Gf/全基因或者G,/谷蛋白基因的cDNA編碼序列可以用一系列與GenBank號(hào) Y00687基因相同或是和Y00687相類似的基因，如谷蛋白B亞家族成員來替代； 所述的大豆球蛋白Gy7基因的cDNA編碼序列可以指與GenBank號(hào)AF319777 同源的基因。本發(fā)明的改變稻米貯藏蛋白分布的表達(dá)載體的制備方法，包括如下步驟1) 釆用PCR方法擴(kuò)增基因啟動(dòng)子和儲(chǔ)藏蛋白基因片段；2) 將基因啟動(dòng)子和儲(chǔ)藏蛋白基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與終止子及其他載體 序列連接，即得本發(fā)明的表達(dá)載體。在所述基因啟動(dòng)子下游可有信號(hào)肽編碼序列，所述信號(hào)肽編碼序列優(yōu)選水稻 儲(chǔ)藏蛋白基因信號(hào)肽編碼序列。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需通過特殊的試驗(yàn)即可知道，除了采用PCR方法 獲得基因啟動(dòng)子和水稻谷蛋白基因或者大豆球蛋白基因片段之外，還可以通過 制備好的水稻、大豆基因組或cDNA文庫篩選獲得所需的目標(biāo)DNA片段。這些 獲得目的基因片段的不同方法只是制備本發(fā)明所說的表達(dá)載體的不同途徑，并 不影響本發(fā)明利用在稻米中心表達(dá)的基因啟動(dòng)子定位稻米中不同儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)基 因表達(dá)部位的構(gòu)思本身。本發(fā)明的改變稻米儲(chǔ)藏蛋白分布的表達(dá)載體可應(yīng)用于轉(zhuǎn)化水稻，以獲取稻米 中心部位蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量改變的新品種。通過表達(dá)載體中基因啟動(dòng)子的引導(dǎo)，目的基因即蛋白質(zhì)編碼基因序列可以 在稻米中心部位表達(dá)，變換蛋白質(zhì)編碼基因序列，如換成水稻其他谷蛋白或球 蛋白基因，即可以使稻米中心不同種類蛋白質(zhì)含量有所變化，也可以提高可溶 性蛋白質(zhì)比例以使可吸收蛋白質(zhì)總量增加，進(jìn)而提高稻米營養(yǎng)品質(zhì)；如換成賴 氨酸、蘇氨酸等人體必需氨基酸含量或比例較高的蛋白質(zhì)編碼基因，則可以在 氨基酸組成上改良稻米營養(yǎng)品質(zhì)，上述內(nèi)容均屬于本發(fā)明技術(shù)構(gòu)思的等同變換。本發(fā)明的改變稻米貯藏蛋白分布的表達(dá)載體還可應(yīng)用于轉(zhuǎn)化小麥、大麥、玉 米等其他禾本科植物以獲取新品種。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下1) 利用雜交等常規(guī)方法培育高蛋白水稻，稻谷產(chǎn)量往往與稻米蛋白質(zhì)含量 呈反相關(guān)關(guān)系，而本發(fā)明提供的改變稻米儲(chǔ)藏蛋白分布的表達(dá)載體可利用轉(zhuǎn)基 因技術(shù)將水稻谷蛋白基因或大豆球蛋白基因?qū)胨荆苊饬怂镜群坦阮愖?物的品質(zhì)改良會(huì)影響產(chǎn)量下降的缺陷；2) 現(xiàn)有技術(shù)只能提高稻米近糊粉層周圍蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量，在糙米加工成精米時(shí)，稻米中的大量蛋白質(zhì)會(huì)因此而流失，而本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻，獲得稻米蛋白質(zhì)表達(dá)于米粒中心的特殊效果，克服了原有技術(shù)上的不足；3) 本發(fā)明的改變稻米儲(chǔ)藏蛋白分布的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化獲得的水稻新品質(zhì)，其后代精米蛋白質(zhì)含量在未轉(zhuǎn)化的對(duì)照精米蛋白質(zhì)含量的基礎(chǔ)上提高至少腦；4) 本發(fā)明構(gòu)建的pl301-Wx-GWS-(^7或pl300-Wx—Gf/S-Gy7表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化水稻，可使后代精米蛋白質(zhì)含量比未轉(zhuǎn)化的對(duì)照提高10%同時(shí)，其精米賴氨 酸含量也比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ站滋岣?0%;5) 本發(fā)明可為開展小麥、玉米、大麥等重要農(nóng)作物營養(yǎng)品質(zhì)改良研究奠定 基礎(chǔ)。本文所用的術(shù)語"水稻GW基因"是指編碼能夠溶于稀酸或稀堿溶液的水稻 谷蛋白A亞家族中的成員之一。本文所用的術(shù)語"大豆C^7基因"是指編碼大豆種子貯藏蛋白中沉降值為11S 的球蛋白(Glycinin)家族之中的一類球蛋白的基因，比如GenBank號(hào)為AF319776 的全基因或者GenBank號(hào)為AF319777的mRNA序列。本文所用的術(shù)語"PCR方法"是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的基因擴(kuò)增方法。本文所用的術(shù)語"CaMV 35S基因終止子"是指來自于花椰菜花葉病毒的35S 終止子。本文所用的術(shù)語"Nos基因終止子"是指來自于胭脂堿合成酶基因的終止子。 本文所用的術(shù)語"中間載體"是指在目標(biāo)載體制備過程中獲得的載體。 本文所用的術(shù)語"T-DNA"是指根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中可轉(zhuǎn)移并整合到寄主植 物細(xì)胞染色體上去的特定DNA片段，亦即一種轉(zhuǎn)位單元。


圖1是實(shí)施例1構(gòu)建的表達(dá)載體的T-DNA結(jié)構(gòu)圖，圖中Wx-pro為水稻 w哼基因啟動(dòng)子；Intl為水稻waxy基因第一內(nèi)含子；G〃為水稻谷蛋白基因； GWcDNA為水稻谷蛋白GW基因編碼序列；LB、 RB為T-DNA的左右邊界； Terminator指基因終止子；35S-pro、 35S-ter為CaMV 35S基因啟動(dòng)子和終止子； /^為潮霉素抗性基因；g"s為|3-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Nos-ter為Nos基因終 止子；圖2是pCAMBIA1301質(zhì)粒的T-DNA結(jié)構(gòu)圖，圖中LB、 RB為T-DNA的 左右邊界；35S-pro、 35S-ter為CaMV35S基因啟動(dòng)子和終止子；/z/^為潮霉素抗 性基因；gw為P-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Xh為J^oI的縮寫；Bs為5wXI的縮 寫；E為五co及I的縮寫；Sa為&cl的縮寫；K為《p"I的縮寫；S為的縮 寫；B為BamHI的縮寫；X為^&al的縮寫；Sal為5WI的縮寫；P為尸Wl的縮 寫；H為/Z/m/in的縮寫；圖3是pCAMBIA1300質(zhì)粒的T-DNA結(jié)構(gòu)圖，圖中LB、 RB為T-DNA的 左右邊界；35S-pro、 35S-ter為CaMV35S基因啟動(dòng)子和終止子；/^f為潮霉素抗 性基因；Xh為屈ol的縮寫；Bs為萬wXI的縮寫；E為5co及I的縮寫；Sa為 的縮寫；K為AT; "I的縮寫；S為Sm"I的縮寫；B為5awffl的縮寫；X為^&al 的縮寫；Sal為S"/I的縮寫；P為尸wl的縮寫；H為i/z'"dn的縮寫；圖4是實(shí)施例2構(gòu)建的表達(dá)載體的T-DNA結(jié)構(gòu)圖，圖中LB、 RB為T-DNA 的左右邊界；Wx-pro為水稻w，基因啟動(dòng)子；Intl為水稻woxy基因第一內(nèi)含 子；GW為水稻谷蛋白基因；GWcDNA為水稻谷蛋白GW基因編碼序列； Terminator指基因終止子；圖5是實(shí)施例3構(gòu)建的表達(dá)載體的T-DNA結(jié)構(gòu)圖，圖中LB、 RB為T-DNA 的左右邊界；Wx-pro為水稻wa^基因啟動(dòng)子；Intl為水稻waxy基因第一內(nèi)含 子；6WS為水稻谷蛋白GW基因信號(hào)肽；C /7cDNA為大豆球蛋白G/7基因編 碼序列；Terminator指基因終止子；圖6是實(shí)施例4構(gòu)建的表達(dá)載體的T-DNA結(jié)構(gòu)圖，圖中Wx-pro為水稻 waxy基因啟動(dòng)子；Intl為水稻wajty基因第一內(nèi)含子；Q/S為水稻谷蛋白 基因信號(hào)肽；G/7cDNA為大豆球蛋白G/7基因編碼序歹'J; LB、 RB為T-DNA的 左右邊界；Terminator指基因終止子；35S-pro、 35S-ter為CaMV 35S基因啟動(dòng) 子和終止子；/2^為潮霉素抗性基因；ws為P-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Nos-ter為Nos基因終止子。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。構(gòu)建表達(dá)載體和水稻轉(zhuǎn)化操作中涉及的常規(guī)PCR擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶酶切 和連接、根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)化等方法主要參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(薩姆布魯 克J等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)，科學(xué)出版社，1992)。實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例l本實(shí)施例是為了說明構(gòu)建含有抗性標(biāo)記基因、由蠟質(zhì)基因啟動(dòng)子引導(dǎo)的水 稻谷蛋白基因表達(dá)載體的方法及所獲載體的結(jié)構(gòu)組成，構(gòu)建過程如下a) 在pCAMBIA1301 (簡稱pl301，來自于中科院上海植物生理與生態(tài)研究 所王宗陽研究員)質(zhì)粒載體(見圖2所示)NOS終止子兩端設(shè)計(jì)PCR引物，上 游和下游都引入///^/111酶切位點(diǎn)；將PCR產(chǎn)物與T載體連接得到T-1載體，并 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；然后用///"dni對(duì)T-l質(zhì)粒進(jìn)行酶切，電泳回收小片 段，將該小片段與pCAMBIA1301質(zhì)粒///m/ni酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到 pCAMBIA1301-NOS載體(簡稱pl301-NOS),轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；釆用 PCR、酶切及測序鑒定，選擇正向連接的類型；b) 參照GenBank公布的基因序列(GenBank: Y00687 ),分別在GW 基因編碼區(qū)起始點(diǎn)ATG和3， UTR設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物含有TVcoI酶切位點(diǎn)， 下游引物引入i^I酶切位點(diǎn)，以栽培水稻葉片DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得 GW基因全序列；或取水稻開花后約15天的胚乳進(jìn)行mRNA提取，利用RT-PCR 技術(shù)獲得GWcDNA;將PCR產(chǎn)物與靠近酶切位點(diǎn)上游帶有酶切位 點(diǎn)的T載體連接得到GW-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；通過酶切、PCR 及測序鑒定Q7-T載體；c) 從
發(fā)明者周永國, 偉 張, 徐申中, 李建粵, 沈忠偉, 王幻予, 石少華, 高菊芳 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)