專利名稱：：肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達載體、工程菌、制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及基因工程領域，特別涉及肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達載體、工程菌、制備方法及其應用。
背景技術：
：肺吸蟲病(Paragonimiasis)是一種常見和重要的人獸共患寄生蟲病，散在流行于我國10多個省、市、自治區(qū)，致病蟲種主要為衛(wèi)氏并殖吸蟲(Paragonimuswestermani)和斯氏貍殖吸蟲(Pagumogonimusskrjabini)，尤其斯氏貍殖吸蟲作為僅在我國流行的一種吸蟲，其在人體內(nèi)不能發(fā)育成無，而以幼蟲在人體內(nèi)移行、竄擾，常常引起游走性皮下包塊或結節(jié)，腦占位性病變和內(nèi)臟損傷等肺外型寄生蟲表現(xiàn)，造成多器官、組織的損害。肺吸蟲病由于臨床癥狀不典型，易與其他疾病混淆，病原學檢查又難以發(fā)現(xiàn)蟲卵、蟲體，目前主要采用免疫學方法進行確診，但現(xiàn)有的免疫學方法存在一些缺陷，如診斷抗原主要為蟲體粗抗原，易與其它吸蟲出現(xiàn)交叉反應；無療效考核作用；各實驗室采用的診斷抗原標準不一致，無法對各實驗室的檢測結果進行比較；天然抗原的獲得日益困難等，因此，迫切需要研制新的肺吸蟲病免疫診斷抗原。半胱氨酸蛋白酶(Cysteineprotease)是多種寄生蟲分泌、排泄的一種蛋白水解酶，也是免疫優(yōu)勢抗原，并具有明顯的種、屬特異性。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，斯氏貍殖吸蟲的半胱氨酸蛋白酶對宿主具有免疫原性和反應性，能誘導免疫反應，可作為肺吸蟲病的免疫"^斷抗原；因該蛋白酶的免疫組化反應呈現(xiàn)蟲體的腸道、排泄嚢內(nèi)，其編碼基因雜交定位在成蟲的腸壁、體壁，故將該蛋白'酶又稱為肺吸蟲排泄分泌蛋白(Excretory-secretoryprotein,ESP)。由于天然肺吸蟲ESP蛋白來源有限，難以大規(guī)模生產(chǎn)，不能滿足臨床免疫診斷的需要，而利用分子生物學手段、技術對肺吸蟲ESP蛋白進行cDM克隆、構建重組表達載體并誘導表達是解決此問題的一個重要方法，因此，本領域迫切需要開發(fā)能夠高效表達肺吸蟲ESP蛋白的重組表達載體、工程菌和制備方法。
發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，為了能夠高效表達肺吸蟲ESP蛋白，并且表達穩(wěn)定、表達盧物免疫反應性高，本發(fā)明的目的之一在于提供一種肺吸蟲ESP蛋白的重組表達載體，含有肺吸蟲ESP蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示，表達載體為pQE-80L。本發(fā)明的目的之二在于提供一種肺吸蟲ESP蛋白的工程菌，含有所述肺吸蟲ESP蛋白的重組表達載體，宿主菌為大腸桿菌。進一步，所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)菌^f朱。本發(fā)明的目的之三在于提供利用所述重組表達載體制備肺吸蟲ESP蛋白的方法，包括以下步驟a.工程菌的構建將所述肺吸蟲ESP蛋白的重組表達載體轉化入宿主菌感受態(tài)細胞，用含氨芐青霉素的LB平板進行篩選培養(yǎng)，獲得陽性克隆菌，即工程菌；b.工程菌的培養(yǎng)將步驟a所得工程菌接種于含氨千青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37'C振搖過夜；c.工程菌的誘導表達取步驟b過夜培養(yǎng)菌液，按1:100的比例接種于含氨千青霉素的液體'LB培養(yǎng)基中，于溫度37。C振搖培養(yǎng)1小時，加入異丙基石克代半乳糖苷即IPTG誘導劑至終濃度為200pmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5-6小時，收集菌液，離心，去除上清液，細菌沉淀用磷酸鹽緩沖液即PBS洗滌3次后，用5倍體積的細菌裂解液重懸，于水浴下超聲，取超聲后的勻漿物離心，收集上清液；d.表達產(chǎn)物的純化取步驟c收集的上清液，利用重組表達載體在表達蛋白氨基端引入的6個組氨酸標簽，以Ni2+-NTA樹脂親和層析法進行純化，即得肺吸蟲ESP蛋白，置4"C保存。進一步，所述步驟a使用的宿主菌為大腸桿菌；進一步，所述步驟a使用的宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)菌抹。本發(fā)明的目的之四在于提供利用所述重組表達載體制得的肺吸蟲ESP蛋白在制備肺吸蟲病檢測試劑或檢測裝置中的應用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明構建的肺吸蟲ESP蛋白的重組表達載體和工程菌，具有表達量高，表達穩(wěn)定的優(yōu)點；利用本發(fā)明的重組表達載體制備肺吸蟲ESP蛋白的方法，蛋白收率高且免疫反應性高；用制得的肺吸蟲ESP蛋白免疫動物，可制備特異性抗體，還可進一步制備肺吸蟲病檢測試劑或檢測裝置；采用肺吸蟲ESP蛋白和其多克隆抗體制得的肺吸蟲病檢測試劑盒和檢測裝置，具有高度特異、敏感性，并具有療效考核作用，可以準確、快速、簡便地進行肺吸蟲病的診斷與鑒別診斷、以及療效考核，具有重要的臨床應用價值。本發(fā)明的其他優(yōu)點、目標，和特征在某種程度上將在隨后的說明書中進行闡述，并且在某種程度上，基于對下文的考察研究對本領域技術人員而言將是顯而易見的，或者可以從本發(fā)明的實踐中得到教導。本發(fā)明的目標和其他優(yōu)點可以通過下面的說明書和權利要求書來實現(xiàn)和獲得。為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合附圖和優(yōu)選實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述，其中圖1為肺吸蟲ESP蛋白編碼基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖2為雙酶切陽性克隆質粒的瓊脂糖凝膠電泳圖3為重組表達載體pQE-80L/ESP的定向構建流程圖4為大腸桿菌誘導表達產(chǎn)物的SDS-PAGE圖。具體實施例方式本發(fā)明采用分子生物學方法，從斯氏貍殖吸蟲成蟲中提取蟲體總RNA，通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)獲得肺吸蟲ESP蛋白的編碼DNA序列，將此DNA序列克隆入原核表達載體中，構建重組表達載體，并轉化入宿主菌中，經(jīng)過反復篩選和表達量檢測，獲得高效穩(wěn)定表達肺吸蟲ESP蛋白的工程菌，為肺吸蟲ESP蛋白的高效大規(guī)模生產(chǎn)提供了基礎。許多表達載體可用于肺吸蟲ESP蛋白的原核表達，如pET22b(+)、PinPointXa-1T、pQE-80L等。本發(fā)明通過比較研究發(fā)現(xiàn)，pQE-80L是一種特別優(yōu)選的載體。pQE-80L屬于pDS質粒家族，來源于pDS56/RBSII和pDS781/RBSII-DHFRS質粒，是基于噬菌體T5啟動子的轉錄翻譯系統(tǒng)，帶有兩個乳糖操縱子識別序列，可以增加乳糖阻滯蛋白的結合從而保證功能強大的T5啟動子受阻滯調(diào)控,.避免菌體生長前期高表達對菌體生長的影響，同時減少菌體蛋白酶對目的蛋白的降解，從而大大提高目的蛋白的表達量，特別適宜于對宿主菌有毒性的目的蛋白的表達；pQE-80L還可使表達蛋白的氨基端帶上6個組氨酸標簽(His-tag),利用6xHis-tag與N廣的高度親和力，方便采用Ni2+-NAT樹脂親和層析法對目的蛋白進行純化，使其純度達90%以上，同時也利于用抗His的抗體進行鑒定?？捎糜跇嫿ū景l(fā)明工程菌的宿主菌沒有特別限制，4戈表性例子包括DH5ct、JM109、M15、BL21等多種大腸桿菌。本發(fā)明通過比較研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌BL21(DE3)菌林是特別優(yōu)選的宿主菌。BL21(DE3)大腸桿菌為Lon蛋白酶和PmpT蛋白酶缺陷型，在進行表達產(chǎn)物的純化時可以保持目的蛋白的穩(wěn)定，使其不被降解。利用本發(fā)明的重組表達載體構建工程菌，所得工程菌可用常規(guī)方法進行培養(yǎng)及誘導表達，制備肺吸蟲ESP蛋白。本發(fā)明通過系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)條件下，誘導溫度和時間對肺吸蟲ESP蛋白的表達影響最大，特別優(yōu)選的誘導表達方法為采用含氨爺青霉素的液體LB培養(yǎng)基，于溫度37。C振搖培養(yǎng)1小時后，再加入IPTG誘導劑至終濃度為200nniol/L，并繼續(xù)培養(yǎng)5-6小時。采用此方法制備肺吸蟲ESP蛋白，蛋白表達量可由常規(guī)培養(yǎng)條件下的4%提高到20%(P<0.05),在擴大培養(yǎng)的條件下，產(chǎn)量將進一步提高。以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。應當理解，優(yōu)選實施例僅為了說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。(一)肺吸蟲ESP蛋白的重組表達載體的構建1、引物的設計與合成根據(jù)衛(wèi)氏并殖吸蟲以及其它寄生蟲半胱氨酸蛋白酶的保守氨基酸序列，設計并合成如下兼并引物(兼并引物是代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物)Pl:5'-tea(ag)gg(agct)ca(ag)tg(ct)gg(agct)tc(agct)tg(ct)tgg-3'(SEQIDNo.3);P2:5'_cca(ag)ct(ag)tt(ct)tt(agct)ac(ag)ateca(ag)ta-3'(SEQIDNo.4);上述引物序列括號內(nèi)為該位點不同的堿基序列；2、肺吸蟲ESP蛋白編碼基因的RT-PCR擴增取2條斯氏貍殖吸蟲成蟲(共60mg),經(jīng)體積百分濃度為0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液洗凈后，置勻漿器內(nèi)，立即加入Tripure試劑(美國Roche公司)2ml于水浴下勻漿，按照Tripure試劑說明提取蟲體總RNA;采用RT-PCR試劑盒(北京博大泰克生物基因技術有限責任公司)進行逆轉錄及cDNA擴增逆轉錄制備cDNA，以提取的蟲體總RNA為才莫板，以Oligo(dT)"為逆轉錄引物，反應體系為濃度為0.1的總RNA10pl、濃度為0.5ixg/pl的01igo(dT)161pl、5x畫LV酶反應緩沖液4pl、濃度為10mmol/L的dNTPs1Hl、醒LV逆轉錄酶200U、Rnasin20U、雙蒸水補充至總體積為20jil;反應條件為37。C水浴2小時，95。C變性5分鐘終止反應；PCR擴增雙鏈cDNA,以逆轉錄制備的cDNA為才莫板，以步驟1所述兼并引物Pl、P2為上下游引物，反應體系為10xPCR反應緩沖液5pl、濃度為10mmol/L的dNTPs1>1、10倍稀釋的模板4pl、濃度為10nmol/L的上、下游引物各2pl、TaqDNA聚合酶3U、濃度為25mmol/L的MgCl2溶液2pl、雙蒸水補充至總體積為50反應條件為94。C預變性5分鐘，然后94'C變性1分鐘、43t:退火2分鐘、72。C延伸2分鐘，共45個循環(huán)，最后72。C延伸5分鐘；PCR結束后，采用質量百分濃度為1°/。的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結果如圖1所示，其中1泳道為PCR分子量標準，2泳道為PCR產(chǎn)物，從圖可知，在約50Gbp的位置出現(xiàn)一條特異性DNA條帶，與理論預測值相符；采用SilverBeadsDNA膠回收試劑盒(上海生物工程技術服務有限公司)對PCR產(chǎn)物進行純化，按照試劑盒說明操作，選擇約500bp的目的片段進行切膠回收純化；3、肺吸蟲ESP蛋白編碼基因的克隆和陽性克隆質粒的篩選將步驟2所得純化的目的片段與pMD18-T載體(寶生物工程(大連)有限公司)進行TA連接，連接方法為濃度為10ng/Vl的目的片段5pl、濃度為50ng/pl的pQE-80L載體1pl、10x緩沖液1^1、T4DM連接酶200U、雙蒸水補充至總體積為10置溫度16。C孵育8小時，構建重組克隆載體pMD18-T/ESP;將重組克隆載體pMD18-T/ESP轉化入CaClr法制備的DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞，轉化方法為將濃度為10ng/pl的重組克隆載體5pl加入到細胞密度為2x109的感受態(tài)細胞100pl中，冰浴30分鐘，42。C水浴熱^f木克90秒，立即冰浴2分鐘，再加入液體LB培養(yǎng)基，于溫度37。C，150r/min振搖l小時，制得轉化細胞；取轉化細胞涂布于藍白斑篩選培養(yǎng)基平板上，于溫度37。C倒置過夜，從平板上隨機挑取數(shù)個白斑，接種到含氨節(jié)青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37。C、150r/min振搖過夜，堿裂解法小量提取質粒，用EcoRI、HindIII雙酶切和PCR法鑒定陽性克隆質粒，酶切方法為濃度為300ng/^il的陽性克隆質粒lO[il、濃度為20U/pl的EcoRI和HindIII內(nèi)切酶各lnl、10x緩沖液3pl、雙蒸水補充至總體積為30pl，置溫度37。C孵育4小時，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示兩條DNA帶，其中一條約500bp,與目的片段大小一致；以經(jīng)雙酶切鑒定為陽性克隆的質粒為模^1，釆用兼并引物P1、P2為上下游引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，獲得一條約500bp的條帶，與步驟2所得PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的條帶大小一致；4、肺吸蟲ESP蛋白編碼基因的序列測定取步驟3所得陽性克隆質粒，委托上海生物工程技術服務有限公司測定插入片段的序列，獲得495bp的cDNA序列(如SEQIDNo.1所示)，在Genbank中進行注冊，登錄號為AY083923;根據(jù)所得cDNA序列，用DNASIS程序推導出其編碼的氨基酸序列(如SEQIDNo.2所示)，并與相關蟲種的半胱氨酸蛋白酶進行氨基酸序列同源性比較分析，分析結果顯示，該序列與相關蟲種的半胱氨酸蛋白酶存在較高同源性，組成半胱氨酸催化三聯(lián)體的半胱氨酸、組氨酸和天冬酰胺殘基高度保守；5、肺吸蟲ESP蛋白編碼基因的PCR擴增才艮據(jù)步驟4所得cDNA序列，結合pQE-80L表達載體上的內(nèi)切酶位點，設計如下特異性引物P3:5，-cgggatcccaaggtxaatgtggctc-3，(SEQIDNo.5)，下劃線部分為BamHI酶切位點；P4:5，-ccaagcttgattgttaaaaatagUgg-3，(SEQIDNo.6),下劃線部分為HindIII酶切位點；以步驟3所得陽性克隆質粒為模板，以特異性引物P3、P4為上下游引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后進行切膠回收純化，再按照步驟3所述方法進行克隆和陽性克隆質粒的篩選，陽性克隆質粒經(jīng)測序-驗證克隆序列的順序正確性；6、肺吸蟲ESP蛋白的重組表達載體的構建將步驟5經(jīng)測序鑒定的陽性克隆質粒用BamHI和HindIII進行雙酶切，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2所示，其中1泳道為酶切產(chǎn)物，2泳道為DNA分子量標準，從圖可見兩條DNA帶，其中一條約500bp,與目的片段大小一致；將此DNA片段進行切膠回收純化，并與按相同方法經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切消化后的pQE-80L載體進行TA連接，定向構建重組表達載體pQE-80L/ESP，其構建流程如圖3所示。(二)肺吸蟲ESP蛋白的工程菌的構建取(一)構建的肺吸蟲ESP蛋白的重組表達載體pQE-80L/ESP，轉化入CaCl2法制備的BL21(DE3)大腸桿菌(美國Novagen公司)感受態(tài)細胞，并涂布于含氨千青霉素的LB平板上，于溫度37。C正置1小時，倒置過夜，從LB平板上隨機挑取3個白色菌落，接種于液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37°C、150r/min振搖過夜，提取質粒，以質粒為模板，采用特異性引物P3、P4為上下游引物進行PCR擴增，以瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定有無插入片4爻后，再通過序列測定確保插入方向正確，測序結果表明實驗獲得的質粒為含有肺吸蟲ESP蛋白編碼基因的重組表達載體pQE-80L/ESP,則實驗獲得的含有該重組表達載體的陽性克隆菌，即為成功構建的工程菌pQE-80L/ESP-BL21。(三)利用重組表達載體pQE-80L/ESP制備肺吸蟲ESP蛋白1、工程菌的構建利用(一)構建的肺吸蟲ESP蛋白的重組表達載體pQE-80L/ESP，按照(二)所述方法構建工程菌pQE-80L/ESP-BL21;2、工程菌的培養(yǎng)取步驟1所得工程菌菌落，同時設pQE-80L空載體轉化菌落和BL21(DE3)空菌株菌落為對照，接種于3ml含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37。C、150r/min振搖過夜；3、工程菌的誘導表達取300pl步驟2過夜培養(yǎng)菌液，接種于30ml含氨千青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37°C、200r/min振搖培養(yǎng)1小時，加入濃度為200mmol/L的IPTG誘導劑300pi,繼續(xù)培養(yǎng)5小時，收集菌液，9000g離心5分鐘，去除上清液，細菌沉淀用等體積的濃度為0.01mol/L、pH值為7.2的PBS洗滌3次后，用5倍體積的細菌裂解液重懸，再于水浴下超聲，條件為超聲5秒間隔5秒，重復50次，功率200W,取超聲后的勻漿物離心，收集上清液；4、表達產(chǎn)物的純化取步驟3收集的上清液，利用重組表達載體在表達蛋白氨基端引入的6個組氨酸標簽，以N廣-NTA樹脂(德國Qiagen公司)親和層析法進行純化，按照說明書中所述步驟操作，即得肺吸蟲ESP蛋白，置4。C保存。(四)鑒定1、重組表達載體的遺傳穩(wěn)定性方法挑取本發(fā)明工程菌pQE-80L/ESP-BL21的原代及第10、25、50代菌抹單菌落，分別接種于含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37。C培養(yǎng)過夜，菌液經(jīng)適當稀釋后涂布于含氨千青霉素的LB平板上，置溫度37。C培養(yǎng)12-16小時，再隨機挑選100個菌落接種到含氨千青霉素的LB平板上，置溫度37°C培養(yǎng)12-16小時，統(tǒng)計長出的菌落數(shù)，計算質粒丟失率。結果見表l。結論本發(fā)明工程菌pQE-80L/ESP-BL21在LB平板傳代過程中，具有i好的遺傳穩(wěn)定性，重組表達載體pQE-80L/ESP可以穩(wěn)定保留。表1、本發(fā)明工程菌pQE-80L/ESP-BL21傳代時的遺傳穩(wěn)定性代次質粒丟失率(°/。)1002515022、肺吸蟲ESP蛋白的表達量方法取(三)肺吸蟲ESP蛋白制備步驟3收集的上清液，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測肺吸蟲ESP蛋白的表達情況；并用凝膠薄層掃描儀(Bio-Rad公司)和Quantity-one軟件測定肺吸蟲ESP蛋白的表達量，同時與采用相同方法構建的其它工程菌pET22b(+)/ESP-BL21、PinPointXa-1T/ESP-JM109的肺吸蟲ESP蛋白表達量進行比較。結果表達產(chǎn)物的SDS-PAGE圖見圖4，其中1泳道為pQE-80L/ESP-BL21菌林，2泳道為BL21(DE3)空菌林，3泳道為pQE-80L空載體轉化菌林，4泳道為蛋白質分子量標準，從圖可知，肺吸蟲ESP蛋白被BL21(DE3)大腸桿菌在IPTG誘導下高效表達，表達產(chǎn)物分子量大小為22kDa，與預計大小相一致。肺吸蟲ESP蛋白的表達量測定結果見表2,本發(fā)明工程菌pQE-80L/ESP-BL21表達的肺吸蟲ESP蛋白在菌體總蛋白中所占比例為27.4%，而工程菌pET22b(+)/ESP-BL21、PinPointXa-lT/ESP-頂109的肺吸蟲ESP蛋白表達量分別為20.1%、12.4%。結論本發(fā)明構建的重組表達載體pQE-80L/ESP和工程菌pQE-80L/E^P-BL21能夠高效表達肺吸蟲ESP蛋白。表2、幾種工程菌的肺吸蟲ESP蛋白表達量比較工程菌肺吸蟲ESP蛋白表達量(％)pQE-80L/ESP-BL2127.4pET22b(+)/ESP-BU120.1PinPointXa-lT/ESP-JM10912.43、肺吸蟲ESP蛋白的免疫反應性方法采用半胱氨酸蛋白酶抑制劑捕獲酶聯(lián)免疫吸附法(CystatinCaptureEnzymeLinkedImmunosorbentAssay)測定肺p及蟲ESP蛋白的效j介。取樣史量反應板，每孔加入濃度為0.1mol/L、pH值為9.6、含有濃度為lpg/ml的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)的碳酸鹽緩沖液100pi,置溫度4。C過夜，用PBST(含有Tween-20的PBS)洗滌3次，加入質量百分濃度為1%的脫脂奶粉溶液lOOpl,置溫度37'C封閉2小時，用PBST洗滌2次；將肺吸蟲ESP蛋白分別按i:io、i:20、i:40、i:80、i:160、i:320和i:640作倍比稀釋，再加至反應孔中，每孔100ni，同時設陽性對照(標準斯氏貍殖吸蟲排泄分泌抗原)和陰性對照，置溫度4。c過夜，加入i:ioo稀釋的斯氏貍殖吸蟲感染者血清100置溫度37。C孵育2小時，加入1:5000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的第二抗體100jil，置溫度37。C孵育2小時，加入新制底物緩沖液100jil，置溫度37。C孵育30分鐘，加入濃度為2mol/L的硫酸0.05ml終止反應，反應液用PBS稀釋后，用酶標儀于490nm波長處測定吸光度；同時與釆用相同方法構建的其它工程菌pET22b(+)/ESP-BL21、PinPointXa-lT/ESP-JM109表達的肺吸蟲ESP蛋白的效價進行比較。結果見表3，本發(fā)明工程菌pQE-80L/ESP-BL21表達的肺吸蟲ESP蛋白的效價為1:640，而工程菌pET22b(+)/ESP-BL21、PinPointTMXa-lT/ESP-JM109表達的肺吸蟲ESP蛋白的效價分別為1:320、1:160。結論本發(fā)明工程菌pQE-80L/ESP-BL21表達的肺吸蟲ESP蛋白免疫反應性高。表3、幾種工程菌表達的肺吸蟲ESP蛋白的免疫反應性比較工程菌肺吸蟲ESP蛋白的效價pQE-80L/ESP-BL211:640pET22b(+)/ESP-BL211:320PinPointXa-1T/ESP-JM109i:160(五)肺吸蟲ESP蛋白的應用免疫印跡(Westernblotting)實驗顯示，肺吸蟲ESP蛋白具有良好的免疫反應性，可作為肺吸蟲病特異診斷抗原。采用本發(fā)明的重組表達載體，轉化宿主菌，誘導表達肺吸蟲ESP蛋白，再用所得肺吸蟲ESP蛋白免疫動物，可制備特異性抗體，還可進一步制得肺吸蟲病檢測試劑或檢測裝置。實驗證實，采用肺吸蟲ESP蛋白和其多克隆抗體制得的肺吸蟲病檢測試劑盒和檢測裝置，具有高度特異、敏感性，與肝吸蟲病、血吸蟲病的交叉反應干擾小，假陽性率低于ELISA法，并具有療效考核作用，在肺吸蟲病經(jīng)有效藥物治療后3-6月.，檢測結果將轉陰，轉陰率高于ELISA法，可以準確、快速、簡便地進行肺吸蟲病的診斷與鑒別診斷、以及療效考核，具有重要的臨床應用價值。1、制備肺吸蟲病檢測試劑盒一種肺吸蟲病檢測試劑盒，包括檢測條、樣品稀釋液，檢測條由樣品墊和吸收墊順序貼附于帶背襯的檢測層上構成；檢測層上包被有抗人IgG抗體形成的檢測線和抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體形成的質控線；樣品稀釋液為濃度為0.01-0.05mol/L、pH值為7.0-7.2的PBS，內(nèi)含濃度為5-8pg/ml的膠體金標記的肺吸蟲ESP蛋白、質量百分濃度為1。/。的牛血清白蛋白即BSA;試劑盒內(nèi)還可設置樣品稀釋孔。所述檢測試劑盒的具體制備方法見中國發(fā)明專利申請"肺吸蟲病檢測試劑盒及其制備方法"，申請?zhí)?008100695857,申請日2008.4.25。2、制備肺吸蟲病檢測裝置一種肺吸蟲病才全測裝置，包括標記墊、檢測層，標記墊中含有膠體金標記的肺吸蟲ESP蛋白；檢測層上包被有抗人IgG抗體形成的才企測線和抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體形成的質控線；包被有檢測線和質控線的檢測層貼附于背板上，樣品墊、標記墊及吸收墊順序貼附于檢測層上，蓋板扣蓋在貼附有樣品墊、標記墊及吸收墊的檢測層上；蓋板上設有加樣孔和觀察孔。所述4企測裝置的具體制備方法見中國發(fā)明專利申請"肺吸蟲病檢測裝置及其制備方法"，申請?zhí)?008100695842，申請日2008.4.25。3、肺吸蟲病檢測試劑盒或檢測裝置的檢測方法與結果判定檢測試劑盒的檢測方法取待測血清15-20(xl置樣品稀釋孔內(nèi)，用樣品稀釋液稀釋至50取出檢測條，將檢測條的樣品墊端浸入制備好的樣品中，放置約5-10分鐘，觀察結果。-檢測裝置的檢測方法取出檢測裝置，在加樣孔內(nèi)加入待測血清15-20放置約5-10分鐘，觀察結杲。結果判定當檢測條(或檢測裝置)出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質控線，同時出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測線，結果判為陽性，記為"+";檢測線顏色越深，說明被檢測樣品的抗體水平越高；當檢測條(或檢測裝置)出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質控線，沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色4企測線，結果判為陰性，記為當檢測條(或檢測裝置)沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質控線，不管是否出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測線，結果都判為檢測條(或檢測裝置)失效，應廢棄。4、肺吸蟲病檢測試劑盒或檢測裝置的鑒定(l)特異性方法采用本發(fā)明所述檢測試劑盒或檢測裝置對肺吸蟲病患者、肝吸蟲病患者、血吸蟲病患者和健康者血清進行檢測，并與ELISA法進行比較；ELISA法為常規(guī)方法，即將抗原包被于PVC條板，取待測血清10pl，加入PBS90pl，置溫度37。C孵育30分鐘，洗滌3次，加入辣才艮過氧化物酶(HRP)標記的第二抗體，置溫度37。C孵育30分鐘，洗滌3次，3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，酶標儀測定OD值，待檢孔OD值大于陰性對照2.1倍者為陽性。結杲見表4。本發(fā)明所述檢測試劑盒或檢測裝置和ELISA法檢測肺吸蟲病患者血清抗體的陽性率分別為96.5%(55/57)和100.0%(57/57),兩法間差異無顯著性(0.05);采用本發(fā)明所述檢測試劑盒和檢測裝置檢測肝吸蟲病患者血清、血吸蟲病患者血清和健康者血清，除血吸蟲病患者血清的交叉反應率為5.0%外，其余兩者均為陰性，假陽性率低于ELISA法。結論本發(fā)明所述檢測試劑盒或檢測裝置具有高度特異性，可以用于肺吸蟲病的診斷，以及肺吸蟲病與其它吸蟲病的鑒別診斷。表4、本發(fā)明所述檢測試劑盒或檢測裝置與ELISA法檢測不同血清的結果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)敏感性方法采用本發(fā)明所述4企測試劑盒或檢測裝置對28例疑似肺吸蟲病患者血清進行檢測，并與ELISA法進行比較；ELISA法為常^見方法。結果見表5。兩種方法檢測結果的總符合率為100%(21/28)。經(jīng)、2檢驗，兩法間差異無顯著性(P>0.05)。檢測結果呈陽性的21例病人最終確診為肺吸蟲病患者，因此，兩種方法的敏感性均為100%。結論本發(fā)明所述檢測試劑盒或檢測裝置具有高度敏感性。表5、本發(fā)明所述檢測試劑盒或檢測裝置與ELISA法檢測敏感性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(3)療效考核作用方法在肺吸蟲病患者經(jīng)有效藥物治療后3個月與6個月，采用本發(fā)明所述檢測試劑盒或檢測裝置對7例肺吸蟲病患者血清進行檢測，并與ELISA法進行比較；ELISA法為常規(guī)方法。結果采用本發(fā)明所述檢測試劑盒或檢測裝置進行檢測，7例肺吸蟲病患者經(jīng)有效藥物治療后3個月，有4例轉陰，轉陰率57.1%;治療后6個月，7例全部轉陰，轉陰率100.0%;而釆用ELISA法分別于治療后3個月、6個月檢測，無1例轉陰。結論采用本發(fā)明所述檢測試劑盒或檢測裝置進行檢測，轉陰率明顯高于ELISA法，可用于肺吸蟲病的療效考核。盡管通過參照本發(fā)明的某些優(yōu)選實施例，已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。<110〉中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學<120〉肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達載體、工程菌、制備方法及其應用<160>2<210>1<211>495<212>RNA<213>斯氏貍殖吸蟲(Pagumogoninmsskrjabini)<220><221><222>CDS(1).(495)<400>caaggtGinGly11caaGlntgtCysggcGly5tccSertgcCystggTrpgcgAlatttPhe10tcgSergtaValgtaValggaGlyaatAsn1545"tgaalieGluggtGlycaaGintggTrp20tttPheetcLeuaagLysaccThrggtGly25cagGincttLeuatelieagtSerctgLeu3090ageaaaSerLyscagGincaaGinttgLeu35gtcValgatAspCysgacAspaagLys40gtgValgacAspcacHisggaGlytgcCys45135aatggtAsnGlyggaGlytggTrpccaPro50ccaProtacTyracaThrtacTyrggcGly55gagGluatelieaaaLyseggArgttgLeu60180ggtggcGlyGlyttaLeugagGluacgThr65GinCMGingacAspUtTyrcccPro70tatTyrattlieggaGlyagaArgcagGin75225ceiaacgtgtagaatggataagtcgaagttgttgacgaaaategac270GinThrCysArgMetAspLysSerLysLeuLeuThrLyslieAsp808590gggteaattgttctggagagagatgagtataaacaggcagettgg315GlySerlieValLeuGluArgAspGluTyrLysGinAlaAlaTrp95100105etcgcagaacacggaccaatggetteaactetcaatgecaattat360LeuAlaGluHisGlyProMetAlaSerThrLeuAsnAlaAsnTyr110115120cttcagtactaccgatecggaateagtcatccgtecaggtatgag405LeuGinTyrTyrArgSerGlylieSerHisProSerArgTyrGlu125130135tgtaatcctgetagactgaaccacggcgtactgactgtgggctat450CysAsnProAlaArgLeuAsnHisGlyValLeuThrValGlyTyr140145150ggcacggaaaatggtattccctactggattgttaaaaatagttgg495GlyThrGluAsnGlylieProTyrTrplieValLysAsnSerTrp155160165<210>2<211>165<212>PRT<213>斯氏貍殖吸蟲(Pagumogonimusskrjabini)<400>2GinGlyGinCysGlySerCysTrpAlaPheSerValValGlyAsn151015lieGluGlyGinTrpPheLeuLysThrGlyGinLeulieSerLeu202530SerLysGinGinLeuValAspCysAspLysValAspHisGlyCys354045AsnGlyGlyTrpProProTyrThrTyrGlyGlulieLysArgLeu505560GlyGlyLeuGluThrGinGinAspTyrProTyrlieGlyArgGin657075GinThrCysArgMetAspLysSerLysLeuLeuThrLys丁leAsp808590GlySerlieValLeuGluArgAspGluTyrLysGinAlaAlaTrp95100105LeuAlaGluHisGlyProMetAlaSerThrLeuAsnAlaAsnTyr110115120LeuGinTyrTyrArgSerGlylieSerHisProSerArgTyrGlu125130135CysAsnProAlaArgLeuAsnHisGlyValLeuThrValGlyTyr140145150GlyThrGluAsnGlylieProTyrTrplieValLysAsnSerTrp155160165<210>3<211>18<212〉DM<213>人工序列<220><223>人工序列的描述兼并引物P1，括號內(nèi)為該位點不同的tt序列。<400>3tea(ag)gg(agct)ca(ag)tg(ct)gg(agct)tc(agct)tg(ct)tgg18<210>4<211>18<212>腿<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述兼并引物P2，括號內(nèi)為該位點不同的石威基序列。<400〉4cca(ag)ct(ag)U(ct)U(agct)ac(ag)atcca(ag)ta18<210>5<211〉25<212>DNA<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述特異性引物P3<400>5cgggatcccaaggtcaatgtggctc25<210〉6<211>27<212>薩<213>人工序列<220><223>人工序列的描述特異性引物P4<400>6ccaagcttgattgttaaaaatagttgg2權利要求1、肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達載體，其特征在于含有肺吸蟲排泄分泌蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；表達載體為pQE-80L。2、肺吸蟲排泄分泌蛋白的工程菌，其特征在于含有權利要求l所述的肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達載體，宿主菌為大腸桿菌。3、根據(jù)權利要求2所述的肺吸蟲排泄分泌蛋白的工程菌，其特征在于所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)菌抹。4、利用權利要求1所述重組表達載體制備肺吸蟲排泄分泌蛋白的方法，包括以下步驟a.工程菌的構建將權利要求1所述重組表達載體轉化入宿主菌感受態(tài)細胞，用含氨芐青霉素的LB平板進行篩選培養(yǎng)，獲得陽性克隆菌，即工程菌；b.工程菌的培養(yǎng)將步驟a所得工程菌接種于含氨節(jié)青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37'C振搖過夜；c.工程菌的i秀導表達取步驟b過夜培養(yǎng)菌液，按1:100的比例接種于含氨千青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37。C振搖培養(yǎng)1小時，加入異丙基好b代半乳糖苷即IPTG誘導劑至終濃度為200pol/L,繼續(xù)培養(yǎng)5-6小時，收集菌液，離心，去除上清液，細菌沉淀用磷酸鹽緩沖液即PBS洗滌3次后，用5倍體積的細菌裂解液重懸，于冰浴下超聲，取超聲后的勻漿物離心，收集上清液；d.表達產(chǎn)物的純化取步驟c收集的上清液，利用重組表達載體在表達蛋白氨基端引入的6個組氨酸標簽，以Ni2+-NTA樹脂親和層析法進行純化，即得肺吸蟲排泄分泌蛋白，置4'C保存。5、根據(jù)權利要求4所述的制備肺吸蟲排泄分泌蛋白的方法，其特征在亍所述步驟a使用的宿主菌為大腸桿菌。6、根據(jù)權利要求5所述的制備肺吸蟲排泄分泌蛋白的方法，其特征在于所述步驟a使用的宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)菌>^朱。7、利用權利要求1所述重組表達載體制得的肺吸蟲排泄分泌蛋白在制備肺吸蟲病檢測試劑或檢測裝置中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了肺吸蟲排泄分泌蛋白的重組表達載體、工程菌、制備方法及其應用；本發(fā)明的重組表達載體含有肺吸蟲排泄分泌蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，表達載體為pQE-80L；本發(fā)明的工程菌含有本發(fā)明的重組表達載體，宿主菌為大腸桿菌；利用本發(fā)明的重組表達載體制備肺吸蟲排泄分泌蛋白的方法，包括工程菌的構建、培養(yǎng)、誘導表達及表達產(chǎn)物的純化4個步驟；所制得的肺吸蟲排泄分泌蛋白可用于制備肺吸蟲病檢測試劑或檢測裝置；本發(fā)明構建的重組表達載體和工程菌，具有表達量高，表達穩(wěn)定的優(yōu)點；通過本發(fā)明方法制備肺吸蟲排泄分泌蛋白，蛋白收率高且免疫反應性高。文檔編號C12N1/21GK101319224SQ20081006991公開日2008年12月10日申請日期2008年7月1日優(yōu)先權日2008年7月1日發(fā)明者張錫林申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學