專利名稱：一種基因工程細胞及其在nk細胞擴增中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病免疫治療，尤其涉及NK細胞免疫治療中NK細胞的體外制備。
背景技術(shù)：
NK細胞(natural killer cell,自然殺傷細胞)是一類大顆粒淋巴細胞,是機體固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要橋梁，在機體抗感染性疾病和惡性腫瘤免疫監(jiān)視過程中發(fā)揮重要作用。繼發(fā)性NK細胞移植能產(chǎn)生良好的抗腫瘤效應(yīng)，而其自身很少被受體排斥，且不會引起任何 GVHD (Graft Versus Host Disease)。因此，繼發(fā)性 NK 細胞治療(Adoptive NKcell therapy)已成為目前最熱門和最有前途的惡性腫瘤治療方法之一。盡管繼發(fā)性NK細胞免疫治療具有良好的抗腫瘤效應(yīng)和巨大的應(yīng)用前景，但NK細胞免疫治療仍然難以進行常規(guī)臨床應(yīng)用，其中最主要障礙在于，在外周血單核細胞(PBMC)中，NK細胞只是一個很小的群體，僅占人外周血單核細胞的10 15%，難以滿足巨大的臨床需要。為解決這一難題，首先要在數(shù)量上保證NK細胞的有效供給。因此，探索各種有效的NK細胞體外擴增(Ex vivo expansion)方法已成為NK細胞免疫治療的必然趨勢。應(yīng)用基因工程細胞(Gene engineering cells, GEC)作為飼養(yǎng)細胞(feedercell)進行NK細胞體外擴增是一種重要的NK細胞擴增新策略。在以往的研究中有研究者應(yīng)用CD64、CD86修飾K562細胞構(gòu)建人工抗原遞呈細胞(Antigen present cell, aAPC)，然后將 4-1BBL (CD137L)和膜固定 IL15 (membrane-bound IL-15, mIL-15)等導(dǎo)入此細胞中，構(gòu)建⑶64-⑶86-4-lBBL-mIL15-aAPC，并利用此人工抗原遞呈細胞進行NK細胞體外擴增，這種方法可以獲得較強細胞毒性的NK細胞，但NK細胞增殖受到限制，5-6周后細胞不再擴增。本發(fā)明中，我們通過基因工程技術(shù)將4-1BBL和膜固定IL21 (mbIL_21)直接修飾到K562細胞表面，構(gòu)建4-lBBL-mbIL-21-GEC。與以往的人工抗原遞呈細胞相比，本發(fā)明更加簡單和易于操作。研究表明，4-lBBL-mbIL-21-GEC可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大規(guī)模功能性的NK細胞，在NK細胞免疫治療臨床應(yīng)用和科學(xué)研究中具有重大應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種基因工程細胞。本發(fā)明的第二個目的是，提供一種基因工程細胞的制備方法。本發(fā)明的第三個目的是，提供一種基因工程細胞在NK細胞擴增中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個目的是，提供一種NK細胞擴增方法。為了解決本發(fā)明第一個目的，本發(fā)明提供了一種基因工程細胞，所述基因工程細胞為4-lBBL-mbIL-21-GEC，其細胞膜表面穩(wěn)定表達4-1BB配體和膜固定白介素21(mbIL-21)。作為一個優(yōu)選，所述基因工程細胞為4-lBBL-mbIL-21-K562細胞。為了解決本發(fā)明第二個目的，本發(fā)明提供了基因工程細胞的制備方法，包括以下步驟(1)構(gòu)建4-1BBL表達的轉(zhuǎn)座子；
(2)4-lBBL轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染相應(yīng)細胞，流式細胞分選，獲得4-1BBL穩(wěn)定表達細胞 4-1BBL-GEC ；
(3)在步驟(2)獲得的4-1BBL-GEC基礎(chǔ)上導(dǎo)入在細胞膜表面穩(wěn)定表達的IL-21(membrane-bound IL-21, mbIL-21),建立 4-lBBL-mbIL_21 -GEC0作為一個優(yōu)選，所述基因工程細胞為4-lBBL-mbIL-21-K562細胞。為了解決本發(fā)明第三個目的，本發(fā)明提供了基因工程細胞在NK細胞擴增中的應(yīng)用。為了解決本發(fā)明第四個目的，本發(fā)明提供了一種NK細胞擴增方法，利用上述基因工程細胞進行擴增，包括以下步驟
(1)構(gòu)建4-1BBL表達的轉(zhuǎn)座子；
(2)4-lBBL轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染相應(yīng)細胞，流式細胞分選，獲得4-1BBL穩(wěn)定表達細胞 4-1BBL-GEC ；
(3)在步驟(2)獲得的4-1BBL-GEC基礎(chǔ)上導(dǎo)入在細胞膜表面穩(wěn)定表達的IL-21(mbIL-21)，建立 4-lBBL-mbIL-21 -GEC ；
(4)致死性照射或絲裂霉素處理步驟(3)獲得的基因工程細胞，按2:I與外周血單核細胞混合，在NK細胞擴增培養(yǎng)液中共培育；
(5)每周重復(fù)刺激I次，連續(xù)數(shù)周，以獲得足夠量的NK細胞。作為一個優(yōu)選，所述基因工程細胞為4-lBBL-mbIL-21-K562細胞。本發(fā)明的優(yōu)點在于，為建立一種高效和高細胞毒性的NK細胞體外擴增方法，我們通過在細胞膜表面穩(wěn)定表達4-1BB配體(4-1BBL)和膜固定白介素21 (mbIL-21 )，構(gòu)建新型基因工程細胞4-lBBL-mbIL-21-GEC，如4-lBBL-mbIL-21_K562細胞，以此作為擴增的飼養(yǎng)細胞，從外周血單核細胞中直接擴增NK細胞，而不是先構(gòu)建人工抗原遞呈細胞，然后在此基礎(chǔ)上遺傳修飾。與以往的人工抗原遞呈細胞相比，本發(fā)明更加簡單和易于操作。流式細胞分析、細胞毒性試驗等表明所擴增的NK細胞純度好、細胞毒性強，具有明顯的腫瘤細胞殺傷效應(yīng)。本發(fā)明提供的NK細胞擴增方法簡單、易于操作；擴增效率好、純度高；擴增持續(xù)時間長、腫瘤細胞殺傷效應(yīng)明顯。


圖I為本發(fā)明的工作示意圖。
圖2為4-1BBL和mbIL-21在4-lBBL-mbIL-21_K562基因工程細胞中的表達。
圖3為擴增細胞中NK細胞的純度(W代表擴增周數(shù))。
圖4為擴增細胞的總數(shù)目。
圖5為擴增前后NK細胞的受體表達(W代表擴增周數(shù)，O W代表PBMC)。
圖6為擴增前后NK細胞的腫瘤細胞殺傷效率。
圖7為STAT3抑制劑JSI-124抑制擴增NK細胞受體表達。
圖8為STAT3抑制劑JSI-124損害擴增NK細胞的形態(tài)、增殖和細胞殺傷效力。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的4-lBBL-mbIL-21-K562的制備方法和NK細胞擴增方法的具體實施方式
做詳細說明，圖I為本發(fā)明的工作示意圖。實施例I、基因工程細胞4-lBBL-mbIL-21_K562的制備方法
I.從 Open Biosysems (Thermo Fisher Scientific, CO, USA)購買 4-1BBL/PCR4TOPO質(zhì)粒，PCR擴增，然后插入GlySer-EGFP (CoOp)-pSBSO睡美人表達載體的Nhe I-XhoI位點，構(gòu)建4-lBBL/pSBSO轉(zhuǎn)座子。2.將4-lBBL/pSBSO轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染K562細胞，流式細胞分選，獲得4-1BBL 穩(wěn)定表達的 K562 細胞(4-1BBL-K562)。3.將 IL-21-Fc (CoOp)-pSBSO 與轉(zhuǎn)座酶 SBll 共轉(zhuǎn)染 4-1BBL-K562 細胞，流式細胞分選，建立4-lBBL-mbIL-21-K562基因工程細胞。流式細胞分析證實4-lBBL-mbIL-21_K562細胞表面有明顯的4-1BBL和IL-21的表達(圖2)。實施例2、NK細胞擴增方法
I.從 Open Biosysems (Thermo Fisher Scientific, CO, USA)購買 4-1BBL/PCR4TOPO質(zhì)粒，PCR擴增，然后插入GlySer-EGFP (CoOp)-pSBSO睡美人表達載體的Nhe I-XhoI位點，構(gòu)建4-lBBL/pSBSO轉(zhuǎn)座子。2.將4-lBBL/pSBSO轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染K562細胞，流式細胞分選，獲得4-1BBL 穩(wěn)定表達的 K562 細胞(4-1BBL-K562)。3.將 IL-21-Fc (CoOp)-pSBSO 與轉(zhuǎn)座酶 SBll 共轉(zhuǎn)染 4-1BBL-K562 細胞，流式細胞分選，建立4-lBBL-mbIL-21- K562基因工程細胞。4.用淋巴細胞分離液分離人外周血單核細胞。5. IOOGy放射線照射構(gòu)建的基因工程細胞，或15ug/mL絲裂霉素處理構(gòu)建的基因工程細胞4小時；之后，細胞用PBS洗2 3次。6.預(yù)處理過的基因工程細胞與淋巴細胞按2:1混合，在含有10%FBS、1% P/S、2 mML-谷氨酰胺、50U/ml IL-2的RPMI1640培養(yǎng)液中于5% CO2培養(yǎng)箱中共培育，每2天更換新
鮮培養(yǎng)基一次。7.按步驟5和6程序每周重復(fù)刺激擴增后細胞I次。8.在不同時間點，檢測NK細胞純度(見圖3)、細胞總數(shù)目(見圖4)、NK細胞表面受體表達(見圖5)和對腫瘤細胞的殺傷效力(見圖6)。實施例3、NK細胞擴增機理研究
I.從 Open Biosysems (Thermo Fisher Scientific, CO, USA)購買 4-1BBL/PCR4TOPO質(zhì)粒，PCR擴增，然后插入GlySer-EGFP (CoOp)-pSBSO睡美人表達載體的Nhe I-XhoI位點，構(gòu)建4-lBBL/pSBSO轉(zhuǎn)座子。2.將4-lBBL/pSBSO轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染K562細胞，流式細胞分選，獲得4-1BBL 穩(wěn)定表達的 K562 細胞(4-1BBL-K562)。3.將 IL-21-Fc (CoOp)-pSBSO 與轉(zhuǎn)座酶 SBll 共轉(zhuǎn)染 4-1BBL-K562 細胞，流式細胞分選，建立4-lBBL-mbIL-21- K562基因工程細胞。4.用淋巴細胞分離液分離人外周血單核細胞。5. IOOGy放射線照射構(gòu)建的基因工程細胞，或15 μ g/mL的絲裂霉素處理構(gòu)建的基因工程細胞4小時；之后，細胞用PBS洗2 3次。
6.預(yù)處理過的基因工程細胞與淋巴細胞按2:1混合，在含有10%FBS、1% P/S、2 mML-谷氨酰胺、50U/ml IL-2的RPMI1640培養(yǎng)液中于5% CO2培養(yǎng)箱中共培育，每2天更換新
鮮培養(yǎng)基一次。7. I周后按步驟5和6程序重復(fù)刺激擴增后細胞。8. I周后按步驟5和6程序重復(fù)刺激步驟7所得擴增細胞，設(shè)2個組，在培養(yǎng)基中分別加入O. I μ M的JSI-124和等體積的DMSO09.第3天流式細胞分析檢測NK細胞受體表達(圖7)，第5天在相差顯微鏡下觀察NK細胞形態(tài)并拍照(圖8Α)，第0、3、7天計數(shù)NK細胞數(shù)目(圖8Β)，第7天檢測NK細胞對腫瘤細胞的殺傷效力(圖8C)。通過構(gòu)建4-lBBL-mbIL_21- K562新型基因工程細胞，以此作為擴增的飼養(yǎng)細胞，從外周血單核細胞中直接擴增NK細胞。細胞計數(shù)、流式細胞分析、細胞毒性試驗等表明細胞擴增倍數(shù)高、NK細胞純度好、細胞毒性強，具有明顯的腫瘤細胞殺傷效應(yīng)。進一步的機理研究表明，本發(fā)明所誘導(dǎo)的NK細胞擴增是STAT3依賴性的，抑制STAT3磷酸化將損害NK細胞的擴增。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，如用其它類型的細胞如721. 22UU937等細胞替代K562細胞，用其它方式實現(xiàn)4-1BBL和mbIL-21在細胞膜表面的表達，在4-1BBL和mbIL-21基礎(chǔ)上再修飾其它基因，應(yīng)用其它組織來源細胞如脾細胞進行擴增，對擴增條件和程序進行改進等等，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種基因工程細胞，其特征在于，所述基因工程細胞為4-lBBL-mbIL-21-GEC，其細胞膜表面穩(wěn)定表達4-1BB配體和膜固定IL-21。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基因工程細胞，其特征在于，所述基因工程細胞為4-lBBL-mbIL-21-K562 細胞。
3.權(quán)利要求I所述的基因工程細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(I)構(gòu)建4-1BBL表達的轉(zhuǎn)座子；(2)4-lBBL轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染相應(yīng)細胞，流式細胞分選，獲得4-1BBL穩(wěn)定表達細胞 4-1BBL-GEC ；(3)在步驟(2)獲得的4-1BBL-GEC基礎(chǔ)上導(dǎo)入在細胞膜表面穩(wěn)定表達的IL-21，建立4-lBBL-mbIL-21-GEC。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程細胞的制備方法，其特征在于，所述基因工程細胞為 4-lBBL-mbIL-21-K562 細胞。
5.權(quán)利要求I或2所述的基因工程細胞在NK細胞擴增中的應(yīng)用。
6.一種NK細胞擴增方法，其特征在于，利用權(quán)利要求I所述基因工程細胞進行擴增，包括以下步驟(1)構(gòu)建4-1BBL表達的轉(zhuǎn)座子；(2)4-lBBL轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染相應(yīng)細胞，流式細胞分選，獲得4-1BBL穩(wěn)定表達的細胞4-1BBL-GEC ；(3)在步驟(2)獲得的4-1BBL-GEC基礎(chǔ)上導(dǎo)入在細胞膜表面穩(wěn)定表達的IL-21，建立4-lBBL-mbIL-21 -GEC ；(4)致死性照射或絲裂霉素處理步驟(3)獲得的基因工程細胞，按2:I與外周血單核細胞混合，在NK細胞擴增培養(yǎng)液中共培育；(5)每周重復(fù)刺激I次，連續(xù)數(shù)周，以獲得足夠量的NK細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種NK細胞擴增方法，其特征在于，所述基因工程細胞為4-lBBL-mbIL-21-K562 細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因工程細胞及其在NK細胞擴增中的應(yīng)用，提供了一種高效和高細胞毒性的自然殺傷(NK)細胞體外擴增方法。通過基因工程技術(shù)在細胞膜表面穩(wěn)定表達4-1BB配體(4-1BBL)和膜固定白介素21(mbIL-21)，構(gòu)建4-1BBL-mbIL-21-基因工程細胞(4-1BBL-mbIL-21-GeneEngineeringCells,4-1BBL-mbIL-21-GEC)，如4-1BBL-mbIL-21-K562細胞等，以此作為擴增的飼養(yǎng)細胞，從外周血單核細胞中直接擴增NK細胞，更加簡單和易于操作。細胞計數(shù)、流式細胞分析、細胞毒性試驗等研究表明細胞擴增倍數(shù)高，NK細胞純度好、細胞毒性強、具有明顯的腫瘤細胞殺傷效應(yīng)。
文檔編號C12N5/0783GK102911918SQ20121023702
公開日2013年2月6日 申請日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者朱詩國, 王艷麗 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院