快速提取人糞便細菌dna的簡易方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物學(xué)，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；具體涉及一種快速提取人糞便細菌DNA的簡易方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸道微生物菌群是一個龐大復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，它占全身微生態(tài)菌總數(shù)80%左右。 包含有100萬億種微生物，涉及1000類菌種，其數(shù)量是人體細胞數(shù)量的10倍免疫系統(tǒng)。這 些細菌有助于人體消化食物，產(chǎn)生維生素以預(yù)防食物中細菌所誘發(fā)的疾病，同時刺激。隨 著研究深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)腸道微生物在許多慢性疾病和癥狀中，如炎癥、肥胖等也起了關(guān)鍵 作用。腸道微生物菌群與宿主遺傳因素之間也應(yīng)該存在密切關(guān)系，人的基因會對腸道微生 物菌群產(chǎn)生重要影響，從某種意義上說，腸道微生物菌群也是人的基因的一種表型。因此 從DNA分子水平診斷患者細菌感染和帶菌情況是目前臨床診斷的發(fā)展趨勢。因此，臨床標 本中細菌DNA的提取方法的優(yōu)化顯得尤為重要。人體腸道中存在大量的正常菌群和待檢 測的致病菌，而糞便作為一種非損傷性的臨床標本取材方便，同時也包含了大量腸道菌群 信息。腸道菌群與肥胖、心血管系統(tǒng)等多種疾病相關(guān)。鑒于腸道菌群的重要性，研究人群 腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)（如種類、數(shù)量、比例、定位和生物學(xué)特性等）具有重要的意義。腸道 菌群的研究方法主要有傳統(tǒng)法和分子生物學(xué)的方法。傳統(tǒng)法的培養(yǎng)法和鏡鑒法主要用于 早期腸道菌群方面的研究。目前，分子生物學(xué)技術(shù)檢測糞便中細菌基因組脫氧核糖核酸 (deoxyribonucleicacid，DNA)是探討人腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)的重要方法。從人奠便中提取 高質(zhì)量的腸道菌群總基因組DNA是研究分析腸道菌群與相關(guān)疾病發(fā)生機制的基礎(chǔ)和前提。 糞便樣品中含有大量腸道菌，同時也含有各種腸道脫落細胞、腐殖質(zhì)以及多種無機物和有 機物等。因此，能否提取糞便中細菌基因組DNA成為影響探尋腸道菌群多樣性和差異性的 關(guān)鍵因素。目前，從糞便標本中提取細菌DNA的方法眾多，如試劑盒法、化學(xué)一凍融研磨法 和化學(xué)裂解法。試劑盒法即采用生物公司生產(chǎn)的商業(yè)化試劑盒直接提取DNA ;化學(xué)裂解法 主要是利用溶菌酶、SDS與蛋白酶K等試劑使微生物細胞破裂進而提取DNA ;化學(xué)一凍融研 磨法主要是將物理方法與化學(xué)方法相結(jié)合提取DNA。傳統(tǒng)法所使用的酚/氯仿/異戊醇抽 提每次抽提都會損失一部分核酸，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低。CTAB法（加硫氰酸胍 法）使用含CTAB的裂解液，對于去除樣品中的多糖成分具有顯著效果，但是洗滌除去CTAB 要比去除其他鹽離子更困難，同時CTAB的少量殘留也會對酶活性有很大的影響。試劑盒 法避免了苯酚和氯仿對人體的危害，且離心柱子式的洗滌效率比傳統(tǒng)洗滌效率高，柱式純 化的核酸純度也較高，但是在操作過程中有時會出現(xiàn)蛋白酶消化不完全所導(dǎo)致柱子阻塞現(xiàn) 象。而且以上這些方法由于提取機理和步驟的差別，獲得DNA的量及純度各不相同，導(dǎo)致在 后續(xù)實驗，如PCR擴增、DNA測序和限制性核酸內(nèi)切酶的分析等的應(yīng)用效果不同。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速提取人糞便細菌DNA的簡易方法。
[0004] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種快速提取人糞便細菌DNA的簡易方法， 依次包括以下步驟：
[0005] 1)、人糞便樣品的熱-冷破裂細胞；
[0006] 2)、AMPure XP 磁珠液抓取 DNA ;
[0007] 3)、利用磁珠和磁力分離架（例如為標準96孔磁力分離架，可用于標準96孔PCR 板）的磁力吸附去除雜質(zhì)以及純化DNA。
[0008] 作為本發(fā)明的快速提取人糞便細菌DNA的簡易方法的改進：
[0009] 所述步驟1)為：
[0010] 通過無菌棉簽沾取人糞便至棉簽變色（約0. 2g)，將棉簽在250~350ul (例如為 300ul)的2% SDS裂解液里反復(fù)震蕩混勻（約Imin)，從而使無菌棉簽沾取的人糞便落入 2% SDS裂解液中，以此作為人糞便樣品液；
[0011] 該人糞便樣品液裝入容器中，先于60~70°C (較佳為65°C )水浴8~12min (例 如為IOmin左右），水浴期間搖勻（例如每5min搖勻一次），得前處理人糞便樣品，然后將 前處理人糞便樣品進行下述的熱-冷破裂處理：
[0012] 先放入液氮中凍融至完全冰凍成固態(tài)，然后放入60~70°C (較佳為65°C )的水 浴鍋加熱2~3min ;再重復(fù)上述冰凍-加熱1~3次；最后于60~70°C (較佳為65°C ) 保溫8~12min (即，最后一次水浴延長時間至10~15min)。
[0013] 2% SDS裂解溶液為2g SDS (十二烷基硫酸鈉）加入100ml CldH2O水中配制而得。
[0014] 作為本發(fā)明的快速提取人糞便細菌DNA的簡易方法的進一步改進：
[0015] 所述步驟2)為：步驟1)的所得物經(jīng)離心或靜止處理后（例如SOOOg離心1分鐘 或靜止IOmin)，取上清液（80~IOOul上清液）至新的PCR管（例如為200ul PCR管）中， 加入1/2上清液體積的AMPure XP磁珠液，用移液器反復(fù)吸打混勻，室溫靜置5~lOmin。
[0016] 注：AMPure XP 磁珠液生產(chǎn)廠家 Beckman Coulter，型號 A63881。
[0017] 作為本發(fā)明的快速提取人糞便細菌DNA的簡易方法的進一步改進：
[0018] 所述步驟3)為依次進行步驟：
[0019] ①、將帶有步驟2)所得物的PCR管于3000~5000rpm的轉(zhuǎn)速快速離心（時間為 3~5s)(目的使壁和管蓋上的液體流入管底），然后垂直置于磁力分離架（96孔磁力分離 架）上，待PCR管中的液體澄清（大約需要5min)后，小心吸除上清液（勿碰觸到磁珠），然 后加入70~90ul PEG8000,用移液槍吸打混勻（此步驟操作中PCR管仍然置于96孔磁力 分離架上），然后室溫靜置5~IOmin ;
[0020] ②、在步驟①的產(chǎn)物中（即，向上述得到的PCR管中）加入180~220ul體積濃度 80%的酒精清洗磁珠表面20~40s (不需要吸打），然后吸除上清廢液（步驟中PCR管一直 在96孔磁力分離架上）；
[0021] 重復(fù)上述酒精清洗和吸除上清廢液的步驟，然后瞬時離心（轉(zhuǎn)速為3000~ 5000rpm，時間為3~5s)，并將殘余的廢液吸除干凈，室溫晾干使其出現(xiàn)龜裂（大約需要 IOmin)；
[0022] ③、在步驟②的所得物中加入25~35ul的ddH20,然后吸打混勻磁珠（此步驟操 作時PCR與96孔磁力分咼架分咼）；
[0023] ④、將上述PCR管再次置于到磁珠板上，待磁珠和液體分離，直到液體澄清，吸取 液體到新的PCR管中，檢測DNA其濃度和純度。
[0024] 本發(fā)明的目的是克服以往從人糞便中提取高質(zhì)量的腸道菌群總基因組DNA過程 的繁瑣性、破壞性、價格高以及不同樣品提取量波動較大的缺陷，本發(fā)明提供一種采集和提 取簡便、操作簡單、對人和環(huán)境危害小，質(zhì)量穩(wěn)定、成本低、易標準化、且可以一次同時提取 上百個樣品的提取方法。該提取方法將物理方法（液氮凍融）和磁珠純化有機結(jié)合，一個 操作人員可以在1個小時同時提取約100個樣品，這對于全面快速研究人群腸道菌群與相 關(guān)疾病發(fā)生機制有重要意義。
[0025] 本發(fā)明的快速提取人糞便細菌DNA的簡易方法，利用熱-冷交替物理快速破裂細 菌細胞，離心后，經(jīng)過PEG8000-磁珠結(jié)合DNA分子-吹打混勻-靜置后，酒精洗滌磁珠表面 從而去除其他鹽離子，然后加 CldH2O (無菌去離子水）分離磁珠與DNA并將DNA溶解在水里 的抽提方法，所獲得的DNA質(zhì)量較高（片段大、純度高），可用于PCR、多重熒光PCR-毛細管 電泳（FM-CE)、變性液相色譜（DHPLC)分析、直接DNA測序等分子生物學(xué)方法分析。
[0026] 作為本發(fā)明的前置條件和步驟為：1)本發(fā)明的人糞便取樣裝置包括：一個長方形 包裝盒，一個內(nèi)置塑料支撐板，兩個2ml凍存管和一個8-13cm長的醫(yī)用無菌取樣棉簽，其中 一個凍存管里裝有300111(1(1!1 20，另一個凍存管里裝有300111 2%303裂解液。且每個凍存 管貼好相應(yīng)的標簽。將兩個凍存管分別放置于相應(yīng)的內(nèi)置塑料支撐板上，和棉簽以及取糞 便樣的簡單說明書一起置于長方形包裝盒封好。
[0027] 作為本發(fā)明的前置條件和步驟為：2)利用上述取樣裝置取完樣品后，糞便樣品是 溶解在裝有300ul SDS裂解液的凍存管中。本方法適合常溫保存以及長時間放置，有利于 大范圍收集，運輸和存儲糞便樣品，為后續(xù)的提取提供了更好的基礎(chǔ)和保證（建議取樣完 畢盡快寄回）。
[0028] 作為本發(fā)明的前置條件和步驟為：
[0029] PEG8000混合液的配置，IOg PEG8000和L 3g NaCl加入CldH2O水50ml，然后慢慢 混勻。
[0030] 2% SDS裂解溶液的配制：2g SDS加入100ml CldH2O 7K，攪拌溶解，配置2% SDS裂 解溶液。
[0031] 作為本發(fā)明一種較佳的快速提取人糞便細菌DNA的簡易方法，依次包括以下步 驟：
[0032] 1、AMPure XP磁珠液用之前放置常溫30min，然后震蕩混勻；
[0033] 2、人糞便樣品的裂解液管65°C水浴IOmin左右，期間5Min搖勻一次；
[0034] 3、將上述步驟2的凍存管放入液氮中凍融至完全冰凍，拿出放入水浴鍋2-3min， 該步驟重復(fù)三次（最后一次水浴延長時間至l〇-15min);
[0035] 4、8000g離心1分鐘，取80ul上清液至新的200ulPCR管中（如大規(guī)模提取加入到 96孔PCR板中），加入40ul磁珠液，用槍反復(fù)吸打混勻至少10次，室溫靜置5min ;
[0036] 5、快速離心PCR管（使壁和管蓋液體流入管底），然后垂直置于96孔磁力分離架 上，待PCR管中的液體澄清（大約需要5min)后，小心吸除上清液（勿碰觸到磁珠），然后加 入80ul PEG8000,用移液槍吸打混勻至少10次（此步驟操作中PCR管仍然置于96孔磁力 分離架上），然后室溫靜置5min ;
[0037] 6、快速