2-b]吡啶-2-甲酰胺的 合成：
[0218] 將化合物（S)-N-(2-(叔丁基二甲基硅氧基）丙氧基）-7_氟-3-(2-氟-4-碘苯 基氨基）-4_甲基-5-氧代-4, 5-二氫噻吩并[3, 2-b]吡啶-2-甲酰胺（84mg，0. 13mmol) 加入反應(yīng)瓶中，加入THF(2ml)，然后加入IM四丁基氟化銨（0. 26ml，0. 26mmol)，在室溫 下反應(yīng)一個(gè)小時(shí)，反應(yīng)完畢后，濃縮除去甲醇，用飽和碳酸氫鈉溶液中和，乙酸乙酯萃取， 無(wú)水硫酸鈉干燥，柱層析分離得到產(chǎn)物。（30mg，收率：43%)。 1H NMR(400MHz，DMS0-d6) δ 7. 62 (dd, 1H), 7. 34 (d, 1H), 6. 51 (m, 1H), 6. 22 (d, 1H), 4. 62 (bs, 1H), 3. 79-3. 54 (m, 2H), 3 .46 (m, 1H) ,1-21 (d, 2H). m/z536. 3 (M+l)
[0219] 實(shí)施例6 :N-(環(huán)丙基甲基氧）-7-氟-3-(2-氟-4-碘苯基氨基）-4-甲基-5-氧 代-4, 5-二氫噻吩并[3, 2-b]吡啶-2-甲酰胺的合成：
[
[0221] 將化合物7-氟-3-(2-氟-4-碘苯基氨基）-4_甲基-5-氧代-4, 5-二氫噻吩并 [3, 2-b] P比啶-2-羧酸（60mg, 0· 13mmol)和 0-(環(huán)丙基甲基）輕胺（17mg, 0· 20mmol)加入 反應(yīng)瓶中，然后加入HOBt (27mg, 0. 20mmol)和EDCI (38mg, 0. 20mmol)，在室溫下反應(yīng)3個(gè)小 時(shí)，反應(yīng)完畢后，加入水稀釋反應(yīng)液，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉 干燥，濃縮，柱層析分離得到產(chǎn)物。（40mg，收率：58%)。S7.64(dd，lH)，7.35(d，lH)，6.52 (m，1H)，6. 23 (s，1H)，3. 86 (d，2H)，0· 65 (m，2H)，0· 41 (m，1H)，0· 35 (m，2H) · m/z 532. 3 (M+1)。
[0222] 實(shí)施例7 :3-(4-溴-2-氯苯基氨基）-7-氟-N-(2-羥基乙氧基）-4-甲基-5-氧 代-4, 5-二氫呋喃并[3, 2-b]吡啶-2-甲酰胺的合成：
[0224] 步驟1 :7_氟-3-(2-氯-4-溴苯基氨基）-4_甲基-5-氧代-4, 5-二氫呋喃并 [3, 2-b]吡啶-2-羧酸乙酯的合成：
[0226] 將化合物2-氯-4-溴苯胺（181mg, 0. 88mmol)加入反應(yīng)瓶中，加入無(wú)水 1'冊(cè)(1.51111)，在-78°(：氮?dú)夥諊孪蚍磻?yīng)液中滴加1^腿05(1]\1，2.191111，2.19臟〇1)，在-78 1€ 反應(yīng)30分鐘后，加入化合物3-氯-7-氟-4-甲基-5-氧代-4, 5-二氫呋喃并[3, 2-b]吡 啶-2-羧酸乙酯（200mg，0. 73mmol)，在-78°C至室溫反應(yīng)2個(gè)小時(shí)。反應(yīng)完畢后，用飽和 氯化銨淬滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，柱層析分離得到產(chǎn)物。 (270mg，收率：83% )m/z 444.6 (M+1)
[0227] 步驟2 :7-氟-3-(2-氯-4-溴苯基氨基）-4-甲基-5-氧代-4, 5-二氫呋喃并 [3, 2-b]吡啶-2-羧酸的合成
[0229] 將化合物7-氟-3-(2-氯-4-溴苯基氨基）-4_甲基-5-氧代-4, 5-二氫呋喃并 [3,2-b]吡啶-2-羧酸乙酯（270mg，0.61mmol)加入反應(yīng)瓶中，加入乙醇（10ml)，然后加入 IM NaOH(l. 22ml，I. 22mmol)，加熱至60°C反應(yīng)2個(gè)小時(shí)，冷卻至室溫，加入乙酸調(diào)PH至4， 析出固體，過(guò)濾，真空干燥得到目標(biāo)化合物。（250mg，99%)m/z 447. 1(M+1)
[0230] 步驟3 :7_氣-3-(2-氣-4-漠苯基氛基）_4_甲基-5-氧代-N-(2_(乙稀氧基） 乙氧基）-4, 5-二氫呋喃并[3, 2-b]吡啶-2-甲酰胺的合成：
[0232] 將化合物7-氟-3-(2-氯-4-溴苯基氨基）-4_甲基-5-氧代-4, 5-二 氫呋喃并[3, 2-b]吡啶-2-羧酸（70mg，0. 17mmol)和0-(2-(乙烯基氧基）乙 基）輕胺（26mg，0. 25mmol)加入反應(yīng)瓶中，然后加入H0Bt(34mg，0. 25mmol)和 EDCI (48mg，0. 25mmol)，在室溫下反應(yīng)3個(gè)小時(shí)，反應(yīng)完畢后，加入水稀釋反應(yīng)液，用乙酸 乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮得到粗產(chǎn)物直接用于下一步。 (80mg，收率：95% )。
[0233] 步驟4 :7-氟-3- (2-氯-4-溴苯基氨基）-N- (2-羥基乙氧基）-4-甲基-5-氧 代-4, 5-二氫呋喃并[3, 2-b]吡啶-2-甲酰胺的合成：
[0235] 將化合物7-氟-3-(2-氯-4-溴苯基氨基）-4-甲基-5-氧代-N-(2-(乙烯氧 基）乙氧基）-4, 5-二氫呋喃并[3, 2-b]吡啶-2-甲酰胺（80mg，0. 16mmol)加入反應(yīng)瓶中， 加入甲醇（2ml)，然后加入IM鹽酸（0.32ml，0.32mmol)，在室溫下反應(yīng)一個(gè)小時(shí)，反應(yīng)完 畢后，濃縮除去甲醇，用飽和碳酸氫鈉溶液中和，乙酸乙酯萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，柱層析分 離得到產(chǎn)物。（40mg,收率：53% )。1H NMR(400MHz, DMS0-d6) δ 7. 62 (dd, 1H)，7. 36 (d, 1H) ,6. 49 (m, 1H), 6. 23 (d, 1H), 4. 91-4. 35 (bs, 1H), 3. 74 (m, 2H), 3. 51 (m, 2H), 3. 25 (s, 3H). m/z 475. 7(M+1)
[0236] 實(shí)施例8 : (S) -3- (4-溴-2-氯苯基氨基）-7-氟-N- (2-羥基丙氧基）-4-甲 基-5-氧代_4, 5-二氫呋喃并[3, 2-b]吡啶-2-甲酰胺的合成：
[0238] 步驟I : (S) _3_ (4_漠_2_氣苯基氛基）-N- (2_ (叔丁基二甲基娃氧基）丙氧 基）-7-氟-4-甲基-5-氧代-4, 5-二氫呋喃并[3, 2-b]吡啶-2-甲酰胺的合成：
[0240] 將化合物3-(4-溴-2-氯苯基氨基）-7_氟-4-甲基-5-氧代-4, 5-二氫 呋喃并[3, 2-b]吡啶-2-羧酸（70mg，0. 17mmol)和（S)-0-(2-(叔丁基二甲基硅氧 基）丙氧基）輕胺（51mg, 0· 25mmol)加入反應(yīng)瓶中，然后加入HOBt (34mg, 0· 25mmol) 和EDCI(48mg，0. 25mmol)，在室溫下反應(yīng)3個(gè)小時(shí)，反應(yīng)完畢后，加入水稀釋反應(yīng)液， 用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮得到粗產(chǎn)物直接用于 下一步。（lOOmg，收率：98% )。m/z 604 (M+1)。步驟 2: (S)-3-(4-溴-2-氯苯基氨 基）-7-氟-N-(2-羥基丙氧基）-4-甲基-5-氧代-4, 5-二氫呋喃并[3, 2-b]吡啶-2-甲 酰胺的合成：
[0242] 將化合物（S)-3-(4-溴-2-氯苯基氨基）-N-(2-(叔丁基二甲基硅氧基）丙氧 基）-7-氟-4-甲基-5-氧代-4,5-二氫呋喃并[3,2-13]吡啶-2-甲酰胺（10011^，0.16臟〇1) 加入反應(yīng)瓶中，加入THF(2ml)，然后加入IM四丁基氟化銨（0. 32ml，0. 32mmol)，在室溫下反 應(yīng)一個(gè)小時(shí)，反應(yīng)完畢后，濃縮除去甲醇，用飽和碳酸氫鈉溶液中和，乙酸乙酯萃取，無(wú)水硫 酸鈉干燥，柱層析分離得到產(chǎn)物。（40mg，收率：49%)。 1H NMR(400MHz，DMS0-d6) δ7. 62(d d, 1H), 7. 34 (d, 1H), 6. 51 (m, 1H), 6. 23 (d, 1H), 4. 62 (bs, 1H), 3. 78-3. 53 (m, 2H), 3. 46 (m, 1H) ,I. 21 (d, 2H). m/z489. 7 (M+l)
[0243] 實(shí)施例9 :3-(4-溴-2-氯苯基氨基）-7-氟-N-(2-羥基乙氧基）-4-甲基-5-氧 代-4, 5-二氫基噻吩并[3, 2-b]吡啶-2-甲酰胺的合成：
[0245] 步驟I :3-(4-溴-2-氯苯基氨基）-7_氟-4-甲基-5-氧代-4, 5-二氫噻吩并 [3, 2-b]吡啶-2-羧酸乙酯的合成：
[0247] 將化合物4-溴-2-氯苯胺（171mg，0. 83mmol)加入反應(yīng)瓶中，加入無(wú)水 1'冊(cè)(1.51111)，在-78°(：氮?dú)夥諊孪蚍磻?yīng)液中滴加1^腿05(1]\1，2.181111，2.18臟〇1)，在-78 1€ 反應(yīng)30分鐘后，加入化合物3-氯-7-氟-4-甲基-5-氧代-4, 5-二氫噻吩并[3, 2-b]吡 啶-2-羧酸乙酯（200mg，0. 69mmol)，在-78°C至室溫反應(yīng)2個(gè)小時(shí)。反應(yīng)完畢后，用飽和 氯化銨淬滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，柱層析分離得到產(chǎn)物。 (270mg，收率：85% )。m/z461(M+l).
[0248] 步驟2 :3-(4-溴-2-氯苯基氨基）-7-氟-4-甲基-5-氧代-4, 5-二氫噻吩并 [3, 2-b]吡啶-2-羧酸的合成：
[0249]
[0250] 將化合物3- (4-溴-2-氯苯基氨基）-7-氟-4-甲基-5-氧代-4, 5-二氫噻吩并 [3,2-b]吡啶-2-羧酸乙酯（270mg，0. 59mmol)加入反應(yīng)瓶中，加入乙醇（10ml)，然后加入 IM NaOH(l. 2ml，I. 2mmol)，加熱至60°C反應(yīng)2個(gè)小時(shí)，冷卻至室溫，加入乙酸調(diào)PH至4,析 出固體，過(guò)濾，真空干燥得到目標(biāo)化合物。（251mg, 99% )。
[0251] 步驟3 :3- (4-溴-2-氯苯基氨基）-7-氟-4-甲基-5-氧代-N- (2-(乙烯基氧基） 乙氧基）-4, 5-二氫噻吩并[3, 2-b]吡啶-2-甲酰胺的合成：
[0253] 將化合物3-(4-溴-2-氯苯基氨基）-7_氟-4-甲基-5-氧代-4, 5-二 氫噻吩并[3, 2-b]吡啶-2-羧酸（60mg，0· 14mmol)和0-(2-(乙烯基氧基）乙 基）輕胺（21mg，0. 21mmol)加入反應(yīng)瓶中，然后加入H0Bt(28mg，0. 21mmol)和 EDCI (40mg，0. 21mmol)，在室溫下反應(yīng)3個(gè)小時(shí)，反應(yīng)完畢后，加入水稀釋反應(yīng)液，用乙酸 乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮得到粗產(chǎn)物直接用于下一步。 (70mg，收率：97% )。
[0254] 步驟4 :3-(4-溴-2-氯苯基氨基）-7_氟-N-(2-羥基乙氧基）-4_甲基-5-氧 代-4, 5-二氫噻吩并[3, 2-b]吡啶-2-甲酰胺的合成：
[0256] 將化合物3- (4-溴-2-氯苯基氨基）-7-氟-4-甲基-5-氧代-N- (2-(乙烯基氧 基）乙氧基）-4, 5-二氫噻吩并[3, 2-b]吡啶-2-甲酰胺（70mg，0. 14mmol)加入反應(yīng)瓶中， 加入甲醇（2ml)，然后加入IM鹽酸（0.30ml，0.30mmol)，在室溫下反應(yīng)一個(gè)小時(shí)，反應(yīng)完 畢后，濃縮除去甲醇，用飽和碳酸氫鈉溶液中和，乙酸乙酯萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，柱層析分 離得到產(chǎn)物。（30mg,收率：45% )。1H NMR(400MHz, DMS0-d6) δ 7. 63 (dd, 1H)，7. 35 (d, 1H) ,6. 48 (m, 1H), 6. 21 (d, 1H), 4. 91-4. 35 (bs, 1H), 3. 74 (m, 2H), 3. 51 (m, 2H), 3. 25 (s, 3H). m/z 491. 7(M+1) 〇
[0257] 實(shí)施例10:(S)-3_(4-溴-2-氯苯基氨基）-7-氟-N_(2-羥基丙氧基）-4-甲 基-5-氧代_4, 5-二氫噻吩并[3, 2-b]吡啶-2-甲酰胺的合成：
[0259] 步驟I : (S) _3_ (4_漠_2_氣苯基氛基）-N- (2_ (叔丁基二甲基娃氧基）丙氧 基）-7-氟-4-甲基-5-氧代-4, 5-二氫噻吩并[3, 2-b]吡啶-2-甲酰胺的合成：
[0261] 將化合物3-(4-溴-2-氯苯基氨基）-7_氟-4-甲基-5-氧代-4, 5-二氫 噻吩并[3, 2-b]吡啶-2-羧酸（60mg，0. 14mmol)和（S)-0-(2-(叔丁基二甲基硅氧 基）丙氧基）輕胺（43mg, 0· 21mmol)加入反應(yīng)瓶中，然后加入HOBt (28mg, 0· 21mmol) 和EDCI(40mg，0. 21mmol)，在室溫下反應(yīng)3個(gè)小時(shí)，反應(yīng)完畢后，加入水稀釋反應(yīng)液， 用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮得到粗產(chǎn)物直接用于 下一步。（86mg，收率：100%)。m/z 620(M+1)。步驟 2:(S)-3-(4-溴-2-氯苯基氨 基）-7-氟-N-(2-羥基丙氧基）-4-甲基-5-氧代-4, 5-二氫噻吩并[3, 2-b]吡啶-2-甲 酰胺的合成：
[0263] 將化合物（S)_3_(4_漠_2_氣苯基氛基）-N-(2_(叔丁基二甲基娃氧基）丙氧 基）-7-氟-4-甲基-5-氧代-4, 5-二氫噻吩并[3, 2-b]吡啶-2-甲酰胺（86mg，0. 14mmol) 加入反應(yīng)瓶中，加入THF(2ml)，然后加入IM四丁基氟化銨（0. 28ml，0. 28mmol)，在室溫下反 應(yīng)一個(gè)小時(shí)，反應(yīng)完畢后，濃縮除去甲醇，用飽和碳酸氫鈉溶液中和，乙酸乙酯萃取，無(wú)水硫 酸鈉干燥，柱層析分離得到產(chǎn)物。（33mg，收率：47% )。1H NMR(400MHz，DMS0-d6) δ 7. 61 (d d, 1H), 7. 33 (d, 1H), 6. 51 (m, 1H), 6. 21 (d, 1H), 4. 62 (bs, 1H), 3. 78-3. 53 (m, 2H), 3. 46 (m, 1H) ,I. 21 (d, 2H). m/z505. 7 (M+l)
[0264] 生物學(xué)實(shí)施例
[0265] 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)
[0266] 1.細(xì)胞：人結(jié)腸癌C0L0205、人黑色素瘤A375細(xì)胞，均來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī) 學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。
[0267] 2.試劑：Gibco DMEM/F12培養(yǎng)基，Gibco 0. 25%胰酶/EDTA細(xì)胞消化液，MTT(5mg/ ml)，DMSO, PBS。
[0268] 3.儀器：37°C，5% 0)2培養(yǎng)箱，TECAN Infinite ?200系列多功能酶標(biāo)儀，超凈工作 臺(tái)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板。
[0269] 4.實(shí)驗(yàn)耗材：96孔板。
[0270] 人結(jié)腸癌C0L0205細(xì)胞的活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)步驟：
[0271] 1.鋪板。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用消化液消化，新鮮培養(yǎng)基終止，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行 計(jì)數(shù)，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整到5*10 4個(gè)/ml，每孔加200 μ L，設(shè)調(diào)零孔（只加培養(yǎng) 基）3個(gè)，其他邊緣用無(wú)菌PBS填充。
[0272] 2.于37°C下在5% CO2中孵育24小時(shí)，讓細(xì)胞鋪滿孔底60%左右。
[0273] 3.給藥。將藥物用DMSO溶解，配成lOmmol/L母液，再用DMSO將其進(jìn)行稀釋?zhuān)?成 lmmol/L、100 μ mol/L、10 μ mol/L、lmol/L、0. lmol/L 溶液，給藥時(shí)，取上述濃度溶液 1 μ L 用培養(yǎng)基稀釋成 lmL，即給藥濃度為 10 μ mol/L、