長因子（KGF)以促進前腸內(nèi) 胚層形成。在此培養(yǎng)基中孵育細胞約24小時，之后將培養(yǎng)物替換成基本上相同的培養(yǎng)基， 除了此刻從培養(yǎng)物中去除TGF-β激酶抑制劑。在培養(yǎng)基改變情況下，在此培養(yǎng)基（去掉 TGF-β激酶抑制劑）孵育細胞5天。
[0206] 將被理解的是，對于發(fā)生可允許的培養(yǎng)基改變的階段2,可以在此培養(yǎng)基（去掉 TGF-β激酶抑制劑）中孵育細胞長達約3天。從第0天開始，多能干細胞的分化總天數(shù)為 約3-5天，優(yōu)選約4-5天，更優(yōu)選約5天。
[0207] 此外，用于確定培養(yǎng)物的組成的方法之前已描述于上文相關(guān)申請中，但是主要通 過本領(lǐng)域熟知的rna和蛋白測定進行。前腸內(nèi)胚層細胞或roxi陰性的前腸內(nèi)胚層細胞 表達高水平的某些標簽細胞表面標志物，如Soxl7、HNF3-I3和HNF4-a。這區(qū)別于階段1 的DE，其不會可感知地表達HNF4_a，但是確實可感知地表達另外兩種標志物，即Soxl7和 HNF3-0 WDX1陰性的前腸細胞也不會可感知地表達在例如之后的階段3、4或5的細胞中觀 察到的標志物，或者在Η)Χ1陽性的前腸內(nèi)胚層細胞中表達的Η)Χ1、NNF6、S0X9和PR0X 1，或 者在roxi陽性的胰腺祖細胞或PDX1/NKK6.1共陽性的胰腺祖細胞中表達的PDXUNKX6.1、 PTF1A、CPA和cMYC，或者在內(nèi)分泌前體細胞中表達的NGN3、PAX4、ARX和NKX2. 2,或者在多 激素或單激素胰腺內(nèi)分泌細胞中表達的INS、GCG、GHRL、SST或PP。
[0208] 階段3的分化條件
[0209] 為了促進階段2的roxi陰性的前腸內(nèi)胚層細胞分化為roxi陽性的前腸內(nèi)胚層細 胞，替換roxi陰性的前腸內(nèi)胚層細胞培養(yǎng)基，并在包含下述成分的培養(yǎng)基中孵育：DMEM高 葡萄糖/1 %Glutamax/1 %Pen-Sr印/1 %B27補充物，并含有約1或2μΜ的視黃酸（RA)、約 0. 25μΜ的KAAD-環(huán)巴胺，以及含有或不含有約50ng/mL的頭蛋白?？蛇x擇地，一些培養(yǎng)物 加入InM至約3nM的芳香族類維生素A(E)-4-[2-(5, 6, 7, 8-四氫-5, 5, 8, 8-四甲基-2-萘 基）_1_丙基]苯甲酸（TTNPB)，代替加入RA。其它培養(yǎng)物還加入約ImM的dorsomorphin。 在此培養(yǎng)基中孵育細胞約3天。將被理解的是，可以孵育細胞約1-5天，優(yōu)選2-4天，更優(yōu) 選3天。
[0210] 類似于上文，用于確定培養(yǎng)物組成的方法之前已描述于上文相關(guān)申請中，但是主 要通過本領(lǐng)域熟知的rna和蛋白測定進行。除roxi外，roxi陽性的前腸內(nèi)胚層細胞表達高 水平的某些標簽細胞表面標志物，例如Sox9、HNF6和PR0X1，但不會可感知地表達在例如之 后的階段4或5的細胞中的其它標志物，或者在胰腺祖細胞中發(fā)現(xiàn)的H)X1、NKX6. 1、PTF1A、 PCA和cMYC，或者在內(nèi)分泌前體細胞中表達的NGN3、PAX4、ARX和NKX2. 2,或者在多激素或 單激素胰腺內(nèi)分泌細胞中表達的INS、GCG、GHRL、SST或PP。
[0211]階段4的分化條件
[0212] 為了進一步促進正確分化的TOX1/NKX6. 1共陽性的胰腺祖細胞從roxi陽性的前 腸內(nèi)胚層細胞的分化，替換roxi陽性的前腸內(nèi)胚層細胞培養(yǎng)基，并在包含如上文階段3中 的類似基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中孵育，即DMEM高葡萄糖/1%Glutamax/l%Pen-Sr印/1% B27補充物，除了不含RA或視黃酸衍生物，例如TTNPB或頭蛋白或dorsomorphin。相反，向 培養(yǎng)物中加入約50ng/mL的頭蛋白、KGF和FGF。將被理解的是，可以向培養(yǎng)物中加入約10 至100ng/mL的表皮生長因子和成纖維細胞生長因子（EGF和FGF)。優(yōu)選向培養(yǎng)物中加入 約10至50ng/mL或優(yōu)選地約10ng/mL的EGF和約50ng/mL的FGF?？蛇x擇地，可以不向培 養(yǎng)物中加入FGF，或者使用頭蛋白、KGF、FGF各25-100ng/mL，或者優(yōu)選地約50ng/mL的頭蛋 白、KGF和FGF。在培養(yǎng)基替換情況下，在此培養(yǎng)基中保持細胞約4至5天。將被理解的是， 在可允許的培養(yǎng)基替換的情況下，可以在此培養(yǎng)基中保持細胞約2至6天，優(yōu)選3至5天， 甚至更優(yōu)選4至5天。
[0213] 類似于上文，用于確定培養(yǎng)物組成的方法之前已描述于上文相關(guān)申請中，但是主 要通過本領(lǐng)域熟知的RNA和蛋白測定進行。PDX1/NKK6. 1共陽性的胰腺祖細胞或內(nèi)胚層 細胞表達高水平的某些標簽細胞表面標志物，如roXl、NKX6. 1、PTF1A、CPA和cMYC，但不 會可感知地表達在之后的階段的細胞中發(fā)現(xiàn)的其它標志物，例如在內(nèi)分泌前體細胞中表達 的NGN3、PAX4、ARX和NKX2. 2,或者在多激素或單激素胰腺內(nèi)分泌細胞中表達的INS、GCG、 GHRL、SST或PP。
[0214] PDX1陽件的腠腺祖細朐的務(wù)棺和純化
[0215] 在階段4的細胞培養(yǎng)基中約3-5天后，制備細胞培養(yǎng)物用于：i)流式細胞術(shù)分離 和/或純化和分析；ii)如上文更為詳細討論的將細胞包封進包封裝置；和/或iii)移植 到哺乳動物中?？蛇x擇地，來自階段4的細胞培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移進或適應(yīng)培養(yǎng)基約1至2天，該 培養(yǎng)基具有DMEM高葡萄糖/1 %Glutamax/1 %Pen-Sr印/1 %B27補充物，去掉生長因子，然 后進行流式細胞術(shù)和/或移植。
[0216] 用于富集、分開、分離和/或純化胰腺祖細胞和/或胰腺內(nèi)分泌細胞或內(nèi)分泌前體 細胞的詳細內(nèi)容詳細描述于2008年4月8日提交的題為"用于純化源于hES細胞的內(nèi)胚層 和胰腺內(nèi)胚層細胞的方法"的美國申請No. 12/107, 020中，其通過引用以其全文并入本文。
[0217] 簡單而言，CD142用于富集Η)Χ1陽性的胰腺祖細胞（或胰腺上皮細胞或PE)，這 是通過用PBS快速洗滌，然后使用TrypLE和3%FBS/PBS/lmMEDTA(分選緩沖液）酶促解 離成基本上單個細胞的懸液完成的。該單個細胞的懸液通過40-100μΜ過濾器，然后成團， 在分選緩沖液中再次洗滌，再次成團，之后以約1X10s個細胞/mL在分選緩沖液中再次重 懸為基本上單個細胞的懸液。用藻紅蛋白綴合的抗小鼠⑶142抗體（BDPHARMIGEN?)以 10μ1/1X107個細胞孵育重懸的細胞。用體積分選緩沖液洗滌細胞至少一次，成團并在含 抗藻紅蛋白微珠(MiltenyiBiotec)的溶液的分選緩沖液中再次重懸為基本上單個細胞的 懸液，并孵育。洗滌細胞至少一次，并進行CD142陽性細胞的免疫磁篩選。分別收集預(yù)分選 的、結(jié)合的和流過的部分，并用抗-PDX1和/或抗CHGA復(fù)染。
[0218] 相比預(yù)分選的和流過的部分，結(jié)合部分高度富集了⑶142陽性的細胞和Η)Χ1陽 性的胰腺祖細胞。參見美國專利申請No. 12/107,020的表9。例如，相比預(yù)分選組分中的 約22% Η)Χ1陽性的胰腺祖細胞和流過組分的約8% Η)Χ1陽性的胰腺祖細胞，抗⑶142陽 性的或結(jié)合組分由約71%roxi陽性的胰腺祖細胞組成。因此，相對于預(yù)分選細胞群，在抗 ⑶142陽性的或結(jié)合組分中具有約3倍富集的roxi陽性的胰腺祖細胞。并且，⑶142陽性 的或結(jié)合組分沒有嗜絡(luò)粒細胞A(CHGA)陽性的細胞，這指示沒有在此細胞群中選擇或富集 多或單激素內(nèi)分泌細胞。因此，CD142可以用于陽性免疫篩選以富集和/或純化roxi陽性 的胰腺祖細胞或上皮細胞，而用胰腺內(nèi)分泌型細胞富集流過組分（沒有結(jié)合到抗體柱上的 組分或細胞；或⑶142-)。并且，參考美國專利申請No. 12/07, 020的表10。
[0219] 實施例5
[0220] 體內(nèi)成熟的腠腺祖細朐改善糖尿病誘導(dǎo)動物的低血糖癥
[0221] 為了確定roxi陽性的胰腺祖細胞培養(yǎng)物或富集的細胞群，包括冷凍保存的細胞 群是否完全能體內(nèi)發(fā)育和成熟為葡萄糖敏感性的胰島素分泌細胞，使用帶有平頭適當(dāng)尺寸 型號針頭的Hamilton注射器或根據(jù)廠商的方法的離心裝載方法，將祖細胞群裝載進類似 于上文實施例1和實施例2所述的包封裝置中。
[0222] 在將細胞裝載進裝置前，認為該裝置適于在包括人的哺乳動物中移植和使用，例 如該裝置已通過包括滅菌的質(zhì)量控制典型標準。由于裝置的膜部件可能由疏水膜，例如 PTFE組成，并因此排斥水，通常通過在醇溶劑（例如95%ΕΤ0Η)中潤濕裝置，然后在鹽水溶 液中重復(fù)洗滌它們，而實現(xiàn)裝置的滅菌。因此，在裝載之前應(yīng)該保持裝置濕潤。理想地，在 確保植入的任何裝置部件將不被不想要的細胞污染的無菌條件下實施任何裝置裝載方法。
[0223] 可以通過使用加上平頭適當(dāng)尺寸型號的無菌針頭等（尺寸將依據(jù)裝置的開口的 直徑而變化），例如22號針頭的Hamilton注射器等進行裝置裝載。針頭連接于適合的 Hamilton注射器，并含有約 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95、100或更多μL的反映治療有效量或劑量的細胞的細胞體積。然后將針頭插入裝置的至 少一個開口，并插入腔（或腔室或儲庫），但不接觸裝置的壁?；旧蠈⒆⑸淦鞯娜績?nèi)容 物緩慢地排入到裝置中，同時抽出針頭。
[0224] 可選擇地，使用針頭裝載裝置的另一個方法為通過使用無菌塑料或硅開口管，其 將裝置開口連接到針頭，針頭插入該開口而非腔中。在此方法中，將硅粘合劑注射到硅開口 管中，從裝置開口成壁或密封。然后切下該開口管，并檢查漏洞或裂縫。
[0225] 為了使用離心方法裝載裝置，將含有治療有效量或劑量的細胞的一定量的細胞吸 取到微量移液器的吸頭中，并使該吸頭與裝置開口接觸。還可以將裝置和移液器吸頭放入 較大的容器或離心機錐形管中，固定或不固定。通常將一定體積的培養(yǎng)基層加在移液器吸 頭以及在較大的錐形管中的細胞懸液的頂部。然后在約lOOOrpm下離心錐形管數(shù)分鐘，優(yōu) 選20秒至約2分鐘，或者直到細胞被裝載到裝置中。之后，非常小心地去除裝載部件，并放 置好裝載的裝置。
[0226] 然后制備裝置中包封的細胞用于植入哺乳動物中，例如免疫系統(tǒng)損傷的小鼠（例 如SCID/Bg)、大鼠、更大的哺乳動物或人類受試者。植入包封的細胞和裝置的方法基本上 如上文的實施例1和2以及Kroon等人2008年所述，除了在Kroon等人中植入GELF0AM上 的細胞而非包含在裝置中的。然而，由于包封的細胞群基本上含有類似于Kroon等人2008 年和2007年7月5日提交的題為"生產(chǎn)胰腺激素的方法"的美國專利No. 7, 534, 608 (其通 過引用以其全文并入本文）中所述的祖細胞群，所以用于確定細胞功能性的試驗也基本相 同。簡單而言，通過給動物注射一定量的精氨酸或葡萄糖，優(yōu)選葡萄糖來測試動物約每2、 3或4周，如果包封的細胞現(xiàn)在已經(jīng)體內(nèi)適當(dāng)?shù)爻墒鞛棣录毎?，其將響?yīng)葡萄糖而分泌胰 島素。簡而言之，和天然產(chǎn)生的β細胞相同，成熟β細胞響應(yīng)葡萄糖。從哺乳動物收集血 液，以確定人C-肽的水平，該人C-肽分泌自已成熟為人β細胞的人移植的祖細胞。早在 移植后4至6周就可以在動物血清中檢測出人C-肽，并且經(jīng)時間推移，隨著更多祖細胞或 內(nèi)分泌前體細胞成熟為正確發(fā)揮功能的β細胞，人C-肽的水平上升。通常認為人C-肽大 于50ρΜ的量為移植的細胞的功能指征。之前顯示來自roxi陽性的胰腺祖細胞的移植細胞 確實產(chǎn)生了表達標志物和具有功能性胰腺激素分泌細胞的生理特征的內(nèi)分泌細胞。參見上 文的Kroon等人2009年和2007年7月5日提交的題為"生產(chǎn)胰腺激素的方法"的美國申 請11/773, 944,其通過引用以其全文并入本文。
[0227] 對于某些哺乳動物，考慮到最初間歇期的免疫抑制，直到裝置內(nèi)的祖細胞完全成 熟并響應(yīng)葡萄糖。在一些哺乳動物中，免疫抑制方案可以長達約1、2、3、4、5、6或更多周，并 可能取決于哺乳動物。
[0228] 最后，類似于Kroon等人2008年，包封的細胞不僅成熟為具有內(nèi)分泌細胞的胰腺 胰島簇，而且發(fā)育為胰島相關(guān)細胞，例如腺泡細胞。因此，移植的roxi陽性的胰腺祖細胞不 一定僅成為單激素的內(nèi)分泌分泌細胞，而是能夠成熟和發(fā)育為基本上類似人胰島的細胞， 包括內(nèi)分泌和腺泡細胞。并且觀察這種移植細胞的體內(nèi)成熟和葡萄糖響應(yīng)，是否培養(yǎng)了祖 細胞（PDX1/NKX6. 1共陽性的細胞；內(nèi)分泌前體細胞，或某些多激素或單激素細胞），并且體 外分化和隨后移植，或者是否在移植前純化或富集了某些祖細胞，或者它們是否之前已由 一個或多個批次制備并冷凍保存、解凍和適應(yīng)移植前培養(yǎng)。
[0229] 簡而言之，移植后，使移植的細胞體內(nèi)分化和進一步成熟。為了確定移植的細胞是 否具有如例如天然產(chǎn)生的β細胞的正常生理功能，通過測試人C-肽的水平測定人胰島素 的水平。人C-肽由人胰島素原切割或加工，因此人C-肽而非內(nèi)源性小鼠C肽的檢測顯示 了胰島素分泌來源于移植的（外源的）細胞。
[0230] 在移植后不同時間點測量血清中移植細胞的葡萄糖刺激的人C-肽分泌。將被理 解的是，可以在不同時間點測量葡萄糖刺激的人C-肽分泌，例如至少30、35、40、45、50、55、 60、65和更多天。葡萄糖刺激的人C-肽水平可以在早在葡萄糖服用或注射后約15分鐘時 在血清中準確測定。以葡萄糖服用后約15、30和60分鐘的時間間隔從動物中取血。根據(jù)廠 商的描述（BectonDickinson)通過在微量容器中離心，將血清與血細胞分離。使用超敏人 特異性C-肽ELISA平板（Alpco)進行血清的ELISA分析。通常，如通過大于50pM人C-肽 閾值水平的水平所證明的，接受包封的移植細胞的絕大多數(shù)的動物響應(yīng)葡萄糖。
[0231] 總之，通過上文裝置完全包封的細胞不影響細胞的成熟，一旦細胞成熟后也不影 響細胞的生理功能。此外，在這些糖尿病誘導(dǎo)動物中觀察到了低血糖癥的改善，且基本上類 似于上文的Kroon等人（2008年）以及在美國專利No. 7, 534, 608中之前所述的，盡管這兩 篇文獻沒有描述完全包封的移植細胞或移植物。這些參考文獻通過引用以其全文并入本 文。
[0232] 相應(yīng)地，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以對本文所述的實施方案進行不同 的替代、修飾或優(yōu)化、或者組合，而不偏離本發(fā)明的范圍和精神。
[0233] 本說明書提及的所有出版物和專利通過引用以其全文并入本文。
[0234] 如下文的權(quán)利要求書和整個公開內(nèi)容中所用的，短語"基本上由……組成"是指包 括該短語后列出的任何元素，并且限于不干擾或促進本公開內(nèi)容針對所列出的元素而限定 的活性或活動的其它元素。因此，短語"基本上由……組成"表明所列出的元素是必須的或 強制的，但是其它元素是任選的，并且存在與否取決于它們是否影響所列出的元素的活性 或活動。
【主權(quán)項】
1. 一種用于在哺乳動物中體內(nèi)生成胰島素的方法，所述方法包括： (a) 向可植入的半滲透裝置中提供體外人roxi陽性的胰腺祖細胞群； (b) 將具有所述細胞祖細胞群的裝置植入到哺乳動物宿主中；和 (c) 使所述祖細胞群在所述裝置中體內(nèi)成熟，使得所述祖細胞群包含內(nèi)分泌細胞和腺 泡細胞，其中至少部分所述內(nèi)分泌細胞為響應(yīng)體內(nèi)葡萄糖刺激而生成胰島素的胰島素分泌 細胞，從而為所述哺乳動物生成胰島素。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包括使roxi陽性的胰腺祖細胞成熟為腺泡細胞 或?qū)Ч芗毎?. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裝置通過植入所述哺乳動物中而首先預(yù)血管 化。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裝置包含多個焊接部分，用于使所述裝置中的 人roxi陽性的胰腺祖細胞群的表面積與容積比最大化。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裝置包含多個焊接部分，以提高所述宿主進行 的血管化。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裝置是可重裝填的。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裝置是可擴展的。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中監(jiān)測所述體內(nèi)細胞群。9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中在葡萄糖刺激后所述哺乳動物的血清中可檢測到大 于25pM的胰島素。10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中在葡萄糖刺激后所述哺乳動物的血清中可檢測到 大于50pM的人C-肽。11. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細胞群與所述宿主哺乳動物的一個或多個細 胞分隔開。12. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物是經(jīng)免疫抑制的。13. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中提供人roxi陽性的胰腺祖細胞群包括解凍細胞群。14. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中提供人roxi陽性的胰腺祖細胞群還包括富集所述 細胞群的TOX1/NKX6. 1共陽性的胰腺祖細胞。15. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中提供人roxi陽性的胰腺祖細胞群還包括通過使所 述細胞群接觸結(jié)合CD142抗原的抗體以及富集所述CD142結(jié)合細胞而富集所述細胞群的 PDX1/NKX6. 1共陽性的胰腺祖細胞。16. -種用于植入到哺乳動物宿主中的細胞包封組件，所述組件包含用于包封活細胞 的至少一個腔室，其中所述組件包括第一密封件和第二密封件，所述第一密封件位于所述 組件的外周邊緣處從而形成所述包封組件，所述第二密封件有效降低腔室容積但提高裝置 的表面積。17. 如權(quán)利要求16所述的組件，其中所述組件包含半滲透膜。18. 如權(quán)利要求16所述的組件，其中所述組件具有第三或第四密封件，并進一步降低 所述腔室容積。19. 如權(quán)利要求16所述的組件，其進一步包含至少一個裝載口。20. 如權(quán)利要求16所述的組件，其包含2個裝載口。21. 如權(quán)利要求16所述的組件，其中所述組件進一步包含活細胞。22. 如權(quán)利要求21所述的組件，其中所述活細胞為人roxi陽性的胰腺祖細胞。23. -種冷凍保存的人胰腺祖細胞群，其中所述細胞群適于移植到哺乳動物中。24. 如權(quán)利要求23所述的細胞群，其中所述細胞群的細胞能夠在所述哺乳動物中成熟 為胰島細胞或腺泡細胞。25. 如權(quán)利要求23所述的細胞群，其中所述細胞群的細胞能夠成熟為β細胞，所述β 細胞能夠響應(yīng)葡萄糖刺激而分泌胰島素。26. 如權(quán)利要求23所述的細胞群，其中所述胰腺祖細胞群包含Η)Χ1陽性的胰腺祖細 胞。27. -種保存適于移植的細胞的體外群的方法，所述方法包括： a) 人胰腺祖細胞群接觸冷凍保存溶液，從而保存用于冷凍保存的細胞體外群；和 b) 降低所述用于冷凍保存的祖細胞的溫度至低于約0°C，從而獲得適于移植的胰腺祖 細胞群。28. 如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述用于冷凍保存的祖細胞的溫度降低至低于 約-50°C。29. 如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述用于冷凍保存的祖細胞的溫度降低至低于 約-10(TC〇30. 如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述用于冷凍保存的祖細胞的溫度降低至低于 約-150°C。31. 如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述用于冷凍保存的祖細胞的溫度降低至低于 約-190°C。32. -種提供適于移植的細胞的體外群的方法，所述方法包括提高冷凍保存的細胞群 的溫度，以獲得適于移植的胰腺祖細胞群。33. 如權(quán)利要求32所述的方法，其進一步包括將所述細胞群提供給細胞包封組件的步 驟。34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細胞包封組件為如權(quán)利要求16所述的組件。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于在生物相容性半滲透包封裝置中包封胰腺祖細胞的方法。本發(fā)明還涉及在哺乳動物中響應(yīng)葡萄糖刺激生成人胰島素。
【IPC分類】A01N1/02, C12N11/00, C12N5/071, C12P21/02
【公開號】CN105349517
【申請?zhí)枴緾N201510760059
【發(fā)明人】勞拉·馬丁森, 喬德·格林, 依文特·克魯恩, 艾倫·奧古爾尼克, 奧利維亞·凱利, 凱文·德阿穆爾, 伊曼紐爾·E·拜特格
【申請人】維賽特公司
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2009年11月13日
【公告號】CA2743641A1, CN102282254A, CN102282254B, EP2356227A2, EP2356227A4, US8278106, US8425928, US9132226, US20100124564, US20110280915, US20130209425, US20130261568, US20160038640, US20160067380, WO2010057039A2, WO2010057039A3