分或細 胞，例如本文所述的胰腺祖細胞為"實質(zhì)上或基本上同質(zhì)的"、"實質(zhì)上或基本上同-細胞的 (homo-cellular)"、"實質(zhì)上hES細胞"、"實質(zhì)上或基本上定形內(nèi)胚層細胞"、"實質(zhì)上或基 本上前腸內(nèi)胚層細胞"、"實質(zhì)上或基本上腸內(nèi)胚層細胞"、"實質(zhì)上或基本上roxi陰性的前 腸內(nèi)胚層細胞"、"實質(zhì)上或基本上roxi陽性的前胰腺內(nèi)胚層細胞"、"實質(zhì)上或基本上roxi 陽性的前胰腺祖細胞"、"實質(zhì)上或基本上胰腺上皮細胞"、"實質(zhì)上或基本上roxi陽性的胰 腺內(nèi)胚層端細胞"、"實質(zhì)上或基本上胰腺內(nèi)胚層前體細胞"、"實質(zhì)上或基本上胰腺內(nèi)分泌 細胞"等。術(shù)語"實質(zhì)上"和"基本上"還可以表示至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%該細胞（定形內(nèi)胚層；PDX1陰性的前腸 內(nèi)胚層；roxi陽性的前胰腺內(nèi)胚層；roxi陽性的胰腺祖細胞；roxi陽性的胰腺端細胞；內(nèi) 分泌前體細胞，和內(nèi)分泌激素分泌細胞）。
[0046] 本文使用的術(shù)語化合物的"有效量"或其等同物是指該化合物的濃度在存在所限 定的培養(yǎng)基的剩余組分下足以實現(xiàn)培養(yǎng)物中的可分化細胞在缺乏培養(yǎng)層細胞和在缺乏血 清或血清替代物時穩(wěn)定超過一個月。該濃度可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。
[0047] 本文使用的術(shù)語"表達"是指細胞中多核苷酸的轉(zhuǎn)錄或多肽的翻譯，使得分子在表 達該分子的細胞中的可測量水平比它們在不表達該分子的細胞中的更高。測量分子表達的 方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，且包括但不限于，RNA印跡、RT-PCR、原位雜交、蛋白 質(zhì)印跡和免疫染色。
[0048] 當述及細胞、細胞系、細胞培養(yǎng)物或細胞群時，本文使用的術(shù)語"分離的"是指基 本上與該細胞的天然來源分開的，從而該細胞、細胞系、細胞培養(yǎng)物或細胞群能夠在體外培 養(yǎng)。此外，術(shù)語"分離"用于指從兩種或更多種細胞的組中物理選擇一種或多種細胞，其中 基于細胞形態(tài)和/或各種標志物的表達選擇細胞。
[0049] 本文使用的術(shù)語"保存細胞"表示在移植前以可存活的狀態(tài)維持細胞一段時間。 該時間段可以是1小時、2小時、5小時、10小時、15小時、20小時、24小時、2天、4天、5天、 1周、2周、4周、1個月、2個月、4個月、6個月、8個月、10個月、1年、2年、4年、6年、8年、10 年、12年、14年、16年、18年、20年、22年、24年、30年、35年、40年、45年或100年或在該范 圍內(nèi)提供的任意時間之間的任何時間段。
[0050] 本文使用的可分化細胞可以是多能的（pluripotent)、多能的（multipotent)、寡 能的（oligopotent)或甚至單能的。在某些實施方案中，可分化細胞是多能的可分化細胞。 在更具體的實施方案中，該多能的可分化細胞選自胚胎干細胞、ICM/上胚層細胞、原初外胚 層細胞、原始生殖細胞和畸胎癌細胞。在一些實施方案中，可分化細胞源于植入前胚胎。在 一個具體實施方案中，可分化細胞是哺乳動物胚胎干細胞。在一個更具體的實施方案中，可 分化細胞是人胚胎干細胞。
[0051] 從可分化細胞分化的細胞類型在多個研究和開發(fā)領(lǐng)域具有幾種用途，所述領(lǐng)域包 括但不限于藥物發(fā)現(xiàn)、藥物開發(fā)和試驗、毒理學(xué)、用于治療目的以及基礎(chǔ)科學(xué)研究的細胞制 備。這些細胞類型表達在廣泛研究領(lǐng)域中感興趣的分子。這些包括已知的如標準參考教科 書描述的各種細胞類型的功能所需的分子。這些分子包括但不限于細胞因子、生長因子、細 胞因子受體、胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、分泌的多肽和其它分子以及生長因子受體。
[0052] 本發(fā)明考慮到可分化細胞可以通過與細胞分化環(huán)境接觸而被分化。本文使用的術(shù) 語"細胞分化環(huán)境"是指這樣的細胞培養(yǎng)條件：其中誘導(dǎo)可分化細胞分化，或者誘導(dǎo)可分化 細胞成為富集了分化的細胞的人細胞培養(yǎng)物。優(yōu)選地，通過生長因子誘導(dǎo)的分化的細胞系 在性質(zhì)上將是同質(zhì)的。術(shù)語"同質(zhì)的"是指含有超過約50%、60%、70%、80%、85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%的目的細胞系 的群體。
[0053] 可以利用細胞分化培養(yǎng)基或環(huán)境來部分地、終末地或可逆地分化本文所述的可分 化細胞。根據(jù)本文所述的實施方案，細胞分化環(huán)境的培養(yǎng)基可以含有多種組分，包括例如， K0DMEM培養(yǎng)基（KnockoutDulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基）、DMEM、Ham氏F12培養(yǎng)基、 FBS(胎牛血清）、FGR2 (成纖維細胞生長因子2)、KSR或hLIF(人白血病抑制因子）。細胞 分化環(huán)境還可以含有補充物，例如L-谷氨酰胺、NEAA(非必需氨基酸）、P/S(青霉素/鏈霉 素）、N2、B27和β-巰基乙醇（β-ΜΕ)。本發(fā)明考慮到可以向細胞分化環(huán)境中添加額外的因 子，包括但不限于纖連蛋白、層粘連蛋白、肝素、硫酸肝素、視黃酸、表皮生長因子家族（EGF) 的成員、成纖維細胞生長因子家族（FGF)的成員（包括FGF2、FGF7、FGF8和/或FGF10)、血 小板源性生長因子家族（PDGF)的成員、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF)/骨形成蛋白（BMP)/生長和 分化因子（DGF)家族詰抗劑，包括但不限于頭蛋白（noggin)、卵泡抑素、腱蛋白、gremlin、 cerberus/DAN家族蛋白、ventropin、高劑量活化素和amnionless或其變體或功能片段。 還可以以TGF/BMP/⑶P受體-Fc嵌合體的形式添加TGF/BMP/⑶P拮抗劑?？梢蕴砑拥钠?它因子包括可以激活或抑制通過Notch受體家族傳遞信號的分子，包括但不限于δ-樣和 Jagged家族的蛋白以及Notch加工或切割的抑制劑，或其變體或功能片段。其它生長因子 可以包括胰島素樣生長因子家族（IGF)成員、胰島素、無翅相關(guān)（WNT)因子家族和hedgehog 因子家族或其變體或功能片段?？梢蕴砑悠渌蜃觼泶龠M中內(nèi)胚層干/祖細胞、內(nèi)胚層干 /祖細胞、中胚層干/祖細胞、或定形內(nèi)胚層干/祖細胞增殖和存活以及這些祖細胞衍生物 的存活和分化。
[0054] 可以通過對目的細胞系的標志物基因特征的表達以及可分化細胞類型的標志物 基因特征的表達的缺乏定量，來監(jiān)測可分化細胞向目的細胞系的發(fā)展，或其維持在未分化 狀態(tài)。定量此類標志物基因的基因表達的一種方法是使用定量PCR(Q-PCR)。本領(lǐng)域熟知進 行Q-PCR的方法。本領(lǐng)域已知的其它方法也可用于定量標志物基因表達?？梢酝ㄟ^使用針 對該目標標志物基因的特異性抗體來檢測標志物基因表達。
[0055] 本文所述的實施方案還考慮到來自動物中的任何來源的可分化細胞，條件是該細 胞是本文所限定的可分化的。例如，可以從胚胎或其中的任何初生胚層、從胎盤或絨毛膜 組織、或從例如成人干細胞的更為成熟的組織，包括但不限于脂肪、骨髓、神經(jīng)組織、乳腺組 織、肝組織、胰腺、上皮組織、呼吸組織、性腺組織和肌肉組織收獲可分化細胞。在特定實施 方案中，可分化細胞是胚胎干細胞。在其它特定實施方案中，可分化細胞是成人干細胞。還 在其它特定實施方案中，可分化細胞是源于胎盤或絨毛膜的干細胞。
[0056] 其它實施方案考慮到使用來自能夠產(chǎn)生可分化細胞的任何動物的可分化細胞。從 其收獲可分化細胞的動物可以是脊椎動物或無脊椎動物，哺乳動物或非哺乳動物，人或非 人。動物來源的實例包括但不限于靈長類動物、嚙齒類動物、狗、貓、馬、牛和豬。
[0057] -些實施方案考慮到使用誘導(dǎo)的多能干（iPS)細胞，其為源于非多能細 胞的多能干細胞。參見Zhou等人（2009)，CellStemCell4:381-384 ;Yu等人， (2009)Science324 (5928):729-801,EpubMarch26,2009;Yu等人，（2007)Science 318(5858) :1917-20，EpubNovember20, 2007;Takahashi等人，（2007)Cell，131:861-72; 以及TakahashiK.和YamanakaS. (2006)，Cell126:663-76,這些文獻通過引用以其全文 并入本文。從其收獲非多能細胞的動物可以是脊椎動物或無脊椎動物，哺乳動物或非哺乳 動物，人或非人。動物來源的實例包括但不限于靈長類動物、嚙齒類動物、狗、貓、馬、牛和 豬。
[0058] 可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法生成本文所述的可分化細胞。例如，可 以使用去分化和核轉(zhuǎn)移方法制備人多能細胞。此外，本文使用的人ICM/上胚層細胞或原初 外胚層細胞在體內(nèi)或體外生成。原初外胚層細胞可以在貼壁培養(yǎng)中產(chǎn)生，或作為細胞團塊 在懸浮培養(yǎng)中產(chǎn)生，如在W099/53021所述的。此外，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何 方法傳代人多能細胞，該方法包括人工傳代方法，和批量傳代方法，例如酶促或非酶促的傳 代。
[0059] 在某些實施方案中，當利用ES細胞時，胚胎干細胞具有正常的核型，而在其它實 施方案中，胚胎干細胞具有異常的核型。在一個實施方案中，胚胎干細胞中的多數(shù)具有正常 的核型。本發(fā)明考慮超過50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或超過95% 的被考察的中期細胞表現(xiàn)出正常的核型。
[0060] 儲存用于包封和務(wù)棺的細朐
[0061] -些實施方案涉及用于冷凍保存已經(jīng)體外培養(yǎng)和/或分化的細胞的方法。該儲 存將實現(xiàn)保存、質(zhì)量控制和其它期望的操作和管理，或與體外分析有關(guān)，或與體內(nèi)植入有 關(guān)。用于移植前細胞儲存的方法包括通過冷凍細胞（冷凍保存）；或者通過在高于冷凍溫 度時冷藏細胞（冬眠）保存組織。參見Chanaud等人，1987NeurosciLett82:127-133; Collier等人，（1987)436:363-366;以及Sauer等人，1991NeurologyandNeuroscience 2:123-135 ;Gage等人，1985NeurosciLett60:133-137,這些文獻的公開內(nèi)容通過引用以 其全文并入本文。盡管已報道冬眠相比冷凍保存的組織提高移植物存活率和功能，但是在 冬眠期間，細胞可能在這樣的條件下無法長期維持而不損害細胞活力。
[0062] 本文使用的"細胞懸液"或其等同物是指與培養(yǎng)基接觸的細胞團塊和/或簇和/或 球。這樣的細胞懸液詳細描述于2008年11月8日提交的題為"干細胞團塊懸液組合物及 其分化方法"的美國申請12/264, 760中，其公開內(nèi)容通過引用以其全文并入本文。
[0063] 本文使用的"適合的細胞懸液"或細胞懸液培養(yǎng)物或其等同物包括已在冷凍以上， 優(yōu)選在4°C下在冬眠培養(yǎng)基中儲存約1小時和長達約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 或長達 30 天的細胞懸液。
[0064] 本文使用的適于移植的細胞是指對于體內(nèi)治療代謝障礙來說活力和/或功能充 足的細胞或細胞群。例如，在將適于移植的細胞植入到患有糖尿病的受試者中之后的一段 時間，糖尿病或其一種或多種癥狀可以得到改善或減輕。在一個優(yōu)選實施方案中，適于移 植的細胞或細胞群為胰腺祖細胞或群，或roxi陽性的胰腺祖細胞或群，或內(nèi)分泌前體細 胞或群，或多激素或單激素內(nèi)分泌細胞和/或細胞或細胞群的任意組合，或甚至是其純化 的或富集的細胞或細胞群。適于本文所述的實施方案的細胞進一步詳細描述于美國專利 7, 534, 608,其公開內(nèi)容通過引用以其全文并入本文。
[0065] 本文使用的術(shù)語"儲存"或其等同方式是指在冷凍以上或以下保持或維持細胞。該 術(shù)語還表示包括在用于受試者移植之前維持細胞。
[0066] 本文使用的術(shù)語"冷凍保存"或其等同方式是指在冷凍以下的溫度保存細胞。
[0067] 本文使用的術(shù)語"冬眠"或其等同方式是指在冷凍以上和相比正常生理溫度足夠 低的溫度下保存細胞，使得一種或多種正常細胞生理過程減少或停止。在一個實施方案中， 優(yōu)選的冬眠溫度范圍為〇至4°C，優(yōu)選約4°C。本文使用的冬眠培養(yǎng)基包括缺少冷凍保存劑 且對于在冷凍溫度以上，優(yōu)選約4°C下儲存細胞是生理上相容的任何培養(yǎng)基。
[0068] 冬眠條件
[0069] 冬眠溫度范圍通常為0至5°C，優(yōu)選約4°C。不同類型的培養(yǎng)基可以用作冬眠培養(yǎng) 基與現(xiàn)有方法相結(jié)合。用于冷凍和冬眠細胞的現(xiàn)有技術(shù)方法利用包含緩沖劑和添加的蛋白 質(zhì)的復(fù)合培養(yǎng)基，有時候包括完全不限定的組分，例如血清。然而，為了使毒性和免疫原性 最小化，這樣的添加物對于移植到人體中是不期望的。在優(yōu)選實施方案中，冬眠培養(yǎng)基不含 添加的Ca++。在某些實施方案中，用于冬眠細胞的培養(yǎng)基不含添加的蛋白質(zhì)和/或不含緩 沖劑。優(yōu)選的冬眠培養(yǎng)基包括最小量的葡萄糖或適量的葡萄糖的鹽水溶液，例如在鹽水中 沒有額外的葡萄糖或約〇. 1% -0.9%葡萄糖，或者由其組成。在優(yōu)選實施方案中，冬眠培 養(yǎng)基包括約〇. 1-0. 5%葡萄糖，或者由其組成。在更優(yōu)選的實施方案中，冬眠培養(yǎng)基包括約 0.2%葡萄糖，或者由其組成。在優(yōu)選實施方案中，冬眠培養(yǎng)基包括非常小百分比（體積/ 體積）的NaCl，例如約0. 1-1%NaCl，優(yōu)選約0. 5-0. 9%NaCl，或者由其組成。在某些實施 方案中，可以使用更復(fù)雜的培養(yǎng)基，例如Hank氏平衡鹽溶液、Dulbecco氏最低必需培養(yǎng)基 或Eagle氏改良的最低必需培養(yǎng)基。在某些實施方案中，用添加物補充所選擇的冬眠培養(yǎng) 基是需要的，該添加物例如添加的蛋白質(zhì)（例如，哺乳動物血清蛋白或全血清（優(yōu)選熱滅活 的））、緩沖劑（例如，磷酸鹽緩沖劑，HEPES等）、抗氧化劑、生長因子、KC1 (例如約30mM)、 乳酸鹽（例如約20mM)、丙酮酸鹽、MgCl2 (例如約2-3mM)、山梨醇（例如約300mM)或本領(lǐng)域 熟知的其它添加物。
[0070] 在某些實施方案中，在約0_5°C、優(yōu)選約4°C下冬眠細胞。在某些實施方案中，在冷 凍或使用之前，在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C下維持細胞。在其它實施方案中，在冷凍之后在冬 眠培養(yǎng)基中在約4°C下維持細胞。還在其它實施方案中，不經(jīng)冷凍在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C 下維持細胞。在某些實施方案中，在冷凍之前、冷凍之后或在用于移植之前，在約4°C下在冬 眠培養(yǎng)基中維持細胞至少約1小時和長達約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25或長達30天。在其它實施方案中，在冷凍之前、冷凍之后或 在用于移植之前，在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C下維持細胞至少約12-72小時。在某些實施方案 中，在冷凍之前、冷凍之后或在用于移植之前，在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C下維持細胞至少約 24小時。在更優(yōu)選的實施方案中，在冷凍之前、冷凍之后或在使用之前，在冬眠培養(yǎng)基中在 約4°C下維持細胞至少約36-48小時。
[0071] 冷凍保存條件
[0072] 在一些實施方案中，使用冷凍保存溶液冷凍保存細胞。冷凍保存溶液或培養(yǎng)基包 括含有冷凍保存劑的溶液，該冷凍保存劑即隨著細胞冷凍或解凍保護細胞免受胞內(nèi)和/或 細胞膜傷害的化合物。通過下述方法鑒別冷凍保存劑：當和在無冷凍保存劑存在時進行類 似地冷凍或解凍的細胞相比時，與冷凍保存劑接觸的細胞的存活和/或功能性提高。任何 冷凍保存劑可以和現(xiàn)有方法一起使用，該術(shù)語意味著包括胞內(nèi)和胞外的冷凍保存劑。
[0073] 本領(lǐng)域已知的任何冷凍保存劑可以用于冷凍保存溶液中。在某些實施方案中，冷 凍保存溶液包括胞內(nèi)冷凍保存劑，包括但不限于二甲基亞砜（DMS0)、各種二醇和三醇（例 如乙二醇、丙二醇、丁二醇和三醇以及甘油）以及各種酰胺（例如甲酰胺和乙酰胺）；并 且，也可以單獨使用或者與任何胞內(nèi)冷凍保存劑組合使用的胞外冷凍保存劑，包括但不限 于磷酸甘油酯的磷酸單酯和磷酸二酯代謝物、聚乙烯吡咯烷酮或甲基纖維素（例如至少 0. 1% ) 〇
[0074] 在優(yōu)選實施方案中，DMS0用作冷凍保存劑?？梢砸源蠓秶臐舛仁褂肈MS0,例如 約 1%、2%、約 3%、約 4%、約 5%、約 6%、約 7%、約 8%、約 9%、約 10%、約 11%、約 12%、 約13%、約14%、約15%或更大。在更優(yōu)選實施方案中，DMS0的濃度范圍為約6%至約 12%。在特別優(yōu)選的實施方案中，DMS0的濃度為約10%。
[0075] 在某些實施方案中，冷凍保存劑以逐步方式添加到細胞中，從而梯度提高該冷凍 保存劑的濃度直到達到冷凍保存劑的期望終濃度。在某些實施方案中，使細胞與冷凍保存 溶液接觸，該冷凍保存溶液含有期望終濃度的冷凍保存劑，或者直接將冷凍保存劑添加到 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中而無需濃度梯度上升。
[0076] 冷凍保存溶液包括在適合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的冷凍保存劑。任何類型的培養(yǎng)基都可 以用于此目的。在優(yōu)選實施方案中，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基不含有添加的Ca++。在某 些實施方案中，添加冷凍保存劑的培養(yǎng)基不含有添加的蛋白質(zhì)和/或不含有緩沖劑。在其 它實施方案中，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（例如DMEM或DMEM/F12)包括約0. 1-0. 5% 葡萄糖或者由其組成，或不包括葡萄糖或包括少量葡萄糖。在該實施方案的一些方面，添加 冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（例如DMEM或DMEM/F12)包括約0. 5-0. 9%NaCl，或者由其組 成。在優(yōu)選實施方案中，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括非常少的葡萄糖，甚至至沒有以 及約0. 5-0. 9 %NaCl，或者由其組成。在另一個優(yōu)選實施方案中，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培 養(yǎng)基包括約0. 1-0. 2 %葡萄糖，或者由其組成。在該實施方案的一些方面中，添加冷凍保存 劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括約0. 5-0. 9 %NaCl，或者由其組成。
[0077] 在某些實施方案中，冷凍保存溶液還可以含有添加的蛋白質(zhì)，例如血清（例如胎 牛血清或人血清），或者血清蛋白（例如白蛋白或敲除的血清替代物）。在其它實施方案中， 冷凍保存劑還可以含有其它添加物，例如上述用于包含在冬眠培養(yǎng)基中的，例如抗氧化劑、 生長因子、KC1 (例如約30mM)、乳酸鹽（例如約20mM)、丙酮酸鹽、MgCl2 (例如約2-3mM)、山 梨醇（例如至約300mM的摩爾滲透壓濃度）或本領(lǐng)域熟知的其它添加物。
[0078] -旦細胞懸浮在冷凍保存溶液中時，以受控方式降低細胞的溫度。在冷卻細胞到 低于冷凍溫度時，優(yōu)選緩慢進行溫度的降低，使得細胞在冷凍保存劑的胞內(nèi)和胞外濃度之 間建立平衡，從而抑制胞內(nèi)冰晶形成。在一些實施方案中，優(yōu)選冷凍速度足夠快，從而保護 細胞免于過多損失水分和冷凍保存劑的毒性作用。然后可以在-20°C至約-250°C的溫度下 冷凍保存細胞。優(yōu)選地，在低于_90°C下儲存細胞，從而將冰再結(jié)晶的風(fēng)險最小化。在特別 優(yōu)選的實施方案中，在約-196 °C的液氮中冷凍保存細胞。或者，可以在商業(yè)可得的電子控制 冷凍設(shè)備的幫助下實現(xiàn)受控冷凍。
[0079] 解凍條件
[0080] 冷凍保存后，可通過任何可用的方法解凍細胞。在優(yōu)選實施方案中，迅速解凍細 胞，例如通過快速浸沒在37°C的液體中。一旦細胞解凍，通過添加稀釋培養(yǎng)基實現(xiàn)冷凍保存 劑的稀釋。
[0081] 任何培養(yǎng)基都可以用于稀釋與解凍的細胞接觸的冷凍保存溶液。例如，用于冬眠 細胞的或者用于細胞生長和分化的上文列出的任何培養(yǎng)基，都可以用于稀釋冷凍保存溶 液。其它培養(yǎng)基也是合適的，例如Hank氏平衡鹽溶液（優(yōu)選不含Ca++)、含DMEM且不含葡 萄糖或含最少量至少量葡萄糖的培養(yǎng)基。例如上文列出的用于包含于冬眠或冷凍培養(yǎng)基 中的添加物也可以用于稀釋培養(yǎng)基中。示例性的添加物包括，例如，緩沖劑（例如磷酸鹽 緩沖劑、HEPES等）、抗氧化劑、生長因子、KC1 (例如約30mM)、乳酸鹽（例如約20mM)、丙酮 酸鹽、MgCl2(例如約2-3mM)、山梨醇（例如至約300mM的摩爾滲透壓濃度）或本領(lǐng)域熟知 的其它添加物。其它適合的添加物包括DNA酶（例如可從Genentech,Incorporated以 PULM0ZYME0R商購的）。用于稀釋冷凍保存溶液的培養(yǎng)基可以任選地含有添加的蛋白質(zhì)，例 如添加的蛋白質(zhì)（例如哺乳動物血清（優(yōu)選熱滅活的））或血清蛋白，例如白蛋白。在其它 實施方案中，培養(yǎng)基不含添加的蛋白質(zhì)和/或添加的緩沖劑。
[0082] 稀釋冷凍保存劑后，然后可以使細胞沉降，或者可以在離心力下形成細胞團，以盡 可能多地從細胞中去除冷凍保存溶液。然后在不含有冷凍