懸浮于或浸于或孵育于乳液/基質(zhì)中以形成涂層。已 知還有某些具有更高的重量/體積濃度的PFV乳液具有改善的氧遞送和保留特性。并且， 由于由PFC的02攜帶能力產(chǎn)生更高氧分壓，產(chǎn)生02壓力梯度，其推動(dòng)溶解的氧擴(kuò)散到組織 中，從而增強(qiáng)向細(xì)胞的〇 2遞送。
[0126]PFC物質(zhì)包括但不限于全氟三丁基胺（FC-43)、全氟萘烷、全氟溴辛烷、二-全 氟丁基乙烯或其它適合的PFC。優(yōu)選的PFC通常含有約60至約76重量百分比的碳 鍵合的氟。該全氟流體可以是單一化合物，但通常是此類(lèi)化合物的混合物。美國(guó)專(zhuān)利 No. 2, 500, 388 (Simons) ;2, 519, 983 (Simons) ;2, 594, 272(Kauck等人）；2, 616, 927(Kauck 等人）；和4,788,339(M〇〇re等人），其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。用于本文所述 的實(shí)施方案的PFC還包括描述于EncyclopediaofChemicalTechnology,Kirk-Othmer, 第三版，第10卷，第874-81頁(yè)，JohnWiley&Sons(1980)的那些。例如，有用的PFC包 括全氟-4-甲基嗎啉、全氟三乙基胺、全氟-2-乙基四氫呋喃、全氟-2-丁基四氫呋喃、 全氟戊烷、全氟-2-甲基戊烷、全氟己烷、全氟-4-異丙基嗎啉、全氟二丁基醚、全氟庚 烷、全氟辛烷、及其混合物。優(yōu)選的惰性液體氟化物包括全氟己烷、全氟-2-丁基四氫呋 喃、全氟庚烷、全氟辛烷、及其混合物。用于本文所述的實(shí)施方案的可商購(gòu)的PFC包括 FLU0RINERT.TM.流體，例如FC-72、FC-75、FC-77和FC-84(描述于1990年產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) #98-0211-5347-7(101.5)NPI)、FLU0RINERT.TM.流體（可得自MinnesotaMiningand ManufacturingCompany,St.Paul,Minn)、及其混合物。
[0127] 體內(nèi)成像能力
[0128] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于在包封裝置中體內(nèi)成像或檢測(cè)細(xì)胞的手段。成像 在干細(xì)胞療法中起到重要作用。例如，無(wú)創(chuàng)的成像形式可以用于：（1)確定細(xì)胞和/或要 治療的疾病的存在、嚴(yán)重性或表型；（2)監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞療法中有害或非靶向細(xì)胞類(lèi)型和結(jié) 構(gòu)的出現(xiàn)，例如囊腫或小囊腫；（3)引導(dǎo)療法的遞送；(4)跟蹤疾病的時(shí)間進(jìn)程和評(píng)估效果 或療效；（5)提供標(biāo)簽和限定療法的機(jī)制；(6)分析和評(píng)估移植的細(xì)胞的存活和功能；以及 (7)通常促進(jìn)任何細(xì)胞療法的過(guò)程，例如通過(guò)確定細(xì)胞療法的移植、存活和局部功能，包括 本文所述的通過(guò)替代和/或植入胰腺祖細(xì)胞用于治療糖尿病的細(xì)胞療法。此外，盡管細(xì)胞 療法致力于降低致病率/死亡率，此處和下文更詳細(xì)描述的無(wú)創(chuàng)成像技術(shù)可以作為有用的 替代性終點(diǎn)，例如在初步試驗(yàn)或初步研究中。
[0129] 任何理想的體內(nèi)成像技術(shù)為：i)無(wú)創(chuàng)的；ii)可靠地重復(fù)的；iii)能夠進(jìn)入組織 直到至少3mm的深度；iv)分辨能力不大于100μm，并且理想地不大于50μm;v)成像不被 裝置材料削弱，例如可以透過(guò)PTFE成像；vi)臨床上相容的，且不是技術(shù)上難處理的或復(fù)雜 的；vii)可商購(gòu)的；viii)FDA批準(zhǔn)用于人類(lèi)使用；ix)合理的成本效益；以及X)可以在合理 的時(shí)間段（例如數(shù)秒或數(shù)分鐘）內(nèi)對(duì)細(xì)胞成像，或者上述的任意組合。
[0130] 到目前為止，當(dāng)前的方法包括但不限于共聚焦顯微技術(shù)、2-光子顯微技術(shù)、高頻超 聲、光學(xué)相干斷層成像術(shù)（OCT)、光聲成像技術(shù)（photoacoustictomography，PAT)、計(jì)算機(jī) 斷層掃描技術(shù)（CT)、磁共振成像（MRI)、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)（SPECT)和正電子發(fā) 射斷層成像術(shù)（PET)。這些技術(shù)單獨(dú)或組合可以提供監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞的有用手段。此外，期 望此類(lèi)技術(shù)將隨著時(shí)間而改進(jìn)，并且每項(xiàng)技術(shù)發(fā)揮功能或其利用的基本原理基本上是類(lèi)似 的。這就是說(shuō)，本文所述的體內(nèi)成像不意在局限于下文描述的技術(shù)，還涉及將起到和本文所 述的相同效用的今后開(kāi)發(fā)的和描述的技術(shù)。
[0131 ] 在一個(gè)實(shí)施方案中，采用的成像技術(shù)為無(wú)創(chuàng)的，且提供3維斷層掃面數(shù)據(jù)，具有高 的時(shí)間和空間分辨率，能夠分子成像，并且是低廉和便于攜帶的。盡管現(xiàn)在沒(méi)有單獨(dú)的模式 是理想的（下文更為詳細(xì)地描述），每一個(gè)具有不同的特性，并且這些模式可以共同提供值 得稱(chēng)贊的信息。
[0132] 共聚焦顯微技術(shù)為提高顯微相差的光學(xué)成像技術(shù)，其能夠通過(guò)使用光學(xué)針孔來(lái)消 除比聚焦平面更厚的樣本中的焦點(diǎn)外光線(xiàn)，從而重建三維圖像。由于在樣品中一次只有一 個(gè)點(diǎn)被照射，2D或3D成像需要掃描樣本中的規(guī)則的光柵（即矩形的平行掃描線(xiàn)條式樣）。 通常采取三個(gè)主要掃描變量來(lái)產(chǎn)生共聚焦顯微掃描圖像。可以通過(guò)下述方式來(lái)實(shí)現(xiàn)基本等 同的共聚焦操作：采用偶聯(lián)于穩(wěn)定照射光束的側(cè)向移動(dòng)的樣本鏡臺(tái)（鏡臺(tái)掃描）、具有穩(wěn)態(tài) 的掃描光束（光束掃描）、或通過(guò)在用通過(guò)旋轉(zhuǎn)的Nipkow或Nipnov盤(pán)的孔投射的光點(diǎn)陣列 掃描樣本的同時(shí)，保持鏡臺(tái)和光源穩(wěn)定。每項(xiàng)技術(shù)具有使得其有利于特定共聚焦應(yīng)用的性 能特性，但是限制了其他應(yīng)用的特性的使用。
[0133] 所有的共聚焦顯微鏡都依賴(lài)于該技術(shù)順序通過(guò)相對(duì)厚的切面或全部封固的樣本 而產(chǎn)生高分辨率圖像的能力，該高分辨率圖像稱(chēng)為光切面?；谧鳛榛A(chǔ)圖像單元的光切 面，可以以單、雙、三或多波長(zhǎng)照射模式從固定的和染色的樣本收集數(shù)據(jù)，并且用不同照射 和標(biāo)記策略收集的圖像將互相對(duì)準(zhǔn)。活細(xì)胞成像和延時(shí)順序是可行的，并且應(yīng)用于圖像順 序的數(shù)字圖像處理方法能獲得樣本的z-系列和三維表現(xiàn)，以及作為四維成像的3D數(shù)據(jù)的 時(shí)間順序表現(xiàn)。并不限制上述共聚焦顯微鏡的使用，因?yàn)楝F(xiàn)在或以后開(kāi)發(fā)的其它共聚焦顯 微鏡也包括于本文所述的實(shí)施方案中。
[0134] 可使用大量的熒光探針，當(dāng)引入到相對(duì)簡(jiǎn)單的操作中時(shí)，其可以給某些細(xì)胞表面 標(biāo)志物和/或蛋白和胞內(nèi)細(xì)胞器和結(jié)構(gòu)染色，例如Celltracker、DiI、核活體染料等等。特 異地直接或間接結(jié)合某些細(xì)胞表面標(biāo)志物的熒光標(biāo)志物可以特別用于鑒別例如不想要的 細(xì)胞類(lèi)型。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)體內(nèi)存在的包封的多能細(xì)胞實(shí)時(shí)成像提供了檢測(cè)手 段，并因此提供了預(yù)防由多能干細(xì)胞導(dǎo)致的畸胎瘤形成的可能性，該多能干細(xì)胞例如hES 或人胚胎生殖細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干（IPS)細(xì)胞或無(wú)精生殖（parthenote)細(xì)胞等。同一檢 測(cè)手段還可以鑒別從裝置逸出或泄漏的（或變得不被包封的）多能干細(xì)胞。還可以使用在 多能干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的熒光標(biāo)記的啟動(dòng)子基因0CT4和NAN0G進(jìn)行此類(lèi)細(xì)胞的鑒別。類(lèi) 似地，某些標(biāo)記核、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體的胞內(nèi)熒光標(biāo)志物以及甚至例如以細(xì)胞內(nèi)聚 合肌動(dòng)蛋白為靶點(diǎn)的熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽的染料都是可商購(gòu)的，且可以提供有關(guān)細(xì)胞命運(yùn) 的重要信息。
[0135] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，二光子發(fā)射熒光（TPEF)顯微術(shù)是監(jiān)測(cè)分化或反過(guò)來(lái)說(shuō)是 鑒別多能干細(xì)胞的無(wú)創(chuàng)手段，該多能干細(xì)胞（例如hESC或IPS細(xì)胞或無(wú)精生殖細(xì)胞）不 分化，且作為包封于本文所述裝置的非常小百分比的產(chǎn)物細(xì)胞而無(wú)意中植入。二光子發(fā)射 熒光顯微術(shù)基本上依賴(lài)于內(nèi)部來(lái)源的相差，但還可以通過(guò)二次諧波發(fā)生檢測(cè)例如原纖維基 質(zhì)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，二光子顯微術(shù)所依賴(lài)的熒光發(fā)射類(lèi)似于共聚焦顯微術(shù)采用的熒光發(fā)射。Rice 等人（2007年）描述了TPEF可用于揭示生物化學(xué)狀態(tài)中的量差和分化和未分化干細(xì)胞的 二維（2-D)形狀。參見(jiàn)Rice等人（2007 年）JBiomedOpt. 2007 年 11 月-12 月；12 (6)， 其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用明確并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以基因修飾多能干細(xì)胞以表達(dá) 熒光蛋白，例如增強(qiáng)的綠色熒光蛋白，并被多能干細(xì)胞啟動(dòng)子（例如0CT4或NAN0G或以后 鑒別的任何其它多能干細(xì)胞啟動(dòng)子）驅(qū)動(dòng)。對(duì)于比皮下移植更深，即深度低于皮膚表面的 那些可植入裝置，二光子提供比共聚焦顯微術(shù)更深的無(wú)創(chuàng)成像。此外，使用的紅外線(xiàn)對(duì)活細(xì) 胞的傷害比暴露于可見(jiàn)光或紫外線(xiàn)的小，這是因?yàn)闊晒獍l(fā)射所需的光子能量?jī)H在焦點(diǎn)平面 處，并且不被焦點(diǎn)外平面中的細(xì)胞或組織感受到。
[0136] 還在一個(gè)實(shí)施方案中，超聲是便于攜帶的、基本上無(wú)害的、多功能的，且可在 包封的細(xì)胞產(chǎn)物和/或包封的生物活性劑植入時(shí)實(shí)時(shí)進(jìn)行。特別地，高頻超聲例如 VisualSonics所描述的。高分辨率成像使得可以體內(nèi)評(píng)估哺乳動(dòng)物縱向研究中的解剖結(jié)構(gòu) 和血液動(dòng)力學(xué)功能。例如VisualSonics的Vevo提供：（1)進(jìn)行個(gè)體受試者的疾病發(fā)展和退 行的縱向研究的能力；（2)低至30微米的解剖和生理結(jié)構(gòu)的成像分辨率；（3)使圖像引導(dǎo) 的針注射和抽取可視化的能力；(4)微循環(huán)和心血管血流評(píng)估；(5)經(jīng)用戶(hù)友好的設(shè)備和研 究推動(dòng)的界面的高通量；和（6)獲得全面測(cè)量和注釋以及離線(xiàn)數(shù)據(jù)分析的開(kāi)放性結(jié)構(gòu)。評(píng) 估微循環(huán)和心血管血流的能力將有助于確定細(xì)胞的活力，例如〇 2流動(dòng)和遞送。
[0137] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，磁共振成像（MRI)可以用于使用相差試劑區(qū)分健康的和患 病的組織。此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（CT)或CT掃描可以用于產(chǎn)生 體組織和結(jié)構(gòu)的詳細(xì)圖片。并且，此處使用相差試劑，并使其易于由于特定吸附速率使正常 組織可視化。相差試劑例如8-羥基喹啉銦-111 (Ι-m)的一個(gè)用途是用于追蹤干細(xì)胞，盡 管其半衰期確實(shí)短。此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，正電子發(fā)射斷層掃描技術(shù)（PET)掃描可以 用于測(cè)量來(lái)自正電子發(fā)射分子，例如碳、氮和氧等的發(fā)射，并且提供有價(jià)值的功能信息。在 又一個(gè)實(shí)施方案中，光子共聚焦斷層掃描技術(shù)（0CT)或光聲斷層掃描技術(shù)（PAT)也可用于 考察裝置內(nèi)外的細(xì)胞和組織。0CT檢測(cè)不同組織的反射率差異，而PAT檢測(cè)組織暴露于低能 量激光而被加熱時(shí)產(chǎn)生的超聲波。
[0138] 不同方法和技術(shù)或工具可以單獨(dú)或組合用于可視化、分析和評(píng)估體內(nèi)裝置內(nèi)的植 入的細(xì)胞。這些和現(xiàn)在已知或今后開(kāi)發(fā)的其它技術(shù)可以利用到這樣的程度，即它們能夠用 于體內(nèi)成像和監(jiān)測(cè)本文所述的細(xì)胞和/或試劑。
[0139] 在整個(gè)申請(qǐng)中，引用了不同出版物。所有這些出版物和這些出版物中引用的那些 參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容都通過(guò)引用一起全文加入到本申請(qǐng)中，從而更為全面的描述該專(zhuān)利所 屬領(lǐng)域的狀態(tài)。
[0140] 實(shí)施例1
[0141] 包封的腠腺祖細(xì)朐的體內(nèi)功能
[0142] 進(jìn)行了下述實(shí)施例，至少部分地首先確定了包封胰腺祖細(xì)胞的方法的完整性，其 包括生物相容性裝置和醫(yī)學(xué)/機(jī)械裝置；第二，確定與未包封的胰腺祖細(xì)胞（對(duì)照）相比， 完全包封的胰腺祖細(xì)胞是否體內(nèi)存活并成熟為有功能的激素分泌細(xì)胞。
[0143] 用于制備來(lái)自人胚胎干（hES)細(xì)胞的胰腺細(xì)胞系的方法基本上描述于下述專(zhuān)利 和專(zhuān)利申請(qǐng)中：題為"生產(chǎn)胰腺激素的方法"的美國(guó)專(zhuān)利No. 7, 534, 608、2008年10月4日提 交的題為"干細(xì)胞團(tuán)塊懸浮組合物及其分化方法"的美國(guó)申請(qǐng)No. 12/264, 760 ;2007年7月 5日提交的題為"生產(chǎn)胰腺激素的方法"美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 11/773, 944 ;2008年6月3日提 交的題為"用于生產(chǎn)定形內(nèi)胚層的生長(zhǎng)因子"的美國(guó)申請(qǐng)No. 12/132, 437 ;2008年4月8日 提交的題為"用于純化源于人胚胎干細(xì)胞的內(nèi)胚層和胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的方法"的美國(guó)申請(qǐng) No. 12/107, 020 ;2007年10月19日提交的題為"用于含人血清的無(wú)飼養(yǎng)層的多能干細(xì)胞培 養(yǎng)基的方法和組合物"的美國(guó)申請(qǐng)No. 11/875, 057 ;2007年2月23日提交的題為"用于培 養(yǎng)分化的細(xì)胞的組合物和方法"的美國(guó)申請(qǐng)No. 11/678, 487 ;題為"用于干細(xì)胞培養(yǎng)的可選 的組合物和方法"的美國(guó)專(zhuān)利No. 7,432, 104 ;Kroon等人，（2008年）NatureBiotechnology 26(4) :443-452 ;d'Amour等人，2005 年，NatBiotechnol. 23:1534-41 ;D'Amour等人，2006 年，NatBiotechnol.24(ll):1392-401;McLean等人，2007 年，StemCells25:29-38,其公 開(kāi)內(nèi)容都通過(guò)引用以其全文并入本文。
[0144] 簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，未分化的人胚胎干（hES)細(xì)胞在DMEM/F12(Mediatech)中維持在小鼠 胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層（特殊培養(yǎng)基）上，該DMEM/F12補(bǔ)充了 20%KnockOut血清替代物 (K0SR，GIBC0BRL)、lmM非必需氨基酸（GIBC0BRL)、Glutamax(GIBC0BRL)、青霉素 / 鏈霉素 (GIBC0BRL)、0. 55mM的 2-巰基乙醇（GIBC0BRL)和 4ng/mL重組人FGF2(R&DSystems)以 及可選擇地補(bǔ)充了 10_20ng/mL的活化蛋白A(R&DSystems)。每5至7天以約1:4至1:8、 1:9或1:10的分流比人工傳代人ES細(xì)胞培養(yǎng)物。在作為貼壁培養(yǎng)物或在細(xì)胞團(tuán)塊懸液中 分化之前，在PBS+/+(含有Mg++和Ca++，Invitr〇gen)中簡(jiǎn)單洗滌細(xì)胞。人ES細(xì)胞系可以包 括但不限于CyT49、CyT203、Cyt25、BG01 和BG02。
[0145] 用于培養(yǎng)和分化懸液中的細(xì)胞或細(xì)胞群的方法詳細(xì)描述于2007年2月23日提交 的"用于培養(yǎng)分化的細(xì)胞的組合物和方法"的國(guó)際申請(qǐng)PCT/US2007/062755和2008年11月 4日提交的"干細(xì)胞團(tuán)塊懸浮組合物及其分化方法"的美國(guó)申請(qǐng)No. 12/264,760中，這些申 請(qǐng)通過(guò)引用以其全文并入到本文。
[0146] 分化培養(yǎng)條件基本上類(lèi)似于上文的D'Amour等人2006年所描述的條件和下面的 實(shí)施例4,二者都描述了 5步分化操作：階段1 (定形內(nèi)胚層；第1天-第4天）、階段2 (原 初腸管或前腸內(nèi)胚層；第5天-第8天）、階段3 (較晚的前腸或Pdxl陽(yáng)性的內(nèi)胚層；第9 天-第12天）、階段4(胰腺祖細(xì)胞、胰腺上皮和/或內(nèi)分泌前體；第13天-第15天）和 階段5 (激素表達(dá)內(nèi)分泌細(xì)胞；第16天或更長(zhǎng)）。
[0147] 在階段4,從階段3培養(yǎng)物中去除視黃酸（RA)，用DMEM+B27 (1:100Gibco)洗滌培 養(yǎng)物一次，然后將洗液替換為單獨(dú)的DMEM+1XB27補(bǔ)充物，或替換為DMEM+1XB27補(bǔ)充物 和下述因子的任意組合或任何一種或全部達(dá)4-8天：頭蛋白（50ng/ml)、FGF10 (50ng/ml)、 KGF(25-50ng/ml)、EGF(25-50ng/ml)、1-5%FBS。在沒(méi)有添加RA的情況下，將 30-100ng/ ml(R&D systems)的頭蛋白加入到培養(yǎng)基中1-9天?？蛇x擇地，在階段4不添加額外的生長(zhǎng) 因子。并且，可以向培養(yǎng)物中添加細(xì)胞存活試劑，例如Y-27632、法舒地爾、H-1152P以及含 有胰島素/轉(zhuǎn)鐵蛋白/硒（ITS)的混合物。
[0148] 無(wú)論是否從貼壁培養(yǎng)物或在細(xì)胞團(tuán)塊懸液中生產(chǎn)胰腺祖細(xì)胞，所有的胰腺祖細(xì)胞 群在移植于哺乳動(dòng)物中時(shí)都體內(nèi)發(fā)育和成熟為功能性?xún)?nèi)分泌組織。由源于hES的移植細(xì)胞 體內(nèi)生成胰島素描述于上文的美國(guó)申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)中，例如題為"生產(chǎn)胰島激素的方法"的 美國(guó)申請(qǐng)No. 11/773, 944和上文的Kroon等人2008年。
[0149] 不同于美國(guó)申請(qǐng)No. 11/773, 944和上文的Kroon等人2008年所描述的細(xì)胞組合 物，本研究中的胰腺祖細(xì)胞為體內(nèi)完全分離的或包封的。使用生物相容性聚乙二醇（PEG) 包封胰腺祖細(xì)胞，其更為詳細(xì)地描述于題為"用于治療疾病的包封的生物材料的植入"的 美國(guó)專(zhuān)利No. 7, 427, 415,其通過(guò)引用并入本文。PEG包封的胰腺祖細(xì)胞移植在附睪脂肪墊 (EFP)下；測(cè)定了葡萄糖刺激后不同時(shí)間點(diǎn)的血清C肽水平；并且在PEG包封的外植體上進(jìn) 行了免疫組化分析。此外，這些方法之前已描述于題為"生產(chǎn)胰島激素的方法"的美國(guó)申請(qǐng) No. 11/773, 944和上文的Kroon等人2008年（數(shù)據(jù)未示出）。免疫組化分析顯示胰島祖細(xì) 胞能夠體內(nèi)成熟并含有激素表達(dá)細(xì)胞，例如胰島素、胰高血糖素和生長(zhǎng)激素抑制素。
[0150] 還可以使用醫(yī)學(xué)或機(jī)械裝置進(jìn)行該胰腺祖細(xì)胞的包封，該裝置例如TheraCyte細(xì) 胞包封裝置。所有述及的TheraCyte細(xì)胞包封裝置的參考文獻(xiàn)都指的是直接從廠商（The raCyte,Inc.，Irvine,California)購(gòu)買(mǎi)的裝置，并進(jìn)一步描述于美國(guó)專(zhuān)利No. 6, 773, 458 ; 6, 156, 305 ；6, 060, 640 ；5, 964, 804 ；5, 964, 261 ；5, 882, 354 ；5, 807, 406 ；5, 800, 529 ； 5, 782, 912 ；5, 741, 330 ；5, 733, 336 ；5, 713, 888 ；5, 653, 756 ；5, 593, 440 ；5, 569, 462 ； 5, 549, 675 ；5, 545, 223 ；5, 453, 278 ；5, 421, 923 ；5, 344, 454 ；5, 314, 471 ；5, 324, 518 ； 5, 219, 361 ;5, 100, 392 ;和5, 011，494,上述所有專(zhuān)利通過(guò)引用以其全文并入本文。胰腺祖 細(xì)胞體外裝載進(jìn)裝置中，或者當(dāng)該裝置已經(jīng)植入一段時(shí)間使得裝置預(yù)血管化后，然后經(jīng)裝 置一側(cè)上的裝載口體內(nèi)裝載細(xì)胞。
[0151] 因此，該裝置含有細(xì)胞（0.4微米）不可滲透的第一膜，但同時(shí)該膜不限制氧和不 同營(yíng)養(yǎng)物進(jìn)出內(nèi)膜的活動(dòng)，例如來(lái)自?xún)?nèi)膜外的葡萄糖可以滲透進(jìn)入含有成熟的胰腺激素分 泌細(xì)胞的囊，該胰腺激素分泌細(xì)胞響應(yīng)葡萄糖，可以分泌胰島素，然后該胰島素滲透出內(nèi) 膜。該裝置還含有血管化的外膜。
[0152] 為了將裝置用于任何細(xì)胞療法，該裝置必需完全體內(nèi)含有細(xì)胞（例如源于hES的 細(xì)胞與宿主免疫分離）。為了測(cè)定TheraCyte裝置的完整性，體內(nèi)比較了含有胰腺祖細(xì)胞 的完整裝置與膜中具有穿孔的那些裝置。將裝置穿孔會(huì)使宿主細(xì)胞侵入，因此建立起宿 主-移植物的細(xì)胞間接觸。
[0153] 通過(guò)外科手術(shù)將2個(gè)4. 5μLTheraCyte裝置植入到嚴(yán)重組合免疫缺陷型（SCID) 的各只雄性beige(BG)小鼠的附睪脂肪墊（EFP)下或皮下（SQ)，該TheraCyte裝置首先預(yù) 血管化。即，一只動(dòng)物在EFP下接受2個(gè)裝置，另一只動(dòng)物接受2個(gè)裝置（SQ)。這些完整但空 (無(wú)胰腺祖細(xì)胞）的裝置在動(dòng)物內(nèi)保留足夠的時(shí)間，使得宿主血管結(jié)構(gòu)形成并與裝置相連， 例如至少2至8周。8周后，源于hES細(xì)胞的約1. 5X106個(gè)胰腺祖細(xì)胞被裝載進(jìn)該4個(gè)裝置 的每一個(gè)中。在帶有預(yù)血管化的裝置的動(dòng)物被裝載的同時(shí)，將2個(gè)改進(jìn)的TheraCyte裝置植 入另外3只動(dòng)物，其中相同尺寸（4.5μL)的原TheraCyte裝置的改進(jìn)是在該裝置的膜中穿 孔。用具有和裝載進(jìn)入穿孔的裝置的相同劑量的細(xì)胞離體裝載這些穿孔的裝置（每只動(dòng)物 2個(gè)穿孔裝置）。并且在同一時(shí)間，和這些實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，并且每只動(dòng)物移植 置了Gelfoam上的胰腺祖細(xì)胞，如題為"生產(chǎn)胰腺激素的方法"的美國(guó)申請(qǐng)No. 11/773, 944 和上文的Kroon等人2008年所述的，盡管在一只動(dòng)物中兩個(gè)移植物置于EFP下，另一只動(dòng) 物中僅一個(gè)移植物置于EFP下。表1總結(jié)了上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0154] 表1 :來(lái)自包封的成熟胰腺激素分泌細(xì)胞的人C-肽血清水平
[0155]
[0156] 就葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS)而言，0指時(shí)間為0 ;5指葡萄糖刺激后5分鐘； 30指葡萄糖刺激后30分鐘；60指葡萄糖刺激后60分鐘；PVTCEFP，在附睪脂肪墊下預(yù)血 管化的TheraCyte;PVTCSQ，皮下的預(yù)血管化的TheraCyte;nPVTC+孔EFP，在附睪脂肪 墊下的未預(yù)血管化的TheraCyte;以及EFPGF，Gelfoam上的附睪脂肪墊，2X1.5M，具有約 1X106個(gè)細(xì)胞的2個(gè)構(gòu)建體。
[0157] 使得胰腺祖細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育和成熟，并且基本上如題為"生產(chǎn)胰腺激素的方法"的美 國(guó)專(zhuān)利No. 11/773, 944和上文的Kroon等人2008年所述，測(cè)定現(xiàn)在成熟的激素分泌細(xì)胞的 胰島素分泌和葡萄糖響應(yīng)。參見(jiàn)表1。此外，為了確定裝置的完整性，處死一些動(dòng)物，并進(jìn)行 裝置的免疫組化考察。
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