申請人之前證明了，對于證明胰島素分泌細胞對體內葡萄糖有響應的這一點，低 于50pM的血清人C-肽水平或低于25pM的胰島素水平是沒有意義的。這一相同標準用于 這些研究中。該研究的結果示于表1。原始Theracyte裝置和改進的Theracyte裝置在8、 12和15周后都具有相當的血清人C-肽水平（動物編號675-676&679-681)，動物編號681 在葡萄糖刺激后30分鐘時除外，當時血清C-肽水平要比在該時間段的任何其它動物要高 得多。
[0159] 首先，就Theracyte包封裝置的完整性而言，進行了原始Theracyte裝置和改進的 Theracyte裝置（動物編號分別為675-676和679-681)的蘇木精和伊紅染色。這些裝置的 顯微鏡考察顯示，原始Theracyte裝置具有不同的宿主血管結構，包括裝置周圍的血管型 細胞，但是沒有觀察到這些類似的結構侵入細胞不可滲透的內膜和進入含有源于hES的細 胞的空間。即，在容納源于hES的細胞或移植物的細胞不可滲透的內膜內沒有觀察到宿主 血管結構。相比之下，改進的Theracyte裝置的顯微鏡考察顯示，不僅在裝置的外側上存在 相連的宿主血管結構，在穿孔的細胞不可滲透的內膜內部也發(fā)現了血管結構和血管細胞。 因此，原始Theracyte裝置可以完整含有源于hES的細胞，并且在容納源于hES的細胞的空 間中沒有觀察到宿主細胞和組織。
[0160] 總的來說，Theracyte裝置能夠完全體內包封（分離）源于hES的細胞，并且胰腺 祖細胞可以在這些裝置中體內存活和成熟為功能性的激素分泌細胞。
[0161] 除了證明Theracyte裝置的完整性之外，本研究還證明了完全完整的裝置能夠在 包含的源于hES的細胞和宿主環(huán)境之間交換足夠的氧和各種營養(yǎng)物，并且胰腺祖細胞能夠 體內存活和成熟。例如，和對照（動物682和684)相比，在9和12周時預血管化的裝置中 的血清人C-肽水平不如相同時間點的一樣高。然而，到第15周（細胞植入后），預血管化 的裝置中的血清人C-肽水平和未包封（Gelfoam)的對照相當。
[0162] 此外，處死帶有原始Theracyte(預血管化的）裝置的動物，并取出裝置（或外植 體）（動物編號675&676)?；旧显偃鏚roon等人2008年所述，再次進行免疫組化，其通 過固定取出的裝置和/或外植體，將10個切片切成薄的微米切片而進行。用PBS洗滌切 片 2 次，之后用PBST(PBS/0.2% (wt/vol)吐溫 20;ThermoFisherScientific)洗滌。在 24°C下，用 5%正常猴血清（JacksonTmmunoResearchLabs)/PBSTr(PBS/0. 1 % (wt/vol) TritonX-lOO(Sigma))封閉 1 小時。在 1%BSA(Sigma)/PBSTr中稀釋一抗和二抗。在 4°C 下孵育一抗過夜，在保濕室中孵育二抗約1小時15分鐘。采用下述一抗和稀釋液；豚鼠抗胰 島素（INS)，1:500 (Dako，A0564);兔抗生長激素抑制素（SST)，1:500 (Dako，A0566);山羊抗 生長激素抑制素（SST)，1:300(SantaCruzBiotechnology,SC-7819);山羊抗胰高血糖素 (GCG)，l:100(SantaCruzBiotechnology,SC-7780)。通過共聚焦顯微術（Nikon,Exlipse 80i，Ci)進行成像。
[0163] 原始Theracyte裝置/外植物的免疫組化考察清楚地顯示了單陽性激素細胞，例 如GCG、INS和SST表達細胞。該數據支持了血清人C-肽數據，后者證明了移植的源于hES 的細胞的葡萄糖響應。激素分泌細胞的存在證實了胰腺祖細胞能夠體內存活和成熟，即使 是在完全包封的情況下。
[0164] 上述研究清楚地證明了原始和改進的Theracyte裝置完全包含源于hES的胰腺祖 細胞且沒有宿主細胞跨細胞不可滲透的內膜侵入的能力。這些研究還證明了該裝置的細胞 不可滲透的內膜盡管對細胞是不可滲透的，但是對于源于hES的胰腺祖細胞在裝置中存活 所需的氧和各種營養(yǎng)物是可滲透的，使得祖細胞能夠體內成熟為激素分泌細胞，即為發(fā)揮 功能且對葡萄糖響應的細胞。
[0165] 此外，預見到胰腺系細胞群、特別是至少本文所述的胰腺祖細胞，當包封于改進的 裝置，例如至少為圖1-11中所述的那些之中時，將會體內成熟和發(fā)揮功能。
[0166] 實施例2
[0167] 在沒有宿主-務棺物細朐接觸情況下，包封的腠腺祖細朐的體內功能
[0168] 為了確定移植的胰腺祖細胞群內功能化是否需要宿主-移植物細胞間接觸，將細 胞裝載進未預血管化的細胞包封裝置。
[0169] 胰腺祖細胞群基本上如實施例1中所述生成。在此研究中不對裝置進行預血管 化，并且將所有的TheraCyte裝置（4. 5μL)中的每個裝置離體裝載至少1. 5X106個細胞 (1.5Μ)或4. 5Χ106個細胞（4. 5Μ)。將含有1.5Μ個細胞的3個裝置皮下植入（TCSQ1.5Μ)， 將含有4. 5Χ106個細胞（4. 5Μ)或約15μL的3個裝置離體皮下植入（TCSQ4. 5Μ)。為 了對比和作為對照，將具有植入的未包封的胰腺祖細胞的動物與包封的但未預血管化的實 驗平行進行。將3只小鼠中的每一只皮下植入2個Gelfoam構建體，所述構建體裝載了約 1. 9-2. 4X106個細胞（2個構建體的總合），或約4μL/構建體，并且將2只小鼠在EFP下植 入2個Gelfoam構建體，所述構建體裝載了約1. 9-2. 4X106個細胞（2個構建體的總合）， 或約4μL/構建體。表2總結了上述實驗的結果。
[0170] 表2 :來自包封的未預血管化的成熟胰腺激素分泌細胞的人C-肽血清水平
[0171]
[0172] 就葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS)而言，0指時間為0 ;60指葡萄糖刺激后60分 鐘；SQ，皮下裝置；SQGF，皮下Gelfoam;EFPGF，EFP，附睪脂肪墊Gelfoam;1. 5M，1X106個 細胞；4. 5,4. 5X106個細胞；1. 9-2. 4M，1. 9-2. 4X10 6個細胞；nd，未檢測到。
[0173] 盡管實施例1證明了源于hES的細胞可以在預血管化的裝置中體內存活、成熟和 發(fā)揮功能，但基于表2,預血管化對于細胞存活、生長和/或成熟不是必不可少的。表2比較 了包封的胰腺祖細胞和Gelfoam上的未包封的胰腺祖細胞，文獻已經充分表明后者在體內 產生功能性激素分泌細胞，參見上文的Kroon等人2008年。事實上，在葡萄糖刺激后60分 鐘時，包封的細胞的血清C肽水平與從未包封的細胞觀察到的血清C肽水平是相當的。事 實上，當皮下植入時，在例如比較動物編號833-835(TCSQ1.5M)與819-821 (SQ1. 9-2. 4M) 時，包封的細胞比未包封的細胞表現得更好。因此，宿主-移植物細胞間接觸不是必不可少 的，這是因為如此實施例中所明確證明的，在完全無任何宿主-移植物細胞間接觸時，移植 的完全包封的細胞存活、生長和成熟。
[0174] 本文所述的方法、組合物和裝置目前是優(yōu)選的實施方式的代表，為示例性的且不 意為對專利范圍的限制。本發(fā)明的精神所涵蓋的領域的技術人員將會想到改變、替代方式、 修飾和變化以及其它用途。例如，TheraCyte裝置的尺寸為4. 5μL、20μL和40μL，因此，本 領域普通技術人員如果采用能夠含有更多個細胞的裝置，就可以擴大上述研究的規(guī)模。此 外，由于上文的Kroon等人2008年已經證明了胰腺祖細胞在移植物植入前和之后在治療鏈 脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠中的效能，本領域普通技術人員可以采用本文所述的包封的細 胞進行類似的研究。并且，純化或富集特定源于hES的細胞群的方法詳細描述于2008年4 月8日提交的題為"用于純化源于HES細胞的內胚層和胰腺內胚層細胞的方法"的美國申請 12/107, 020中，其通過引用以其全文并入本文。因此，本領域普通技術人員可以富集特定源 于hES的細胞，包括但不限于胰腺祖細胞、胰腺內分泌前體細胞和/或內分泌前體細胞。
[0175] 實施例3
[0176] 當棺入時體內發(fā)育并發(fā)揮功能的冷凍保存的腠腺祖細朐
[0177] 由于細胞移植受到缺乏可用的細胞來源以及操作和后勤問題的影響，需要提供不 受限制的細胞來源，用于在患者方便的時間進行移植。
[0178] 基本上如實施例1和2以及上文的Kroon等人2008年，以及下表3a_h所述，分化 人ES細胞。在分化的第14天，離心胰腺祖細胞，然后重懸于冷凍培養(yǎng)基中，該冷凍培養(yǎng)基 含有具有30%無異源（Xeno-free)Knockout血清替代物的DMEM、25mMHEPES和10%二甲 基亞砜溶液。將細胞等分到冷凍管中。在環(huán)境溫度下在冷凍培養(yǎng)基中平衡細胞約15分鐘， 然后在4°C下平衡細胞45分鐘，之后置于冰上，并放入平衡到0°C的程控冰箱中。
[0179] 將細胞和冷凍室以2°C/min的速度調節(jié)成-9°C。在此溫度，將所述室和樣品保持 約10分鐘，然后手工向小管接種。將樣品在-9°C下保持約10分鐘，然后以0. 2°C/分鐘的 速度冷卻，直到樣品達到-40°C。隨后將冷凍室以25°C/分鐘的速度冷卻，直到樣品達到 約-150°C。然后將置于管中的細胞移到液氮儲存冰箱的氣相中。
[0180] 在期望的時間，通過將細胞轉移至37°C水浴迅速解凍小管。將細胞轉移至15ml無 菌試管中，該試管含有具有B-27 (1:100)和KGF+EGF(每種50ng/mL)的DMEM，輕柔混合，并 以50Xg簡單離心。去除上清，將細胞重懸于加入25μg/mLDNA酶的相同緩沖液中，并放 置進行旋轉培養(yǎng)。
[0181] 當它們已經旋轉到組織培養(yǎng)孔的中心時，在任何顯著細胞損傷發(fā)生之前迅速解凍 時，并且在細胞量減小結束時的解凍后4天，通過對胰腺祖細胞團塊進行拍照來定量存活 的細胞。定量照片中細胞占據的區(qū)域，并且表示為解凍后4天時的存活百分比。在此實施 例中，至少獲得52 %的存活。冷凍保存和解凍后培養(yǎng)的胰腺祖細胞的形態(tài)和新鮮細胞相同。
[0182] 解凍后培養(yǎng)4天后，基本上如上文所述將細胞裝載于裝置中，并如上文所述以外 科手術植入哺乳動物中。冷凍保存的細胞能夠體內發(fā)育和成熟為胰腺的功能性激素分泌細 胞和腺泡細胞，類似針對新鮮胰腺祖細胞團塊所述的。參見實施例4。
[0183] 因此，源于hES細胞的人胰腺祖細胞的體外冷凍保存對植入后發(fā)育的影響很小或 者沒有影響。因此，證明了冷凍保存是儲存適于移植的源于hESC的胰腺祖細胞的可靠方 法。
[0184] 實施例4
[0185] 提供用于治療糖尿病的人腠腺祖細朐的方法
[0186] 多能干細朐培養(yǎng)條件
[0187] 基本上如上文的D'Amour等人2005年和2006年和Kroon等人2008年所述， 進行多能干細胞、特別是ES和IPS細胞的培養(yǎng)、增殖和維持。采用具有DMEM-F12/1% Glutamax/1%非必需氨基酸/1%Pen-Strep/0. 2%b-疏基乙醇的ES基礎培養(yǎng)基。對于階 段0或hES細胞的增殖而言，多種生長因子和/或胰島素和胰島素樣生長因子的水平保持 非常低。使用低水平的人血清培養(yǎng)不含飼養(yǎng)層的多能干細胞。使用Rho_激酶抑制劑Y27632 維持多能干細胞。將被理解的是其它Rho_激酶抑制劑也可使用而得到類似結果。ES或多 能干細胞培養(yǎng)條件基本上類似于上文所述的實施例1和2。
[0188] 將被理解的是，ES基礎培養(yǎng)基可以常規(guī)地含有約20%Knockout血清替代物（KSR) 或無異源（XF)Knockout血清替代物。
[0189] 將被理解的是，hES細胞培養(yǎng)物常規(guī)地含有約0ng/mL、約4ng/mL或約10ng/mL堿 性成纖維細胞生長因子（bFGF)。如之前所證明的，在某些條件下，低水平的活化蛋白A幫助 促進多能干細胞增殖，而不促進hES細胞分化。因此，多能干細胞培養(yǎng)物通常含有約5ng/ mL、約10ng/mL或約20ng/mL的活化蛋白A或B，或者其它類似的生物活性TGF-β生長因 子家族，例如至少⑶F-8和⑶F-l1。還在其它多能干細胞培養(yǎng)物中，Errb2-結合配體，例如 低水平的調蛋白也幫助促進hES細胞增殖，例如在約5至10ng/mL。并且，不同或低水平的 bFGF、活化蛋白A、B或其它TGF-β生長因子家族成員，特別是⑶F-8和-11以及Errb2-結 合配體，例如調蛋白的任意組合都可以用于促進hES細胞培養(yǎng)，只要保持低水平的生長因 子，從而促進hES細胞的增殖和它們的多能性并且其細胞不分化。本文所述的實施方案描 述了在維持和增殖多能干細胞培養(yǎng)物中的各種生長因子（在一些情況下的大蛋白），但是 這些蛋白在大規(guī)模制備基礎上的高成本使得在成本上受限制。因此，鑒別和表征某些小分 子替代更大的生長因子蛋白可能是有利的。一個這樣的分子是去甲腎上腺素（NE)，其更為 詳細地描述于2009年4月27日提交的題為"支持多能細胞生長的小分子及其方法"的美國 申請61/172, 998,其通過引用以其全文并入本文。在一個實施方案中，約5ng/mL、約10ng/ mL、約 20ng/mL、約 30ng/mL、約 40ng/mL、約 50ng/mL、約 60ng/mL、約 70ng/mL、約 80ng/mL、約 90ng/mL、約100ng/mL或更多的用于維持多能干細胞培養(yǎng)物，例如，hES或iPS培養(yǎng)物。在 一個優(yōu)選實施方案中，約50ng/mL可以用于hES細胞培養(yǎng)物中。
[0190] 將被理解的是，可以常規(guī)地在成纖維細胞飼養(yǎng)層細胞上保持多能干細胞的增殖。 可選擇地，可以在胞外基質包被的板（Corning)上培養(yǎng)ES細胞。此外，Bodnar等人（Geron Corporation,MenloPark,California,USA)在美國專利 6, 800, 480 中描述了在單層胞外 基質上生長hES細胞培養(yǎng)物，該基質通過裂解成纖維細胞飼養(yǎng)層生成，該美國專利的公開 內容通過引用明確并入本文。然而，在優(yōu)選實施方案中，使用低水平的人血清培養(yǎng)不含飼養(yǎng) 層的多能干細胞，該低水平例如在基礎ES細胞培養(yǎng)基中的約0. 1 %、約0. 2%、約0. 3%、約 0· 4%、約 0· 5%、約 0· 6%、約 0· 7%、0· 8%、約 0· 9%、約 1%、約 1. 2%、約 1. 4%、約 1. 6%、 約1.8%、約2%至約10%或更多?？梢酝瑫r向基礎培養(yǎng)基中加入人血清，從而避免任何 對如美國專利6, 800, 480中考慮的或由Corning提供的預包被組織培養(yǎng)皿的需要。人血 清在培養(yǎng)、維持和增殖多能干細胞培養(yǎng)物中的用途更詳細地描述于2007年10月19日提 交的題為"用于含人血清的無需飼養(yǎng)層的多能干細胞培養(yǎng)基的方法和組合物"的美國申請 11/875, 057,其通過引用以其全文并入本文。
[0191] 還可以通過加入Rho激酶家族的抑制劑，例如至少Y27632來維持多能干細胞。近 來已發(fā)現Y27632防止細胞凋亡，以及促進解離的人多能干細胞的存活和克隆效率，而不影 響自更新性質或多能性。盡管本文所述的實施方案由于Y27632的商業(yè)可用性使用Y27632， 但也可以采用其它Rho激酶抑制劑，并且仍在本發(fā)明的范圍內。
[0192] 階段1的多能干細朐分化條件
[0193] 基本上如上文的D'Amour等人2005年和2006年和Kroon等人2008年以及上 文相關美國申請所述進行多能干細胞、特別是ES和IPS細胞的定向分化，該美國申請包括 2009年4月22日提交的題為"從分化的重新編程的細胞生成的細胞組合物"的美國申請 61/171，759,上述這些通過引用以其全文并入本文。
[0194] 在分化階段1之前，或在分化過程的第0天，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細胞，該培養(yǎng) 基包含RPMI1640/1 %Glutamax/1 %Pen-Strep，并且基本上無血清和/或約0. 1 %牛血清 白蛋白（BSA)。此外，分別加入1:5000或1:1000或約0.02%或0. 1 %的胰島素/轉鐵蛋白 /硒（ITS)補充物。此外，向分化培養(yǎng)基中加入包括TGF-β超家族生長因子和Wnt家族成 員的各種生長因子。
[0195] 將被理解的是，加入的TGF-β超家族生長因子包括但不限于活化蛋白A、活化蛋 白B、⑶F-8或⑶F-11。在一些實施方案中，可以使用Wnt通路活化因子。在另一個實施 方案中，Wnt-3a與TGF-β超家族生長因子之一一起使用。在進一步優(yōu)選的實施方案中， 約50ng/mL的Wnt3a和約100ng/mL的TGF-β超家族成員，例如活化蛋白A、活化蛋白B和 GDF-8和-11 一起使用。還在另一個實施方案中，活化類似的信號傳導通路的小分子可以代 替生長因子。參見，例如Borowiak，M等人（2009年）描述了使小鼠和人胚胎干細胞定向分 化為內胚層的兩個小分子。Borowiak,Μ等人（2009年）CellStemCell, 4 (4) :348-358通 過引用以其全文并入本文。
[0196] 在上述培養(yǎng)基條件下孵育多能干細胞至少24小時，該時間之后將培養(yǎng)基換成包 含下述成分的培養(yǎng)基：RPMI1640/1 %Glutamax/1 %Pen-Str印和較多的FBS，約0· 2 %FBS， 并進一步含有約l〇〇ng/mL的TGF-β超家族成員。不加入Wnt家族成員。將被理解的是， 可以在約24小時后向培養(yǎng)物中加入Wnt家族成員。
[0197] 在此培養(yǎng)基中再培養(yǎng)細胞24小時。從細胞已經分化約總計48小時（第0天至第 2天）后，培養(yǎng)物中的細胞包含分化的定形內胚層細胞。
[0198] 將被理解的是，從第0天（多能干細胞）開始的階段1的分化總天數可以為約1-3 天，優(yōu)選約1-2天，甚至更優(yōu)選約2天。將被理解的是，階段1分化后，培養(yǎng)物中的細胞將包 含約 10%、約 20%、約 30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%、約 95%、 約96%、約97%、約98%或約99%分化的定形內胚層細胞。
[0199] 用于確定培養(yǎng)物的組成的方法之前已描述于上文相關申請中，但是主要通過本領 域熟知的RNA和蛋白測定進行。定形內胚層細胞表達高水平的某些標簽細胞表面標志物如 S0X17和F0XA2,還可以表達高水平的CER和CXCR4,但不會可感知地表達HNF4-α，HNF4-α在前腸內胚層（或roxi陰性的前腸）細胞中可感知地表達。定形內胚層細胞也不會可感 知地表達在例如之后的階段3、4或5的細胞中觀察到的標志物，或者在roxi陽性的前腸 內胚層細胞中表達的roxi、NNF6、S0X9和PROX1，或者在roxi陽性的胰腺祖細胞或roxi/ NKK6. 1共陽性的胰腺祖細胞中表達的roxi、NKX6. 1、PTF1A、CPA和cMYC，或者在內分泌前 體細胞中表達的NGN3、PAX4、ARX和NKX2. 2,或者在多激素或單激素胰腺內分泌細胞中表達 的INS、GCG、GHRL、SST或PP。
[0200] 階段2的分化條件
[0201] 多能干細胞分化成DE約48小時（約2天）后，將DE分化培養(yǎng)基替換為促進人前 腸內胚層（PDX1陰性的前腸內胚層）形成的另一種培養(yǎng)基條件或階段2細胞。該細胞培養(yǎng) 基包含RPMI1640/1%Glutmax/1%Pen-Str印和0· 2%FBS或進一步升高含量的FBS，例如 約2%FBS。類似于上文階段1培養(yǎng)基，分別加入1:5000或1:1000或約0.02%或0. 1%的 ITS補充物。
[0202] 將被理解的是，DE分化培養(yǎng)基不總是補充ITS。
[0203] 然而，有意在培養(yǎng)基中不包含DE分化生長因子，例如TGF-β超家族生長因子或 Wnt家族成員。向培養(yǎng)基中加入TGF-β激酶抑制劑。
[0204] 由于去除TGF-β超家族成員對前腸內胚層正確形成有利，TGF-β超家族成員抑 制劑，例如TGF-β激酶抑制劑的使用確保了TGF-β超家族成員的活動基本上被抑制的效 果。這使得DE有效定向分化成前腸內胚層（PDX1陰性的前腸內胚層），而沒有培養(yǎng)物中DE 分化的持續(xù)效果。
[0205] 代替TGF-β家族成員，向培養(yǎng)物中加入角化細胞生