藿次苷D2
[0092] 按照實施例1-3中的方法分別進(jìn)行合成合成酪醇或者酪醇和紅景天苷及淫羊藿 次苷D2的大腸桿菌表達(dá)菌株的構(gòu)建，不同的是，tyrA*替換為tyrA，aroG*替換為aroG。得 到發(fā)酵液D2和D3。
[0093] 測試?yán)?br>[0094] 酪醇和紅景天苷及淫羊藿次苷D2的檢測
[0095] (1)產(chǎn)物的HPLC檢測：分別取實施例3中的發(fā)酵液1和2,對比例1中的發(fā)酵液 D1，以及對比例2中的發(fā)酵液D2和D3各lmL12000rpm離心5min后，取上清，進(jìn)行HPLC分 析檢測。分析條件如下：儀器為：安捷倫液相色譜儀，測定條件包括：C18柱（4. 6X250mm); 檢測波長224nm ;流動相A=水（含0. 1%體積甲酸），B=甲醇；流速=lmL/min ;梯度洗脫條 件：0 - 20min20%體積B ;21 - 45min20%體積B到100%體積B (21 - 45min內(nèi)B的濃度均勻 增加）；進(jìn)樣量50μ L。
[0096] 發(fā)酵液1和發(fā)酵液2的結(jié)果見圖2。箭頭1，2, 3分別表示酪醇和紅景天苷混合標(biāo) 準(zhǔn)品（Img酪醇標(biāo)品與Img紅景天苷標(biāo)品混溶于ImL甲醇，進(jìn)樣量5 μ L)，發(fā)酵液1(菌株Λ A (八肋10))和發(fā)酵液2(菌株厶六（41?010和邯了7386))。如圖所示，菌株厶六（41?010)的發(fā) 酵產(chǎn)物在Ilmin時出現(xiàn)了一個新峰，與酪醇標(biāo)準(zhǔn)品（峰I )的出峰時間一致；菌株Λ A(AROK) 和UGT73B6)的發(fā)酵產(chǎn)物除了前述酪醇峰，在8min時還出現(xiàn)了另一個新峰，與紅景天苷標(biāo)準(zhǔn) 品（峰II)的出峰時間一致，此外，在5min時還出現(xiàn)另一個新峰（峰III)。發(fā)酵液Dl和D2的 出峰時間與發(fā)酵液1 一致，發(fā)酵液D3的出峰時間與發(fā)酵液2 -致。
[0097] (2)產(chǎn)物的LC-MS^H-NMR分析：對步驟（1)中各發(fā)酵液中看到的新峰進(jìn)行LC-MS 分析，其中，進(jìn)行LC-MS分析的條件包括：C18柱（4. 6X 250mm);檢測波長201nm ;流動相A= 水（含0. 1體積％乙酸銨），B=甲醇；流速=lml/min ;梯度洗脫條件：0 - 5min5%體積B， 6 - 45min5%體積B到100體積％B(6 - 45min內(nèi)B的濃度均勻增加);進(jìn)樣量50 μ I ;ESI正離 子源，分子量掃描范圍50 - 1200。發(fā)酵液2的掃描結(jié)果見圖3。峰II的MS圖譜上有紅景天苷 的MS特征峰318. 15,峰III的MS圖譜上有淫羊藿次苷D2的MS特征峰318. 29。通過進(jìn)一步的 1H-NMR 可以確定Λ A (AR010-UGT73B6)菌株產(chǎn)紅景天苷[1H-NMR (500MHz, DMS0-d6)數(shù)據(jù)：9. 15(s, 1H) ;7. 02(d, J=I0.0 , H-C(10, 14)) ;6. 64(d, J=IO. Ο, H-C(ll, 13)) ;4. 95 (s, OH) ;4. 92( s, OH) ; 4. 88 (s, OH) ; 4. 47 (t, J=5. 0, OH) ; 4. 15 (d, J=10. 0, H-C(I)) ; 3. 85 (dt, J=5. 0, 10. 0, Ha -C (7)) ; 3. 64 (dd, J=5. 0, 10. 0, Ha-C (6)) ; 3. 54 (dt, J=5. 0, 10. 0, Hb-C (7)) ; 3. 40 (m, Hb-C (6)) ;3. 09 (m, H-C (3)) ; 3. 05 (m, H-C (5)) ; 3. 02 (m, H-C (4)) ; 2. 94 (m, H-C (2)) ; 2. 71 (m, CH2 (8))]； 以及淫羊藿次苷 D2 [1H-NMR (500MHz, DMS0-d6)數(shù)據(jù)[1H-NMR (600MHz, DMS0-d6)數(shù)據(jù)：7. 11 (d ,J=12. 0, H-C (9, 11));6.92 (d, J=12. 0, H-C (8, 12)) ; 5. 25 (d, J=6. 0, 2-0H) ; 5. 05 (d, J=6. 0, 3 -OH) ; 4. 99 (d, J=6. 0, 4-0H) ; 4. 59 (t, J=6. 0, 6-0H) ; 4. 53 (t, J=6. 0, 14-OH) ; 4. 78 (d, J=6. 0, H -C (I)) ; 3. 23 (m, H-C (2) ; 3. 25 (m, H-C (3) ; 3. 15 (m, H-C (4) ; 3. 30 (m, H-C (5) ; 3. 68 (m, Ha-C (6) );3. 45 (m, Hb-C (6)) ; 3. 55 (t, J=6. 0, H-C (14)) ; 2. 65 (t, J=6. 0, H-C (13))]，結(jié)果如圖 4 所示。
[0098] 且經(jīng)測定，酪醇高產(chǎn)菌株Λ A(AROlO)發(fā)酵液I中酪醇的產(chǎn)量為600mg/L，菌株Λ A (AR010和UGT73B6)發(fā)酵液中的酪醇產(chǎn)量為500mg/L，紅景天苷的產(chǎn)量為50mg/L，淫羊藿次 苷D2的產(chǎn)量為40mg/L。發(fā)酵液Dl中的酪醇產(chǎn)量為200mg/L，發(fā)酵液D2中的酪醇產(chǎn)量為 250mg/L，發(fā)酵液D3中的酪醇的產(chǎn)量為200mg/L，紅景天苷的產(chǎn)量為20mg/L，淫羊藿次苷D2 的產(chǎn)量為15mg/L。
[0099] 本發(fā)明的高產(chǎn)酪醇大腸桿菌中酪醇產(chǎn)量可達(dá)600mg/L，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步實現(xiàn)了 紅景天苷及淫羊藿次苷D2的生物合成，紅景天苷的產(chǎn)量可達(dá)50mg/L，淫羊藿次苷D2的產(chǎn)量 可達(dá)40mg/L，顯著的高于對比例中的酪醇或紅景天苷及淫羊藿次苷D2的產(chǎn)量。因此，本發(fā) 明提供了一種高產(chǎn)酪醇及紅景天苷的新的生物合成途徑，為酪醇及紅景天苷的大規(guī)模工業(yè) 生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會效益。
[0100] 以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中 的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這 些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0101] 另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛 盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可 能的組合方式不再另行說明。
[0102] 此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本 發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
【主權(quán)項】
1. 一種大腸桿菌表達(dá)菌株，其特征在于，所述大腸桿菌表達(dá)菌株不表達(dá)feaB，tyrR， 口 71^，？71^，？1^^基因，含有并能夠表達(dá)如5￡〇10吣：1所示的七7^*基因，如5￡〇10吣 ： 2 所不的 aroG* 基因，以及 ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE 和 AROlO 基因。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌表達(dá)菌株，其中，所述大腸桿菌表達(dá)菌株的保藏編 號為CGMCC No. 8897,所述大腸桿菌表達(dá)菌株還含有并能夠表達(dá)UGI73B6基因。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌表達(dá)菌株,其中，所述大腸桿菌表達(dá)菌株通過如下 方法進(jìn)行制備： (1) 通過基因敲除或基因沉默使大腸桿菌菌株的feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA基因不 表達(dá)，得到大腸桿菌菌株A A ; (2) 用含有 aroG*，tyrA*，ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE 和 AROlO 基因的表達(dá)載體對步 驟（1)得到的大腸桿菌菌株A A進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到所述大腸桿菌表達(dá)菌株； 優(yōu)選地，用含有 aroG*，tyrA*，ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE，AR010 和 UGT73B6 基因的 表達(dá)載體對步驟（I)得到的大腸桿菌菌株A A進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到所述大腸桿菌表達(dá)菌株。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌表達(dá)菌株，其中， 所述表達(dá)載體包括大腸桿菌表達(dá)載體Vl和大腸桿菌表達(dá)載體V2 ; 所述大腸桿菌表達(dá)載體Vl含有aroG*，tyrA*，ppsA，tktA，aroB，aroD和aroE基因；所 述大腸桿菌表達(dá)載體V2含有AROlO基因，優(yōu)選含有AROlO和UGI73B6基因。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的大腸桿菌表達(dá)菌株，其中， 所述大腸桿菌表達(dá)載體 Vl 為 pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA-aroE-aroD_aroB ; 所述大腸桿菌表達(dá)載體V2為pTrc-AR010,優(yōu)選為pTrc-AR010-UGI73B6。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌表達(dá)菌株，其中，所述大腸桿菌菌株為MG1655或 BL21(DE3) 〇7. 權(quán)利要求1-6中任意一項所述的大腸桿菌表達(dá)菌株在生物合成酪醇和/或紅景天 苷和淫羊藿次苷D2,和/或在制備含有酪醇和/或紅景天苷和淫羊藿次苷D2的產(chǎn)品中的應(yīng) 用。8. -種在大腸桿菌中生物合成酪醇和/或紅景天苷和淫羊藿次苷D2的方法，其特征在 于，該方法包括：將權(quán)利要求1-6中任意一項所述的大腸桿菌表達(dá)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，使其 生物合成酪醇和/或紅景天苷和淫羊藿次苷D2。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的方法包括： (1) 將權(quán)利要求1-6中任意一項所述的大腸桿菌表達(dá)菌株接種至含有作為篩選標(biāo)記用 抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，并在35-38°C下培養(yǎng)10-16小時，得到大腸桿菌種子液； (2) 將步驟（1)中得到的大腸桿菌種子液接種至含有所述作為篩選標(biāo)記用抗生素 的M9Y液體培養(yǎng)基中，并在35-38°C下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；當(dāng)0D600達(dá)到0. 4-0. 6時加入異丙 基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷，28-30°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)36-72小時。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中， 所述作為篩選標(biāo)記用抗生素為氯霉素和氨芐青霉素，優(yōu)選地，所述氯霉素的加入量使 其終濃度為20-50mg/mL ;所述氨芐青霉素的加入量使其終濃度為100-150mg/mL ; 以所述M9Y液體培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述大腸桿菌種子液的接種量為1-2體積％ ; 異丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷的加入量使其終濃度為0. 5-1. OmM。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)酪醇和/或紅景天苷和淫羊藿次苷D2的大腸桿菌表達(dá)菌株及其應(yīng)用，其中，該大腸桿菌表達(dá)菌株不表達(dá)feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA基因，含有并能夠表達(dá)如SEQ ID No：1所示的tyrA*基因，如SEQ ID No：2所示的aroG*基因，以及ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE和ARO10基因。本發(fā)明的在大腸桿菌表達(dá)菌株中生物合成酪醇和/或紅景天苷和淫羊藿次苷D2的方法，酪醇的產(chǎn)量可達(dá)600mg/L，紅景天苷的產(chǎn)量可達(dá)50mg/L，淫羊藿次苷D2的產(chǎn)量可達(dá)40mg/L，是一種高產(chǎn)酪醇和/或紅景天苷和淫羊藿次苷D2的新的生物合成途徑，為酪醇和/或紅景天苷和淫羊藿次苷D2的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會效益。CGMCC No889720140305
【IPC分類】C12P19/44, C12N15/70, C12N1/21, C12P7/22, C12R1/19
【公開號】CN104946575
【申請?zhí)枴緾N201410115011
【發(fā)明人】畢慧萍, 白艷芬, 莊以彬, 劉濤, 馬延和
【申請人】中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2014年3月26日