明中，在上述步驟中，PCR擴增反應的反應體系可以為常規(guī)的PCR擴增反應 體系，優(yōu)選為：5Xphusion HF 緩沖液 10μ1，2·5πιΜ (1ΝΤΡ2·5μ1，50μΜ 正向引物 0·5μ1， 50 μ M 反向引物 0.5 μ 1，模板 0.5 μ 1，Phusion DNA 聚合酶 0.5 μ 1，水 35. 5 μ 1。
[0051] 本發(fā)明中，在上述步驟中，PCR擴增反應的反應程序可以為常規(guī)的PCR擴增反應程 序，例如可以為：94-95°C預變性4-5分鐘；96-98°C變性20-30秒，55-60°C退火30-60秒， 72°C延伸30-120秒，28-32個循環(huán)；72°C延伸8-10分鐘。優(yōu)選為：95°C預變性5分鐘；98°C 變性20秒，56 °C退火45秒，72 °C延伸2分鐘，30個循環(huán)；72 °C延伸10分鐘。
[0052] 本發(fā)明中，對用于構(gòu)建大腸桿菌表達菌株的大腸桿菌的種類沒有特殊要求，可以 為能夠表達目的基因的本領(lǐng)域常用的各種大腸桿菌，例如，所述大腸桿菌可以為MG1655或 BL21 (DE3)。為了使目的基因能夠得到更好的表達，所述大腸桿菌優(yōu)選為MG1655。
[0053] 另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的大腸桿菌表達菌株在生物合成酪醇和/或紅 景天苷和淫羊藿次苷D2，和/或在制備含有酪醇和/或紅景天苷和淫羊藿次苷D2的產(chǎn)品中 的應用。
[0054] 其中，厶4(八1?010)可用于合成酪醇，厶4(41?010和邯了7386)可用于合成酪醇和 紅景天苷以及淫羊藿次苷D2。
[0055] 再一方面，本發(fā)明還提供了一種在大腸桿菌中生物合成酪醇和/或紅景天苷和淫 羊藿次苷D2的方法，其中，該方法包括：將如上所述的大腸桿菌表達菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，使 其生物合成酪醇和/或紅景天苷和淫羊藿次苷D2。
[0056] 本發(fā)明中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的方法可以包括以下步驟：
[0057] (1)將如上所述的構(gòu)建的大腸桿菌表達菌株接種至含有作為篩選標記用抗生素的 LB液體培養(yǎng)基中，并在35-38°C下培養(yǎng)10-16小時，得到大腸桿菌種子液；
[0058] (2)將步驟（1)中得到的大腸桿菌種子液接種至含有所述作為篩選標記用抗生素 的M9Y (M9基本培養(yǎng)基+0. 025%yeast extract)液體培養(yǎng)基中，并在35-38°C下培養(yǎng)，當 0D600達到0. 4-0. 6時加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)，28-30°C下誘導培養(yǎng) 36-72小時。
[0059] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在發(fā)酵培養(yǎng)時，LB液體培養(yǎng)基和M9Y液體培養(yǎng)基 中加入的抗生素為大腸桿菌表達菌株中含有的表達載體上的作為篩選標記用的抗生素，例 如，氯霉素和氨芐青霉素；所述抗生素的濃度為本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，例如，所述氯霉素的加 入量使其終濃度為20-50mg/mL ;所述氨芐青霉素的加入量使其終濃度為100-150mg/mL。
[0060] 另外，所述大腸桿菌種子液的接種量也可以為本領(lǐng)域常規(guī)的選擇，例如，接種量為 1-2體積％，也即，每100mL的M9Y液體培養(yǎng)基中加入l-2ml所述大腸桿菌種子液。
[0061] 此外，本發(fā)明對異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷的濃度也沒有特別的限制，優(yōu)選 地，其加入量可以使其在Μ9Υ液體培養(yǎng)基中的終濃度為0. 5-1. OmM。
[0062] 根據(jù)本發(fā)明，能夠理解的是，當需要生產(chǎn)酪醇時，可以對Λ A (AROlO)進行發(fā)酵培 養(yǎng)；當需要生產(chǎn)酪醇、紅景天苷及淫羊藿次苷D2時，可以對ΛΑ (AR010和UGT73B6)進行發(fā) 酵培養(yǎng)。
[0063] 實施例
[0064] 以下的實施例將對本發(fā)明作進一步的說明，但并不因此限制本發(fā)明。
[0065] 以下實施例中，大腸菌株MG1655和大腸桿菌DH5 α均可市售獲得，大腸菌株 MG1655用于本發(fā)明中所有基因的表達，大腸桿菌DH5ci用于本發(fā)明中所有基因的克隆。
[0066] 大腸桿菌表達載體 pBbA5c_MevT_MBIS 購自 Addgene，貨號 35151，由 Taek_Soon Lee和 Jay Keasling提供（參見Peralta-Yahya Ρ· Ρ·，Ouellet Μ·，Chan R. ,Mukhopadhyay A. ,Keasling J.D. , Lee Τ. S. , Identification and microbial production of a terpene-based advanced biofuel.Nature communication, 2:483, doi: 10. 1038/ nC〇mmsl494)，本發(fā)明中將該質(zhì)粒進行了改造，舍去了其用于在大腸桿菌中過表達的基因， 保留了質(zhì)粒骨架，得到質(zhì)粒pBbA5c-MCS。用作模板的大腸桿菌載體pACYCDuet-Ι，購自 Novagen,貨號 71147-3。大腸桿菌表達載體 pTrcHisB 購自 Invitrogen,貨號 V360-20。
[0067] Phusion高保真DNA聚合酶購自Thermo公司。
[0068] 所用引物均由深圳華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1，其中下劃線部分 表示酶切位點。
[0069] 表 1
[0070]


[0073] 下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，按照常規(guī)條件進行，例如《分子克?。?實驗室手冊》中所述的條件，或按照相應生物學試劑的制造廠商所建議的條件。
[0074] 實施例1
[0075] 本實施例用于說明大腸桿菌菌株Λ A的構(gòu)建
[0076] (1)大腸桿菌MG1655,質(zhì)粒pKD46 (溫度敏感型，含有受阿拉伯糖啟動子調(diào)控的 exo、bet和gam基因，Amplr)、pKD4 (含有兩端帶有FRT位點的卡那抗性基因，Kanlr)、pCP20 (溫度敏感型，編碼能夠識別FRT位點的FLP重組酶，Amp lr)均由本實驗室保存。
[0077] (2)引物feaB-5FPL/feaB_3RPL用于擴增pKD4中Kan基因以替換feaB基因編 碼區(qū)；引物1655⑶-5FP/1655⑶-3RP為feaB基因敲除后重組菌鑒定引物，兩條引物各位 于打靶序列區(qū)的左右兩側(cè)。PCR反應體系為：5XPCR buffer，IOyL ;dNTP(2mM each)， 5yL;引物 feaB-5FPL 和 feaB-3RPL(10y Μ)，各 2yL;Phusion high-fidelity DNA polymerase (5U/ μ L)，0· 5 μ L ;pKD4, 50ng ;ddH20 補足體系到 50 μ L。反應程序為：初始變性 98°C 30sec ;98°C 8sec，55°C 30sec，72°C 30sec，30 個循環(huán)；終延伸 72°C lOmin。得到打靶 分子DNA片段。
[0078] (3)將過夜培養(yǎng)12h的含有pKD46的大腸桿菌MG1655按1:100的量接種，振蕩培 養(yǎng)至0D600值約為0. 2,加入終濃度為lOOmmol/L的阿拉伯糖繼續(xù)培養(yǎng)至0D600為0. 5-0. 6。 制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)，取50 μ L感受態(tài)菌液與約200ng的打靶分子DNA片段進行電轉(zhuǎn)化。電擊后 立即加入ImL LB液體培養(yǎng)液，37°C，振蕩培養(yǎng)2h，涂布于LB平板（Kanlr)篩選陽性克隆。隨 后第二輪體內(nèi)重組過程中，將編碼FLP位點特異性重組酶的質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)入feaB敲除菌株 中，將Kan抗性基因剔除。然后37°C培養(yǎng)，丟掉pCP20。利用引物1655⑶-5FP/1655⑶-3RP 進行PCR驗證，得到feaB基因敲除的大腸桿菌。
[0079] 用同樣的方法將tyrR，pykF，pykA和pheA基因敲除掉，得到敲除基因 feaB，tyrR， pykF，pykA和pheA的大腸桿菌菌株Λ A。相應的用于敲除的基因及驗證的基因見表1，其 中，用于敲除tyrR的引物如SEQ ID No :32和SEQ ID No :33所示，驗證引物如SEQ ID No: 34和SEQ ID No :35所示；用于敲除pykF的引物如SEQ ID No :36和SEQ ID No: 37所示， 驗證引物如SEQ ID No :38和SEQ ID No :39所示；用于敲除pykA的引物如SEQ ID No :40 和SEQ ID No :41所示，驗證引物如SEQ ID No :42和SEQ ID No :43所示；用于敲除pheA 的引物如SEQ ID No :44和SEQ ID No :45所示，驗證引物如SEQ ID No :46和SEQ ID No : 47所示。
[0080] 實施例2
[0081] 本實施例用于說明酪醇及紅景天苷及淫羊藿次苷D2生物合成途徑在大腸桿菌中 的重構(gòu)
[0082] 將質(zhì)粒 pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA-aroE-aroD_aroB 和 pTrc-AR010 或者 pTrc-AR010-UGT73B6用化學轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株Λ A，所述轉(zhuǎn)化方法具體為：取 100 μ 1感受態(tài)大腸桿菌菌株Λ A細胞于冰上，10分鐘后加入2 μ 1質(zhì)粒pBbA5c-tyrA*-aro G*-ppsA-tktA-aroE-aroD-aroB 和 1 μ 1 質(zhì)粒 pTrc-AROlO 或者 pTrc-AR010-UGT73B6,輕輕 混勻，冰上放置30分鐘后，42°C熱激90秒，取出立即于冰上放置2分鐘，加入600 μ I LB液 體培養(yǎng)基，37°C，150rpm搖床復蘇培養(yǎng)30分鐘，然后將菌液涂布在含氯霉素和氨芐青霉素 的LB平板上。利用氯霉素和氨芐青霉素抗性篩選同時攜帶兩種表達載體的轉(zhuǎn)化菌株Λ A (AR010)和（AR010和UGT73B6)，并通過提取質(zhì)粒進行酶切驗證，得到酪醇高產(chǎn)途徑的大腸 桿菌表達菌株Λ A (AR010)，以及紅景天苷及淫羊藿次苷D2生物合成途徑的大腸桿菌表達 菌株ΛΑ (AR010 和 UGT73B6)(保藏編號為 CGMCC No. 8897)。
[0083] 實施例3
[0084] 本實施例大腸桿菌表達菌株厶4(八1?010)和厶4(41?010和呢了7386)的發(fā)酵培養(yǎng)
[0085] 將菌株Λ A (AR010)和Λ A (AR010 和 UGT73B6)分別在 2mL 加入有 25mg/L 氯霉 素和100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12小時，得到種子液。
[0086] 然后將種子液將1體積％的轉(zhuǎn)接量（0. 5mL)分別轉(zhuǎn)接入50mL加入有25mg/L氯霉 素和100mg/L氨芐青霉素的M9Y液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)，當0D600約為0. 6時加入終濃度 為0.1 mM的IPTG進行誘導，30°C繼續(xù)培養(yǎng)48個小時。分別得到表達有酪醇的發(fā)酵液1，和 表達有紅景天苷及淫羊藿次苷D2的發(fā)酵液2。
[0087] 對比例1
[0088] 本對比例用于說明現(xiàn)有技術(shù)的使用微生物生物合成酪醇
[0089] 按照申請?zhí)?01310133238. 7的專利申請中的方法構(gòu)建大腸桿菌表達菌株，并使 用實施例3中的條件進行發(fā)酵，得到發(fā)酵液Dl。
[0090] 對比例2
[0091] 本對比例用于說明參比的使用微生物生物合成酪醇及紅景天苷及淫羊