ptulosonate_7-phosphat e (DAHP)合酶基因 aroG (GenBank :U00096. 3 (1，386, 720. · 1，388, 261))、磷酸烯醇式 丙酮酸合酶基因 PPsA (GenBank :U00096. 3 (1，784, 734. · 1，787, 112))、轉(zhuǎn)酮醇酶 A 基 因 tktA (GenBank :U00096. 3 (3, 079, 644…3, 081，635) )、3_ 脫氫奎尼酸合成酶基因 aroB (GenBank :U00096. 3 (3, 517, 398. · 3, 518, 486) )、3_ 脫氫奎尼酸脫水酶基因 aroD (GenBank :U00096. 3 (1，774, 686. · 1，775, 444))及脫氫莽草酸還原酶 aroE (GenBank : U00096. 3(3, 430, 020. .3, 430, 838))。其中，如 SEQ ID No :1 所示的 tyrA* 基因由 tyrA 基 因進行定點突變獲得，如SEQ ID No :2所示的aroG*基因由aroG基因進行定點突變獲得。 進行點突變的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，在此不再贅述。
[0029] 本發(fā)明中，基因 AR010為由酪氨酸合成酪醇過程中的相關(guān)基因，可以來自酵母， 基因 UGT73B6為由酪醇合成紅景天苷及淫羊藿次苷D2過程中的相關(guān)基因，可以來自紅景 天植物。優(yōu)選地，AR010和UGT73B6分別為來自釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) 的苯丙酮酸脫羧酶基因 ScAROlO (GenBank :GeneID:851987)和來自紅景天（Rhodiola sachalinensis)的 UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 RsUGT73B6 (GenBank:AY547304)。優(yōu)選的，為了 提高UGT73B6的表達(dá)量，還可以其進行大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化，優(yōu)化后的UGT73B6基因 的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示。
[0030] 本發(fā)明中，需要說明的是，所述大腸桿菌表達(dá)菌株不表達(dá)feaB, tyrR, pykA, pykF, pheA 基因，含有并能夠表達(dá) tyrA*，aroG*，ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE，AR010,或者含有 并能夠表達(dá) tyrA*，aroG*，ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE，AROlO 和 UGT73B6,是指使大腸桿 菌染色體上的feaB, tyrR, pykA, pykF, pheA基因不表達(dá)；同時，在發(fā)酵培養(yǎng)時，上述tyrA*， aroG*，ppsA，tktA，aroB, aroD, aroE, AR010和UGT73B6等基因能被翻譯為相應(yīng)的蛋白，并 使相應(yīng)蛋白發(fā)揮其作用。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明，使大腸桿菌染色體上的feaB, tyrR, pykA, pykF, pheA基因不表達(dá)的 方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，例如，可以通過基因敲除的方法進行，也可以通過基因沉默 的方法進行。本發(fā)明優(yōu)選通過基因敲除的方法進行。
[0032] 本發(fā)明中，對基因敲除的方法沒有特殊要求，可以為能夠在大腸桿菌中進行基因 敲除的各種方法，如利用λ Red基因敲除系統(tǒng)對feaB, tyrR, pykA, pykF, pheA基因進行敲 除，得到大腸桿菌菌株ΛΑ，并用含有基因 tyrA*，aroG*，ppsA，tktA，aroB, aroD, aroE和 AR010,優(yōu)選含有基因 tyrA*，aroG*，ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE，AROlO 和 UGT73B6 的表 達(dá)載體對大腸桿菌菌株Λ A進行轉(zhuǎn)化得到所述大腸桿菌表達(dá)菌體。
[0033] 本發(fā)明中，對表達(dá)載體的種類沒有特殊要求，可以為能夠在大腸桿菌中表達(dá)目的 基因的本領(lǐng)域常用的各種表達(dá)載體，例如質(zhì)粒等。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，表達(dá)載 體的構(gòu)建方法可以采用本領(lǐng)域常用的各種方法，如將目的基因經(jīng)過酶切處理后連接至載體 中，在此不再贅述。
[0034] 本發(fā)明中的表達(dá)載體優(yōu)選為大腸桿菌表達(dá)載體Vl和大腸桿菌表達(dá)載體V2,大腸 桿菌表達(dá)載體Vl優(yōu)選含有基因 tyrA*，aroG*，ppsA，tktA，aroB，aroD和aroE，大腸桿菌表 達(dá)載體V2優(yōu)選含有基因 AR010,更優(yōu)選含有基因 AROlO和UGT73B6。
[0035] 本發(fā)明中，對上述導(dǎo)入大腸桿菌中的基因的排列順序沒有特別的限制，只要能夠 進行有效地表達(dá)即可。優(yōu)選的，大腸桿菌表達(dá)載體Vl為pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA-aroE-aroD-aroB，該載體的制備方法優(yōu)選包括以下步驟：
[0036] (a)以引物 MCS-5FPBgl/MCS_3RPNhe 為引導(dǎo)，以質(zhì)粒 pACYCDuet-Ι 為模板進行 PCR 擴增反應(yīng)，得到帶有Bgl II，PstI，NotI，Afl II，PacI和NheI多克隆位點的基因片段，擴增 產(chǎn)物經(jīng)Bgl II和NheI酶切后連入經(jīng)Bgl II和NheI酶切的質(zhì)粒pBbA5c-MevT (CO) -MBIS中， 得到質(zhì)粒pBbA5c-MCS ;
[0037] (b)以引物 Ptet-tyrA_5FPPst/tyrA_3RPPst 為引導(dǎo)，以核苷酸序列 SEQ ID No : 1所示帶有點突變的tyrA*基因為模板進行PCR擴增反應(yīng)，得到帶有tet啟動子的tyrA* 基因片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)PstI酶切后連入經(jīng)PstI酶切的質(zhì)粒pBbA5c-MCS中，得到質(zhì)粒 pBbA5c_tyrA* ;
[0038] (c)以引物aroG-5FPPst/aroG-3RPNot為引導(dǎo)，以核苷酸序列SEQ ID No :2所示 帶有點突變的aroG*基因為模板進行PCR擴增反應(yīng)，擴增產(chǎn)物經(jīng)PstI和NotI酶切后連入 經(jīng)PstI和NotI酶切的質(zhì)粒pBbA5c_tyrA*中，構(gòu)建得到質(zhì)粒pBbA5c_tyrA*-aroG* ;
[0039] (d)以引物ppsA-5FPNot/ppsA-3RPAfl為引導(dǎo)，以大腸桿菌MG1655基因組DNA為 模板進行PCR擴增反應(yīng)，得到ppsA基因，經(jīng)NotI和Afl II酶切后連入經(jīng)NotI和Afl II酶 切的質(zhì)粒 pBbA5c_tyrA*-aroG* 中，構(gòu)建得到質(zhì)粒 pBbA5c_tyrA*-aroG*-ppsA ;
[0040] (e)以引物tktA-5FPBgl/tktA-3RPPac為引導(dǎo)，以大腸桿菌MG1655基因組 DNA為模板進行PCR擴增反應(yīng)，得到tktA基因，經(jīng)Bgl II和PacI酶切后連入經(jīng)Bgl II 和PacI酶切的質(zhì)粒pBbA5c-MCS中，構(gòu)建得到質(zhì)粒pBbA5c-tktA ;再以該質(zhì)粒為模板， 以引物Plac-tktA-5FPAfl/tktA-3RPPac為引導(dǎo)，擴增得到帶有啟動子PlacUV5的 tktA基因片段Plac-tktA，經(jīng)Afl II和PacI酶切后連入經(jīng)Afl II和PacI酶切的質(zhì)粒 pBbA5c-tyrA*_aroG*-ppsA 中，得到質(zhì)粒 pBbA5c-tyrA*_aroG*-ppsA-tktA ;
[0041] (f)以引物aroE-5FPPac/aroE-3RPNhe為引導(dǎo)，以大腸桿菌MG1655基因組DNA為 模板進行PCR擴增反應(yīng)，得到aroE基因，經(jīng)PacI和NheI酶切后連入經(jīng)PacI和NheI酶切 的質(zhì)粒 pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA_tktA 中，得到質(zhì)粒 pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA_ar oE ；
[0042] (g)以引物aroD-5FPBam/aroD-3RPPst為引導(dǎo)，以大腸桿菌MG1655基因組DNA為 模板進行PCR擴增反應(yīng)，得到aroD基因，經(jīng)BamHI和PstI酶切后連入經(jīng)Bgl II和PstI酶 切的質(zhì)粒 pBbA5c-MCS 中，構(gòu)建得到質(zhì)粒 pBbA5c-aroD ;以引物 aroB-5FPPst/aroB-3RPNhe 為引導(dǎo)，以大腸桿菌MG1655基因組DNA為模板進行PCR擴增反應(yīng)，得到aroB基因，經(jīng) PstI和NheI酶切后連入經(jīng)PstI和NheI酶切的質(zhì)粒pBbA5c-aroD中，構(gòu)建得到質(zhì)粒 pBbA5c-aroD_aroB ;再以該質(zhì)粒為模板，以引物Plac-5FPNhe/aroD_3RPNhe為引導(dǎo)，擴增得 到帶有啟動子PlacUV5的aroD-aroB基因片段Plac-aroD-aroB，經(jīng)NheI酶切后連入經(jīng)NheI 酶切的質(zhì)粒pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA_aroE中，得到大腸桿菌表達(dá)載體pBbA5c_tyr A氺_aroG氺_ppsA_tktA_aroE_aroD_aroB〇
[0043] 本發(fā)明中，大腸桿菌表達(dá)載體V2優(yōu)選為pTrc-AROlO基因，更優(yōu)選含 pTrc-AR010-UGT73B6。制備方法優(yōu)選包括以下步驟：
[0044] (a)以引物 ar〇-5FPNco/aro_3RPSac 為引導(dǎo)，以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)S288C的基因組DNA為模板進行PCR，擴增得到AROlO的0RF，擴增產(chǎn)物經(jīng)NcoI 和SacI酶切后連入經(jīng)NcoI和SacI酶切的質(zhì)粒pTrcHisB中，構(gòu)建得到質(zhì)粒pTrc-AROlO ;
[0045] (b)在優(yōu)選的情況下，以引物UGT-5FPNco/UGT-3RPBam為引導(dǎo)，優(yōu)選以經(jīng)密碼子 優(yōu)選的UGT73B6基因為模板進行PCR擴增反應(yīng)，擴增片段經(jīng)NcoI和BamHI酶切后連入經(jīng) NcoI和BamHI酶切的質(zhì)粒pTrcHisB中，構(gòu)建得到質(zhì)粒pTrc-UGT73B6 ;再以該質(zhì)粒為模板， 以引物TrcUGT-5FPBgl/UGT-3RPBam為引導(dǎo)，擴增得到帶有啟動子Ptrc的UGT73B6基因片 段Ptrc-UGT73B6,經(jīng)Bgl II和BamHI酶切后連入經(jīng)Bgl II酶切的質(zhì)粒pTrc-AROlO中，得到 質(zhì)粒 pTrc-AR010-UGT73B6。
[0046] 在以上載體的制備中使用的引物的序列如表1所示。
[0047] 將所述載體 pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA-aroE-aroD-arciB 和 pTrc-AROlO 轉(zhuǎn) 化大腸桿菌菌株Λ A，得到高產(chǎn)酪醇的大腸桿菌表達(dá)菌株Λ A(AROlO);將所述載體pBbA5c-tyrA*-aroG*-ppsA-tktA-aroE-aroD_aroB 和 pTrc-AR010_UGT73B6 轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Λ A， 得到高產(chǎn)紅景天苷的大腸桿菌表達(dá)菌株Λ A (AROlO和UGT73B6)。大腸桿菌表達(dá)菌株Λ A (AR010和UGT73B6)通過調(diào)控從葡萄糖到酪氨酸的代謝流，進行酪醇的高量表達(dá)，然后表達(dá) 經(jīng)過密碼子優(yōu)化的來自紅景天的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73B6,異源合成紅景天苷及淫羊藿次苷D2 (如圖1所示)。
[0048] 優(yōu)選地，本發(fā)明中，所述大腸桿菌表達(dá)菌株優(yōu)選為Λ A (AROlO)和Λ A (AR010和 UGT73B6)。
[0049] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，大腸桿菌與植物等在表達(dá)蛋白質(zhì)時，都表現(xiàn)有不 同程度的密碼子偏愛性。將來自植物紅景天的糖基轉(zhuǎn)移酶基因進行密碼子優(yōu)化，可以使目 標(biāo)蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中更有效地表達(dá)。所述密碼子優(yōu)化的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所 公知，在此不再贅述。
[0050] 本發(fā)