帶有Am抗性的MS平板上， 2-3天后長出單克隆，經(jīng)過對部分單克隆PCR驗證，凡是只能擴增出單一的I. 5kb大小的而 不能擴增出野生型（一般五六百個堿基）條帶的即為發(fā)生雙交換置換的突變株。經(jīng)過不斷 的松弛培養(yǎng)和涂板PCR驗證最終獲得完全發(fā)生雙交換的基因置換突變株。（圖7)
[0231] (二）同框缺失突變株的獲得
[0232] 該方法與上述中基因置換突變株的方法大部分是一樣的，開始的同源臂PCR時， 必須以帶有Am抗性的LoxP質(zhì)粒為模板進行擴增，引物與方法（一）中的一樣，均為59bp 包含有39bp同源臂序列的基因片段。同樣的方法獲得基因置換黏粒，最終接合轉(zhuǎn)移獲得帶 有抗性基因的基因置換突變株后，還需要再發(fā)生一次接合轉(zhuǎn)移，利用導入含有Cre基因的 質(zhì)粒于鏈霉菌中，通過抗性基因 Tsr (硫鏈絲菌素）來篩選接合轉(zhuǎn)移平板的接合子，最終在 無抗的TSB松弛下丟掉trs抗性，并通過PCR驗證獲得基因型正確的同框敲除突變株（該 突變株P(guān)CR擴增出的條帶遠小于野生型的大小通常為200-400bp)。其中的原理是因為Cre 基因編碼的蛋白識別Loxp位點,利用Loxp自身的同源重組從而將其中間的Marker序列缺 失，從而獲得同框缺失突變株。（圖7)
[0233] 實施例 7 鏈霉菌 Streptomyces bottropensis D0-45 產(chǎn)量的提高：
[0234] 之前文獻[The Jounal of Antibiotics. 1981，1520]報道三欣卡辛的產(chǎn)量 l-2mg/ L，利用文獻報道的種子（每100ml:玉米汁0· 5g，蔗糖2g，果糖lg，葡萄糖lg。K2HPO4O. 15g， MgSO40.0 5g，CaC032g，KCKX 4g。ρΗ=7· 0)培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基（每100ml:可溶性淀粉6g， 玉米汁lg，微量元素）發(fā)酵后（表2)(表3)，發(fā)現(xiàn)三欣卡辛的產(chǎn)量不太穩(wěn)定，而且產(chǎn)量也不 商。
[0235] 為了獲得一種穩(wěn)定的發(fā)酵條件同時提高三欣卡辛的產(chǎn)量，改動原有發(fā)酵培養(yǎng)基的 配方為SYG培養(yǎng)基（每100ml:可溶性淀粉6g，葡萄糖lg，酵母提取物lg，微量元素 （CuSO 4 · 5H207mg，F(xiàn)eSO4 · 7H201mg，MnCl2 · 4Η200· 8mg，ZnSO4 · 7Η200· 2mg，CoCl2 · 7Η200· 0006mg))，種 子培養(yǎng)基則改為普通的TSB培養(yǎng)基；同時最關(guān)鍵的是嘗試在發(fā)酵時加入了大孔樹脂HP20， 并摸索了 HP20的加入時間和加入量。最終確定了在剛開始發(fā)酵時便加入質(zhì)量比為50%的 HP205g每100mL (表3-2)，發(fā)酵五天時間即可收菌，經(jīng)過進一步柱純化最終分離得到三欣卡 辛A純品約500mg/L，產(chǎn)量提高了近400倍。（圖4，圖5)
[0236] 表2發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量兀素
[0237]
[0238] 表3-1:原有液體培養(yǎng)基
[0239]
[0240] 表3-2 :改進后液體培養(yǎng)基
[0241]
[0242] 圖6顯示了本實施例中，改變配方后加入大孔樹脂HP20,三欣卡辛產(chǎn)生量的提高。 表格為HP20在發(fā)酵時加入的時間，" + "代表產(chǎn)量高低，越多則產(chǎn)量越高。由上到下依次為 未加 HP20,初始加入HP20,第三天加入HP20,發(fā)酵后加入HP20的發(fā)酵液HPLC圖，明顯可以 看出發(fā)酵初始時加入HP20產(chǎn)量最高。
[0243] 實施例8鏈霉菌Streptomyces bottropensis D0-45基因敲除突變株的發(fā)酵和產(chǎn) 物鑒定：
[0244] (1)突變株的發(fā)酵
[0245] 接種基因型正確的孢子20ul到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基TSB (250mL搖瓶）中30°C，250rpm 培養(yǎng)至呈對數(shù)生長期（36hr)。接種2. 5mL至50mL發(fā)酵培養(yǎng)基SYG (可溶性淀粉6g，葡萄糖 lg，酵母提取物 lg，CuSO4 · 5H207mg，F(xiàn)eSO4 · 7H201mg, MnCl2 · 4Η200· 8mg，ZnSO4 · 7Η200· 2mg， CoCl2 · 7H200. 0006mg) (%)中，再加入滅過菌的大孔樹脂HP20(質(zhì)量比為50%)的2ml，在 30°C，220rpm條件下培養(yǎng)5天。離心收集沉淀，用丙酮分兩次浸泡，并超聲IOmin,離心去沉 淀后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋去上清中丙酮，水相用乙酸乙酯萃取三到五次，有機相用飽和食鹽水洗 兩次后旋去乙酸乙酯，用少量甲醇溶解。取20 μ L稀釋到Iml甲醇中做HPLC。
[0246] 各突變株以及野生型均采用相同的方法進行發(fā)酵和發(fā)酵液的處理。如果要分離突 變株產(chǎn)生的化合物，則需要將發(fā)酵量擴大至1-4升，擴大的方法是增加發(fā)酵搖瓶的數(shù)量；菌 體培養(yǎng)方法和發(fā)酵液處理方法與前面相同。
[0247] (2)突變株發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定
[0248] 高效液相色譜（HPLC)分析
[0249] 將突變株的發(fā)酵提取液與野生型菌株的發(fā)酵提取液分別用HPLC檢測，通過對比 檢測結(jié)果確定突變株是否產(chǎn)生新的化合物。具體做法是將發(fā)酵液提取物溶于甲醇中，取 20 μ 1進樣，A相為水（含0· 1%甲酸），B相為乙腈（含0· 1%甲酸）。流速=lmL/min，紫外 271nm處檢測，柱子為NUCLE0SIL100-5C18,儀器為安捷倫1260。洗脫梯度如下：
[0250]
[0251] 液相-質(zhì)譜連用（LC-MS)與核磁共振（NMR)分析：
[0252] 若HPLC分析發(fā)現(xiàn)突變株能夠產(chǎn)生新化合物，可以進一步將突變株的發(fā)酵提取液 用LC-MS檢測新化合物的分子量和部分結(jié)構(gòu)信息，再通過大量發(fā)酵分離純化化合物進行 NMR分析，得到化合物完整的結(jié)構(gòu)信息。（圖8,圖9)
[0253] 驗證正確的基因敲除突變株與野生型同時進行發(fā)酵，發(fā)酵之后的提取液用HPLC 檢測。HPLC結(jié)果能夠反映基因的敲除是否對三欣卡辛的產(chǎn)生造成影響，以及基因敲除突變 株中是否有新化合物出現(xiàn)。WT :三欣卡辛產(chǎn)生菌野生型；
[0254] 圖8-1 :敲除基因 txnO,產(chǎn)生突變株為mZM-0-1/2。該基因敲除后野生型的產(chǎn)量顯 著下降，所以該邊界基因與三欣卡辛生物合成基因簇相關(guān)。
[0255] 圖8-2 :敲除基因 txn5,產(chǎn)生突變株為mZM-5-1/2。該基因缺失后沒有完全中斷三 欣卡辛的產(chǎn)生，只是產(chǎn)量有所下降。
[0256] 圖8-3 :敲除基因 txnl4,產(chǎn)生突變株為mZM-14。該基因缺失后完全中斷三欣卡辛 的產(chǎn)生。
[0257] 圖8-4 :敲除基因 txnl2,產(chǎn)生突變株為mZM-12-1/2。該基因缺失后并不影響三欣 卡辛的生物合成，且產(chǎn)量沒有太大的變化。
[0258] 圖8-5 :敲除基因 txnl9,產(chǎn)生突變株為mZM-19-1/2。該基因敲除后不再產(chǎn)生三欣 卡辛，且有新化合物產(chǎn)生，但量很低，還在分離中。
[0259] 圖8-6:敲除基因 txn20,產(chǎn)生突變株為mZM-20-1/2。該基因缺失后沒有中斷三欣 卡辛的生物合成，產(chǎn)量略有降低。
[0260] 圖8-7 :敲除基因 txn-22,產(chǎn)生突變株為mZM-22-1/2。該基因敲除不影響三欣卡 辛的產(chǎn)生，且沒發(fā)現(xiàn)明顯的新峰出現(xiàn)。
[0261] 圖8-8 :敲除基因 txn-23,產(chǎn)生突變株為mZM-23-1/2。該基因敲除也未發(fā)現(xiàn)有新 峰出現(xiàn)，且未影響三欣卡辛的生物合成。
[0262] 圖8-9 :敲除基因 txn-25,產(chǎn)生突變株為mZM-25-1/2。該基因敲除未中斷三欣卡 辛的合成，但其產(chǎn)量大大降低，且有新峰出現(xiàn)經(jīng)分離純化為色素的增加。
[0263] 圖8-10 :敲除基因 txn-26,產(chǎn)生突變株為mZM-26-1/2。該基因缺失后，完全中斷 野生型產(chǎn)生，發(fā)酵后色素很明顯，非常紅，HPLC顯示有新化合物產(chǎn)生，但是峰型很雜，量都很 低，有待大量發(fā)酵分離。
[0264] 圖8-11 :敲除基因 txn30,產(chǎn)生突變株為mZM-30-1/2。該基因缺失后，完全中斷野 生型產(chǎn)生，HPLC顯示有新化合物產(chǎn)生，且從基因型分析應該是與糖基合成相關(guān)的化合物，產(chǎn) 量挺高，有待大量發(fā)酵分離純化。
[0265] 圖8-12 :敲除基因 txn35,產(chǎn)生突變株為mZM-35-1/2。該基因缺失后，完全中斷野 生型產(chǎn)生，HPLC顯示有新化合物產(chǎn)生，但產(chǎn)量非常低，為分離純化帶來很大困難。
[0266] 圖8-13 :敲除基因 txn42,產(chǎn)生突變株為mZM-42-1/2。該基因缺失后，基本上不影 響三欣卡辛AD的產(chǎn)生，HPLC顯示也無化合物產(chǎn)生。
[0267] 實施例9產(chǎn)生新化合物的突變株的獲得
[0268] 目前已經(jīng)確定產(chǎn)新穎結(jié)構(gòu)化合物的突變株包括有mZM-5,mZM-21，mZM-41，mZM-44， mZM-49, mZM-52,這其中前四個突變株分別為帶有Marker的雙交換突變株，構(gòu)建的方法也 是采用實施例6中的方法（一），最終經(jīng)過PCR驗證正確的基因型后，與野生型對比發(fā)酵，在 HPLC圖上發(fā)現(xiàn)有新的化合物峰出現(xiàn)。（圖7)后兩個則是采用實施例6中的方法（二），最 終拿到了不帶Marker的同框敲除突變株，同樣經(jīng)過PCR驗證后與野生型對比發(fā)酵，在HPLC 圖上發(fā)現(xiàn)有新的化合物峰出現(xiàn)。
[0269] 實施例10新化合物的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定
[0270] 通過大量發(fā)酵（1L-4L不等）突變株，最終分離純化到七個具有新穎結(jié)構(gòu)的化合 物，分別是 Txn-5-l，Txn-5-2, Txn-21，Txn-41，Txn-44, Txn-49, Txn-52。（圖 9)
[0271] 圖9-1 :Α.敲除基因 txn4,產(chǎn)生突變株為mZM-4-1/2,分離純化得新化合物 Txn-4-l，Txn-4-2 ;B. LC-MS-Txn-4-l/Txn-4-2 ;C:NMR-Txn-4-l/Txn-4-2 ;解析出 Txn-4-l、 Txn-4-2結(jié)構(gòu)如下。
[0272]
[0273] 圖9-2 :Α.敲除基因 txn21，產(chǎn)生突變株為mZM-21，分離純化得新化合物Τχη-21， 與野生型對比HPLC圖；Β:Τχη-21的MS數(shù)據(jù)；C:NMR-Txn-21/WT (新化合物與野生型的對比 圖）及化合物的二維譜圖；解析出Txn-21結(jié)構(gòu)如下所示。
[0274]
[0275] 圖9-3 :Α.敲除基因 txn41，產(chǎn)生突變株為mZM-41，分離純化得新化合物Τχη-41， 與野生型對比HPLC圖；Β:Τχη-41的MS數(shù)據(jù)；C :Τχη-41的核磁數(shù)據(jù)；綜合上述數(shù)據(jù)，解析 出Τχη-41的結(jié)構(gòu)為
[0276] 圖9-4 :Α.敲除基因 txn 44,產(chǎn)生突變株為mZM-44,分離純化得新化合物Τχη-44， 與野生型對比HPLC圖；Β: Τχη-44的MS數(shù)據(jù)；C: Τχη-44的核磁數(shù)據(jù)（包括一維和二維譜
圖）；綜合上述數(shù)據(jù)，解析出Txn-44 j
[0277] 圖9-5 :A.敲除基因 txn 49,產(chǎn)生突變株為mZM-49,分離純化得新化合物Txn-49， 與野生型對比HPLC圖；Β: Τχη-49的MS數(shù)據(jù)；C: Τχη-49與野生型對比的核磁數(shù)據(jù)（HNMR); 根據(jù)所有譜圖分析，我們推出該化合物結(jié)構(gòu)如下式所示，相比野生型在2號糖邊鏈少了一 個乙酰基的化合物：
[0278] 圖9-6 :Α.敲除基因 txn 52,產(chǎn)生突變株為mZM-52,分離純化得新化合物Τχη-52， 與野生型對比HPLC圖；Β: Τχη-52的MS數(shù)據(jù)；C: Τχη-52的核磁數(shù)據(jù)（包括一維和二維譜 圖）；解析出Txn-52結(jié)構(gòu)f
[0279] 其中化合物Txn-5-1，Txn-5-2,在發(fā)酵突變株mZM-5-升后，通過丙酮浸泡，乙酸 乙酯萃取等粗處理后，最終通過硅膠柱的純化分離，以及凝膠柱的進一步純化，共獲得分別 為10mg，5mg的純品，最終通過LC-MS及HNMR的譜圖驗證其結(jié)構(gòu)的正確性。（圖9-1)
[0280] 其中化合物Txn-21，在發(fā)酵突變株mZM-21兩升后，通過丙酮浸泡，乙酸乙酯萃取 等粗處理后，最終通過硅膠柱的純化分離，以及凝膠柱的進一步純化，共獲得分別為60mg 的純品，最終通過LC-MS及HNMR的譜圖驗證其結(jié)構(gòu)的正確性。（圖9-2)
[0281] 其中化合物Txn-41，在發(fā)酵突變株mZM-41兩升后，通過丙酮浸泡，乙酸乙酯萃取 等粗處理后，最終通過硅膠柱的純化分離，以及凝膠柱的進一步純化，共獲得分別為20mg 的純品，最終通過LC-MS及HNMR的譜圖驗證其結(jié)構(gòu)的正確性。（圖9-3)
[0282] 其中化合物Txn-44,在發(fā)酵突變株mZM-44兩升后，通過丙酮浸泡，乙酸乙酯萃取 等粗處理后，最終通過硅膠柱的純化分離，以及凝膠柱的進一步純化，共獲得分別為15mg 的純品，最終通過LC-MS及HNMR的譜圖驗證其結(jié)構(gòu)的正確性。（圖9-4)
[0283] 其中化合物Txn-49,在發(fā)酵突變株mZM-49 -升后，通過丙酮浸泡，乙酸乙酯萃取 等粗處理后，最終通過硅膠柱的純化分離，以及凝膠柱的進一步純化，共獲得分別為45mg 的純品，最終通過LC-MS及HNMR的譜圖驗證其結(jié)構(gòu)的正確性。（圖9-5)
[0284] 其中化合物Txn-52,在發(fā)酵突變株mZM-52四升后，通過丙酮浸泡，乙酸乙酯萃取