松墨天牛超氣門蛋白基因全長序列及其克隆方法
【專利摘要】松墨天牛超氣門蛋白基因全長序列及其克隆方法，涉及生物基因工程領域。所述克隆方法：提取松墨天牛成蟲總RNA，采取3′RACE擴增獲得基因3′端序列，與構建的cDNA文庫松墨天牛超氣門蛋白基因不含3′端、5′端片段序列拼接獲得基因含3′端序列；再在此基礎上進行5′RACE擴增獲得基因5′端序列，與上述松墨天牛超氣門蛋白基因含3′端片段序列拼接獲得基因全長序列。該基因序列全長1582bp，基因開放閱讀框為187?1341bp，共編碼407個氨基酸。本發(fā)明填補了松墨天牛超氣門蛋白基因的空白，為解析松墨天牛蛻皮及變態(tài)發(fā)育的機制提供理論依據，并可望為以蛻皮激素受體為靶標的新型殺蟲劑提供前期理論基礎，對預防松材線蟲萎蔫病的傳播提供了有利支持。本發(fā)明由國家自然科學基金(31470653)和廣東省自然科學基金(1414050001666)支持。
【專利說明】
松墨天牛超氣門蛋白基因全長序列及其克隆方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學中基因克隆領域，具體地說，是涉及一種松墨天牛超氣門 蛋白基因全長序列及其克隆方法。 技術背景
[0002] 超氣門蛋白（ultraspiracle，USP)隸屬于昆蟲核受體(nuclear receptor，NR)，一 般含有4個模塊結構域:A/B域、C域、D域和E域。其中C域(DNA結合域，DNA binding domain， DBD)及E域(配體結合域，ligand binding domain，LBD)相對保守，(3域含有兩個鋅脂結構。 通過X射線結晶法發(fā)現(xiàn)在E域存在一個配體結合袋，是與EcR形成異源二聚體的結合域。蛻皮 激素受體(ecdysone receptors，EcR)是蛻皮激素的作用靶標，是昆蟲體內重要的調控蛋 白，必須首先與超氣門蛋白（ultraspiracle protein，USP)形成異源二聚體，再激活或抑制 下游相關基因。
[0003] 松墨天牛(Monochamus alternatus)屬于鞘翅目，天?？?，是一種重要的針葉樹害 蟲，主要危害馬尾松、油松、黑松等樹干和枝條的韌皮部和木質部，嚴重影響松樹的生長，同 時也是松材線蟲萎蔫病的主要傳播媒介。松墨天牛超氣門蛋白基因尚無人研究，本發(fā)明填 補了這一空白，為解析松墨天牛蛻皮及變態(tài)發(fā)育的機制提供理論依據，并可望為以蛻皮激 素受體為靶標的新型殺蟲劑提供前期理論基礎。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供松墨天牛USP基因全長序列及其克隆方法。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術方案：
[0006] 1、總RNA的提取
[0007] 對松墨天牛成蟲活體樣品迅速用液氮冷凍，置于-70°c備用。用E.Z.N.A.TM Total RNA Kit II總RNA提取試劑盒提取松墨天牛成蟲總RNA。
[0008] 2、引物設計和3'RACE擴增
[0009] 根據本實驗構建的松墨天牛CDNA文庫，獲得了松墨天牛超氣門蛋白基因不含3' 端、5'端片段序列，本發(fā)明在此基礎上進行3'RACE擴增，以獲得墨天牛超氣門蛋白基因含3' 端序列。
[0010] 3'RACE擴增的特異性引物為：
[0011] Ma-USP-37-Outer：GGATAAGACGGAGTTGGGATG
[0012] Ma-USP-37-Inner：GATTCGCCAAACTGCTACTCC
[0013] 3、目的基因克隆及測序
[0014] 套式PCR產物經由1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的DNA片段，與pMD20-T載體 連接，將連接產物轉化E. co 1 i DH5a感受態(tài)細胞，進行AMP抗性藍白斑篩選，挑陽性菌落經菌 落PCR鑒定后將包含正確重組子的菌樣送生工生物測序。
[0015] 4、序列拼接
[0016] 將測序結果正確的序列與所構建的eDNA文庫中松墨天牛超氣門蛋白基因不含3' 端、5'端的片段序列拼接，獲得松墨天牛超氣門蛋白基因含3'端序列。
[0017] 5、引物設計和5'RACE擴增
[0018] 本發(fā)明在上述擴增出的松墨天牛超氣門蛋白基因含3'端序列的基礎上進行5' RACE擴增，以獲得松墨天牛超氣門蛋白基因全長序列。
[0019] 5'RACE擴增的特異性引物為：
[0020] Ma-USP-57-Gsp：TGGACCTGTGTGAGAAAGCGGCG
[0021] Ma-USP-57-NGsp：CACAGCCTCTCGCTTCATACCCAT
[0022] 6、目的基因克隆及測序
[0023] 降落PCR及巢式PCR產物經由1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的DNA片段，與 PMD20-T載體連接，將連接產物轉化E. co 1 i DH5a感受態(tài)細胞，進行AMP抗性藍白斑篩選，挑 選陽性菌落經菌落PCR鑒定后將包含正確重組子的菌樣送生工生物測序。
[0024] 7、序列拼接
[0025] 將測序結果正確的序列與上述擴增出的松墨天牛超氣門蛋白基因含3'端序列拼 接，獲得松墨天牛超氣門蛋白基因全長序列。
[0026] 松墨天牛超氣門蛋白基因全長序列，該序列如下：
[0027]
[0028] 序列中下劃線標示的atg為初始密碼子，下劃線標示的taa為終止密碼子。
[0029] 根據松墨天牛超氣門蛋白基因全長序列，得到其氨基酸序列。該序列如下：

[0032]本發(fā)明獲得了松墨天牛超氣門蛋白基因全長序列，填補了松墨天牛超氣門蛋白基 因的空白，為解析松墨天牛蛻皮及變態(tài)發(fā)育的機制提供理論依據，并可望為以蛻皮激素受 體為靶標的新型殺蟲劑提供前期理論基礎，對預防松材線蟲萎蔫病的傳播提供了有利支 持。通過對松墨天牛成蟲進行RNA提取、3'RACE擴增、5'RACE擴增、目的基因克隆及序列拼 接，獲得松墨天牛超氣門蛋白基因全長序列。該基因序列全長1582bp，開放閱讀框為187-1341bp，共編碼407個氨基酸。

【具體實施方式】
[0033]以下實施例將本發(fā)明進一步說明。
[0034] 1、松墨天牛總RNA提取
[0035]松墨天牛成蟲采自廣州市從化馬尾松林。成蟲活體經液氮急凍后保存在1.5mL離 心管中，置于-70 °C冰箱內保存?zhèn)溆谩?br>[0036] 用E.Z.N.A.TM Total RNA Kit II總RNA提取試劑盒提取松墨天牛成蟲總RNA，具 體方法如下：
[0037] 1)在經高溫高壓滅菌、紫外線滅菌、70%無水乙醇滅菌并經液氮充分預冷的研缽 中研磨成蟲樣品至粉末狀，取約0. lg懸浮狀樣放入經液氮充分預冷的1.5mL離心管中，待液 氮蒸發(fā)完后，加入lmL RNA-Solv Reagent。
[0038] 2)將樣品勻漿室溫放置2-3min，使得樣品完全裂解。
[0039] 3)加入200yL氯仿，劇烈震蕩15sec，冰上孵化10min;4°C下12000rpm離心15min，出 現(xiàn)上層水相。
[0040] 4)轉移80 %上層水相至新的1.5mL離心管，加入1/3無水乙醇，禍旋15sec，轉移全 部混合液至試劑盒提供的2mL Collecting tube，室溫下lOOOOrpm離心lmin。
[00411 5)將收集管中液體重新轉移至吸附柱中，室溫下lOOOOrpm離心lmin。
[0042] 6)將吸附柱放入新的2mL Collecting tube，加入300yL RNA wash Bufferl，室溫 下lOOOOrpm離心lmin，棄廢液。
[0043] 7)將吸附柱放回收集管中，加入400yL RNA wash Bufferl，室溫下lOOOOrpm離心 lmin，棄廢液。
[0044] 8)將吸附柱放回收集管中，加入500yL RNA wash Buffer2(事先加入48mL無水乙 醇稀釋），室溫下l〇〇〇〇rpm離心lmin，棄廢液。
[0045] 9)重復上一步驟后再室溫下13000rpm離心2min。
[0046] 10)將吸附柱放入干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央懸空加入40yL DEPC Water，室溫靜置2min，室溫下13000rpm離心lmin，將所得到的RNA溶液轉移到200yL PCR管， 從中吸取lyL進行紫外分光光度測定濃度和純度，吸取4yL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測 條帶是否清晰完整以判斷所提取的RNA有否降解，其余經檢驗合格的RNA溶液置于-70°C冰 箱保存?zhèn)溆谩?br>[0047] 注意事項：用于RNA實驗的試劑，需使用干熱滅菌（180°C，60min)或使用上述方法 進行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝，也可使用RNA實驗用的一次性塑料容器盛裝，使用 的無菌水用0.1 %的DEPC處理后再進行高溫高壓滅菌。RNA實驗使用的試劑盒無菌水都應專 用，避免混用后交叉污染。
[0048] 2、cDNA 3'末端擴增
[0049] 按照3'Full RACE Core Set Ver.2.0 kit試劑盒進行，具體操作步驟如下：
[0050] 1)反轉錄反應 [0051 ] 反應體系如下：
[0052] PCR 反應程序為:42Γ 反應 60min，7(TC 反應 15min。
[0053] 2)套式PCR擴增
[0054] a)0uter PCR擴增 反應體系如下：
[0055] PCR 反應程序為：94°C 預變性 3min，94°C30sec，55 °C 30sec，72 °C lmin，20 個循環(huán)，然 后72 °C延伸1 Omin。PCR產物用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。
[0056] b)Inner PCR擴增 反應體系如下：
[0057] PCR 反應程序為：94°C 預變性 3min，94°C30sec，55 °C 30sec，72 °C lmin，30 個循環(huán)，然 后72 °C延伸1 Omin。PCR產物用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。
[0058] 3、目的基因克隆及測序
[0059] 1)從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段
[0060] a)柱平衡步驟：向吸附柱CB2中加入500yL平衡液BL，室溫下，12000rpm離心lmin， 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0061 ] b)稱取一干凈1.5mL離心管重量，將單一目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠切下（盡量切 除多余部分)放入稱重的離心管中，稱取重量，計算膠塊重量。
[0062] c)向膠塊中加入等倍體積溶液PC(膠重0 . lg，體積約100yL)，50°C金屬浴加熱 lOmin左右，期間上下翻轉離心管，直至膠塊完全溶解。
[0063] d)將上一步所得溶液加入一個吸附柱CB2中，12000rpm離心lmin，棄廢液。
[0064] e)向吸附柱CB2中加入600yL漂洗液PW(使用前加入60mL無水乙醇稀釋），靜置2-5min，12000rpm 離心 lmin，棄廢液。
[0065] f)重復上一步驟。
[0066] g)再次12000rpm離心2min，將吸附柱置于室溫放置3-5min，徹底晾干。
[0067] h)將吸附柱CB2放入新1.5mL離心管(去蓋）中，向吸附膜中間位置懸空滴加30-50μ L洗脫緩沖液ΕΒ，室溫放置2min，12000rpm離心2min，收集DNA溶液至200yL PCR管，置于-20 °(：冰箱保存，用于后續(xù)試驗。
[0068] 2)T載體連接
[0069] PCR管中依次加入：pMD20-T Vector lyL、目標DNA片段產物3yL、Sterilized water lyL，加入5yL的Solution I至終體積10yL，4°C反應過夜。
[0070] 3)轉化感受態(tài)細胞
[0071] a)從-70°C冰箱取出感受態(tài)細胞放于冰上融化，并分裝到1.5mL離心管每管50yL。
[0072] b)每管中加入4yL T載體連接產物，緩慢混均。
[0073] c)冰上放置 45min。
[0074] d)置于42°C水浴鍋中，熱激45seC〇
[0075] e)立即將離心管插于冰上lmin。
[0076] f)在 37°C 下，160_225rpm 搖菌 lh。
[0077] g)將離心管中的菌液混勻，吸取30~50yL加到配好的平板培養(yǎng)基上，用無菌的三 角彎頭玻棒將菌液均勻涂開，用錫箱紙嚴實包裹后正面朝上放置2h，倒置平板，37°C，培養(yǎng) 12-16h〇
[0078] 4)陽性重組子的鑒定及測序
[0079] a)在1.5mL離心管中加入600yL含氨芐的培養(yǎng)液，挑選白色菌落放入培養(yǎng)液中，37 。(:下，160-225rpm 培養(yǎng) 3-4h。
[0080] b)菌落 PCR 反應體系如下：
[0081 ]反應條件為：94°(：預變性3111丨11;941€3〇86(3 ;551€3〇86。30個循環(huán)；72°(：1111丨11;72 1€ lOmin。反應結束后取4yL反應產物，進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0082] c)將包含正確重組子的克隆送至生工生物進行測序。
[0083] 4、將測序正確的序列除去重疊部分，與構建的cDNA文庫松墨天牛超氣門蛋白基因 不含3'端、5'端的片段序列拼接，獲得松墨天牛超氣門蛋白基因含3'端序列。
[0084] 5、cDNA 5'末端擴增
[0085] 按照SMARTer? RACE 5' Kit試劑盒進行，具體操作步驟如下：
[0086] 1)反轉錄反應
[0087] a)在一支200yL PCR管中加入5XFrist-Strand Buffer 4yL、DTT(100mM)0.5yL、 dNTPs (20mM) lyL，總體積為5.5yL，室溫下放置。
[0088] b)新的200yL PCR管中加入lyL S'-CDS Primer A、l-10yL RNA(RNA含量在 10ng-l yg)、0-9yL Sterik H20(與RNA含量之和為10yL)，總體積為IlyL，微型離心機離心數(shù)秒混 勻。
[0089] PCR反應條件：72Γ反應3min，42Γ反應2min，反應后離心4000rpm lOsec，加入lyL SMARTER II A Oligonucleotide，得到總體積為12yL的混合溶液。
[0090] c)在第一步的PCR管中加入0.5yL RNase Inhibitor(40UAxL)、2yL SMART Suribe Reverse Transcriptase(lOOU)，將總體積為8yL的混合溶液全部加入到上一步驟所得混合 溶液中，得到總體積為20yL的混合溶液，微型離心機離心數(shù)秒混勻。
[0091] PCR 反應條件：42 °C 反應 90min，70 °C 反應 1 Omin。
[0092] d)用Tricine-EDTA Buffer稀釋（總RNA<200ng，加 10yL;總RNA>200ng，加90yL; Poly A+RNA加240yL)，置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0093] 2)降落PCR擴增
[0094] a)在一支200yL PCR管中依次加入 15.5yL PCR Grade H20、25yL 2XSeq Amp Buffer，lyL Seq Amp DNA Polymerase，總體積41.5yL，微型離心機離心數(shù)秒混勾，不要產 生氣泡。
[0095] b)反應體系如下：
[0096]反應條件（5'Gsp引物Tm>70°C) :941€3〇86(3,721€3111丨11(擴增長度>3此，加111^11/ 1^)，5個重復；941€3〇86。，7〇1€3〇86。，72 1€3111丨11，5個重復；941€3〇86。，681€3〇86。，72 1€311^11 (擴增長度>3kb，加 lmin/kb)，25個重復。
[0097] c)取4yL反應產物，進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0098] 注意：須在Y Gsp特異性引物Y端加上15bp交疊區(qū)在載體和Y端'Gsps序列'： GATTACGCCAAGCTT〇
[0099] 3)巢式 PCR
[0100] a)降落PCR產物稀釋，取5yLPCR產物，加入245yL Tricine-EDTA Buffer。
[0101] b)在一支200yL PCR管中依次加入 15.5yL PCR Grade H20、25yL2XSeq Amp Buffer，lyL Seq Amp DNA Polymerase，總體積41.5yL，微型離心機離心數(shù)秒混勾，不要產 生氣泡。
[0102] c)反應體系如下：
[0103] 反應條件：941€3〇86(3,681€3〇86(3,721€3111丨11，20個重復。
[0104] d)取4yL反應產物，進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0105] 注意：須在Y NGsp特異性引物Y端加上15bp交疊區(qū)在載體和Y端'Gsps序列'： GATTACGCCAAGCTT〇
[0106] 6、目的基因克隆及測序
[0107] 1)PCR產物鑒定
[0108] 采用Nucelo Spin Gel and PCR Clean-Up Kit試劑盒回收目的DNA片段，具體操 作步驟如下：
[0109] a)稱取一干凈1.5mL離心管重量，將單一目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠切下（盡量切 除多余部分)放入稱重的離心管中，稱取重量，計算膠塊重量。
[0110] b)每 100mg膠加入200yL Buffer NT I。
[0111] c)置于50°C金屬浴中加熱5-10min，每隔2-3min翻轉離心管一次，直到膠完全溶 解。
[0112] d)將吸附柱放入收集管中，轉移樣品溶液至吸附柱中，13000rpm離心30sec，棄廢 液(單次操作不得大于700μυ。
[0113] e)加入700yL Buffer NT 3(事先加入24mL 96%-100%無水乙醇稀釋），13000rpm 離心30sec，棄廢液，再次13000rpm離心lmin，以完全除去Buffer NT 3。
[0114] f)將吸附柱放到新的1.5mL離心管（去蓋），向吸附膜中間位置懸空滴加15-30μ LBuffer ΝΕ，室溫下靜置lmin，13000rpm離心lmin，收集DNA溶液轉移到200yL PCR管，從中 吸取lyL進行紫外分光光度測定濃度和純度，其余經檢驗合格的DNA溶液置于-20°C冰箱保 存?zhèn)溆谩?br>[0115] 2)T載體連接
[0116] PCR管中依次加入：5 X Infusion HD Enzyme Premix 2yL、Lineareized PRACE vector lyL、DNA純化物7yL，總體積1 OyL，50 °C水浴熱激15min，冰上保存。
[0117] 3)轉化感受態(tài)細胞
[0118] a)從-70°C冰箱取出感受態(tài)細胞放于冰上融化，并分裝到1.5mL離心管每管50yL。
[0119] b)每管中加入4yL T載體連接產物，緩慢混均。
[0120] c)冰上孵化 30min。
[0121] d)置于42°C水浴鍋中，熱激60sec〇
[0122] e)立即將離心管插于冰上l-2min，加入S0C(事先置于37°C融化)446yL，定容至500 yL〇
[0123] f)在 37°C 下，160-225rpm 搖菌 lh。
[0124] g)將離心管中的菌液混勻，吸取100yL加到配好的平板培養(yǎng)基上，用無菌的三角彎 頭玻棒將菌液均勻涂開，用錫箱紙嚴實包裹后正面朝上放置2h，倒置平板，37°C，培養(yǎng)12-16h〇
[0125] 4)陽性重組子的鑒定及測序
[0126] a)在1.5mL離心管中加入600yL含氨芐的培養(yǎng)液，挑選白色菌落放入培養(yǎng)液中，37 。(:下，160-225rpm 培養(yǎng) 3-4h。
[0127] b)菌落 PCR 反應體系如下：
[0128] 反應條件為：94°(：預變性3111丨11;941€3〇86(3 ;551€3〇86。30個循環(huán)；72°(：1111丨11;72 1€ lOmin。反應結束后取4yL反應產物，進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0129] c)將包含正確重組子的克隆送至生工生物進行測序。
[0130] 7、將測序正確的序列除去重疊部分，與上述擴增出的松墨天牛超氣門蛋白基因含 3'端的片段序列拼接，獲得松墨天牛超氣門蛋白基因全長序列。
【主權項】
1. 一個松墨天牛超氣口蛋白基因全長序列，其特征在于該序列由1582個堿基對組成， 此全長序列為：序列中下劃線標示的atg為初始密碼子，下劃線標示的taa為終止密碼子，所獲得的松 墨天牛超氣口蛋白cDNA全長序列的編碼區(qū)從第187個核巧酸到1341個核巧酸。2.根據權利要求所述的松墨天牛超氣口蛋白基因核巧酸序列，其表達的蛋白為超氣口 蛋白，其特征在于，松墨天牛超氣口蛋白由407個氨基酸組成，其氨基酸序列為：3. 如權利要求1所述松墨天牛超氣口蛋白基因全長序列的克隆方法，其特征在于其具 體步驟如下： 提取松墨天牛成蟲總RNA，設計引物并進行y RACE擴增，將所獲得y端序列進行基因克 隆和測序，將測序正確的y端序列與構建的cDNA文庫松墨天牛超氣口蛋白基因無5/端序列 拼接，獲得松墨天牛超氣口蛋白基因含y端序列;再在此基礎上，設計引物并進行5/RACE擴 增，將所獲得5/端序列進行基因克隆和測序，將測序正確的5/端序列與經y RACE擴增得到 的松墨天牛超氣口蛋白基因含y端序列拼接，獲得松墨天牛超氣口蛋白基因全長序列。4. 如權利要求3所述松墨天牛超氣口蛋白基因全長序列的克隆方法，其特征在于所述 擴增的特異性引物為： Ma-USP-3^-Outer：GGAAATGGACACAGAGC Ma-USP-3^-Inner：TCTTCAGCACCAGCCAG Ma-USP-5^-Gsp：TGGACCTGTGTGAGAAAGCGGCG Ma-USP-5^-NGsp：CACAGCCTCTCGCTTCATACCCAT 〇
【文檔編號】C12N15/10GK105969776SQ201610239739
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月11日
【發(fā)明人】劉琪司, 陳敬祥, 林同, 蔡紫玲, 吳華俊, 程杰, 黃衛(wèi)東
【申請人】華南農業(yè)大學