專利名稱：建鯉GAPDH基因含內(nèi)含子的部分序列的克隆方法及其realtimePCR方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種建鯉管家基因GAPDH基因含內(nèi)含子的部分序列的克隆方法及其real time PCR方法。
背景技術(shù)：
在實(shí)時定量PCR(real time PCR)中，目標(biāo)基因的相對表達(dá)量是通過內(nèi)參基因的均一化來確定。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該是它的表達(dá)量在不同的組織中恒定，而且不受實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件的影響。大量的研究表明，目前還沒有通用的內(nèi)參基因符合這一條件，最好的選擇就是內(nèi)參基因表達(dá)量在自己所研究的樣品中變化較小。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)是糖酵解反應(yīng)中的一個酶，由 4 個30 40kDa的亞基組成，分子量146kDa。該基因幾乎在所有組織中都高水平表達(dá)，在同種細(xì)胞或者組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)量一般是恒定的，且不受含有的部分識別位點(diǎn)、佛波脂等誘導(dǎo)物質(zhì)的影響而保持恒定，故被廣泛用作real time PCR實(shí)驗(yàn)操作的管家基因。在用TriZoI提取的RNA樣品中，不可避免的會有少量的DNA殘留，反轉(zhuǎn)錄后，cDNA中還是含有DNA，而DNA同樣會作為模板和cDNA —起被擴(kuò)增，這必然會影響擴(kuò)增效率，從而影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了消除DNA的污染，通常需要將RNA樣品進(jìn)行DNAse酶處理，但這會增加樣品被染污的機(jī)率，同時也會減少RNA的得率，導(dǎo)致表達(dá)量很低的基因甚至無法檢測出。最直接的方法就是通過設(shè)計跨越內(nèi)含子的引物來消除DNA的污染，優(yōu)化反應(yīng)條件，使樣品中的大片段DNA不能被擴(kuò)增。建鯉(Cyprinuscarpio var. jian)是本中心培育出的遺傳性狀穩(wěn)定的鯉魚新品種，具有生長快、體型佳、肉質(zhì)好等優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)性狀，已遍及我國27個省。本研究通過克隆建鯉GAPDH含內(nèi)含子的部分序列，設(shè)計一對跨越內(nèi)含子的定量引物，建立基于SYBR GreenI染料技術(shù)的建鯉GAPDH real time PCR方法，從而為GAPDH作為內(nèi)參基因，在利用realtime PCR對建鯉功能基因的研究中提供有用的方法。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明目的之一在于克隆出建鯉GAPDH基因含內(nèi)含子的部分序列；本發(fā)明目的之二是基于獲得的序列，設(shè)計一對跨越內(nèi)含子的定量引物，建立基于SYBR GreenI染料技術(shù)的建鯉GAPDH real time PCR方法，從而為GAPDH作為內(nèi)參基因，在利用realtime PCR對建鯉功能基因的研究中提供有用的方法。技術(shù)方案基于現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種建鯉GAPDH基因含內(nèi)含子的部分序列的克隆方法，按照以下步驟實(shí)現(xiàn)建鯉血液基因組DNA提取，設(shè)計引物、PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)入載體，藍(lán)白斑篩選，質(zhì)粒測序；其中所設(shè)計的引物序列為正向CCGTTCATGCTATCACAGCTACACA
反向GGAAGCAGGATCTTACCATGTGAC用此方法克隆所得建鯉GAPDH基因含內(nèi)含子的部分序列如SEQ ID中No. I所述。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下95°C 3min、30循環(huán)(94°C30s,57°C 30s,72°C lmin)、72°C延長 8min，4°C度保存。本發(fā)明還提供一種real time PCR擴(kuò)增圖I中所示建鯉GAPDH基因含內(nèi)含子的部分序列的方法，按如下步驟實(shí)現(xiàn)抽提總RNA,以O(shè)igo dT Primer和Random 6 mers為引物進(jìn)行RT反應(yīng)，然后以此RT液為模板進(jìn)行real time PCR，熒光染料為SYBR Green I，其中real time PCR中的建鯉引物為跨越內(nèi)含子的定量引物，其序列為正向AGCTCAATGGCAAGCTTACTGG
反向GTGGATACCACCTGGTCCTCTG作文本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn),real time PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C 3min,然后40個循環(huán) 94°C 5sec，62°C 20sec，最后 72°C 3min，4°C保存。有益效果為檢驗(yàn)反應(yīng)的特異性，在real time PCR后進(jìn)行融解曲線分析，以確定得到的產(chǎn)物是否為目的產(chǎn)物。擴(kuò)增溫度以0. 2°C的增幅從65°C緩慢遞增到95°C，連續(xù)測定樣品的熒光強(qiáng)度以獲取融解曲線。結(jié)果見圖2，其Tm溫度為84. 8°C，只有一個特異峰，表明無引物二聚體以及非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，表明設(shè)計的一對跨越內(nèi)含子的引物特異性強(qiáng)，擴(kuò)增效率高，反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物中含有的DNA未被擴(kuò)增，消除了樣品中的DNA污染，real time PCR條件得到了較好的優(yōu)化。本發(fā)明通過克隆建鯉GAPDH含內(nèi)含子的部分序列，然后設(shè)計跨越內(nèi)含子的引物，優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)條件，來消除DNA的污染，從而增加了擴(kuò)增的效率。這樣，可為GAPDH作為內(nèi)參基因，在利用real time PCR對建鯉功能基因的研究中提供有用的方法。


圖I建鯉GAPDH基因含內(nèi)含子的部分序列，其中外顯子以大寫字母表示，內(nèi)含子以斜體小寫字母表示，定量PCR引物以下劃線表示圖2GAPDH溶解曲線
圖3GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I建鯉GAPDH基因含內(nèi)含子的部分序列的擴(kuò)增建鯉來自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興養(yǎng)殖基地，根據(jù)GenBank上公布的鯉GAPDH基因cDNA序列以及斑馬魚GAPDH基因的DNA序列設(shè)計一對引物，能擴(kuò)增建鯉GAPDH基因內(nèi)含子，見表I。表I擴(kuò)增建鯉GAPDH的引物
權(quán)利要求
1.一種建鯉GAPDH基因含內(nèi)含子的部分序列的克隆方法，按照以下步驟實(shí)現(xiàn)建鯉血液基因組DNA提取，設(shè)計引物、PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)入載體，藍(lán)白斑篩選，質(zhì)粒測序，其特征在于所設(shè)計的引物序列為 正向CCGTTCATGCTATCACAGCTACACA 反向GGAAGCAGGATCTTACCATGTGAC 用此方法克隆所得建鯉GAPDH基因含內(nèi)含子的部分序列為如SEQ ID中No. I所述。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述克隆方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95°C3min ；30 循環(huán) 94°C 30s、57°C 30s,72°C lmin ;72°C延長 8min ;4°C度保存。
3.—種real time PCR擴(kuò)增權(quán)利要求I中所述建鯉GAPDH基因含內(nèi)含子的部分序列的方法，按如下步驟實(shí)現(xiàn)抽提總RNA,以O(shè)igo dT Primer和Random 6 mers為引物進(jìn)行RT反應(yīng)，然后以此RT液為模板進(jìn)行real time PCR，熒光染料為SYBR Green I，其特征在于real time PCR中的建鯉引物為跨越內(nèi)含子的定量引物，其序列為 正向AGCTCAATGGCAAGCTTACTGG 反向GTGGATACCACCTGGTCCTCTG。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述realtime PCR擴(kuò)增方法,其特征在于,所述real time PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C 3min，然后40個循環(huán)94°C 5sec，62°C 20sec，最后72°C 3min，4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明通過克隆建鯉GAPDH含內(nèi)含子的部分序列，然后設(shè)計跨越內(nèi)含子的引物，優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)條件，來消除DNA的污染，從而提高擴(kuò)增效率。這樣，可為GAPDH作為內(nèi)參基因，在利用realtimePCR對建鯉功能基因的研究中提供有用的方法。
文檔編號C12N15/10GK102643799SQ201210120450
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月23日
發(fā)明者俞菊華, 唐永凱, 李建林, 李紅霞, 董在杰 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心