檢驗cyp3a4內(nèi)含子snp具有增強(qiáng)子和啟動子功能的報告基因方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種針對人的CYP3A4內(nèi)含子序列和驗證該序列SNP同時具有增強(qiáng)子和啟動子增強(qiáng)表達(dá)功能的檢驗CYP3A4內(nèi)含子SNP具有增強(qiáng)子和啟動子功能的報告基因方法，包括從人CYP3A4基因組中選擇內(nèi)含子序列、CYP3A4啟動子序列熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建、CYP3A4內(nèi)含子SNP增強(qiáng)子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建、CYP3A4內(nèi)含子SNP啟動子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建、HepG2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶活性測定，應(yīng)用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)人CYP3A4內(nèi)含子SNP同時具有增強(qiáng)子和啟動子的功能，應(yīng)用本發(fā)明可以篩選提高CYP3A4酶的產(chǎn)量的SNP，對進(jìn)一步體外研究或篩選CYP3A4酶代謝的藥物將具有重要的應(yīng)用價值。
【專利說明】檢驗CYP3A4內(nèi)含子SNP具有增強(qiáng)子和啟動子功能的報告基
因方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種針對人的CYP3A4內(nèi)含子序列和驗證該序列SNP同時具有增強(qiáng)子和啟動子增強(qiáng)表達(dá)功能的檢驗CYP3A4內(nèi)含子SNP具有增強(qiáng)子和啟動子功能的報告基因方法。
[0002]發(fā)明背景
CYP3A4酶是成人體內(nèi)最重要的藥物代謝酶，代謝的藥物占臨床上所用藥物的一半左右。該酶的活性影響藥物的療效，與藥物的不良反應(yīng)有關(guān)，并且存在明顯的個體差異。研究表明CYP3A4酶在肝內(nèi)的表達(dá)存在約40倍的個體差異，且這種差異約90%是由于人CYP3A4基因遺傳變異引起，如果能找出導(dǎo)致個體差異的遺傳標(biāo)志物，不但可以指導(dǎo)安全有效的用藥，而且具有極大的經(jīng)濟(jì)學(xué)價值。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP是CYP3A4基因遺傳變異中最常見的形式，其中已知CYP3A4 SNP功能位點(diǎn)(多數(shù)外顯子SNP)極低的等位基因頻率使其對酶活性個體差異的影響范圍較有限，且在中國人群中的變異頻率絕大多數(shù)低于5%，因此CYP3A4酶活性的大部分個體差異還不能通過現(xiàn)有遺傳有關(guān)的研究證實。
[0003]近年來，內(nèi)含子的研究成為科研工作者觀注的焦點(diǎn)，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子可影響基因的表達(dá)、調(diào)控，如影響剪接及編碼MicroRNA、通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸或RNA加工/折疊影響RNA水平，內(nèi)含子也可作為增強(qiáng)子及啟動子等。啟動子是與RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合功能有關(guān)的一段DNA序列，它是基因的一個組成部分，控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時間和表達(dá)的程度。增強(qiáng)子是增強(qiáng)基因啟動子工作效率的順式作用的一段DNA序列，能夠在相對于啟動子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都發(fā)揮作用。在細(xì)胞色素P450氧化酶(CYP)基因中，內(nèi)含子SNP影響剪接(如CYP3A5*3)及內(nèi)含子SNP影響RNA表達(dá)、加工或折疊的方法已有報道，且通過軟件分析，在MicroRNA數(shù)據(jù)庫中可比對發(fā)現(xiàn)與靶基因序列匹配的MicroRNA。到目前為止，體外研究尚無理想的高表達(dá)CYP3A4酶的哺乳動物細(xì)胞株，現(xiàn)在常用的肝癌細(xì)胞株H印G2細(xì)胞產(chǎn)量極低，尋求可增強(qiáng)CYP3A4基因表達(dá)、提高CYP3A4酶產(chǎn)量的內(nèi)含子增強(qiáng)子或具有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的內(nèi)含子啟動子，對體外研究或篩選CYP3A4酶代謝的藥物將具有重要的應(yīng)用價值，而體外實驗檢驗CYP3A4內(nèi)含子SNP同時具有增強(qiáng)子和啟動子功能的方法尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足而提供一種針對人CYP3A4內(nèi)含子序列和驗證該序列SNP具有增強(qiáng)表達(dá)功能的，并可為其它真核基因內(nèi)含子SNP同時具有增強(qiáng)子和啟動子功能鑒定提供參考的檢驗CYP3A4內(nèi)含子SNP具有增強(qiáng)子和啟動子功能的報告基因方法。
[0005]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:一種檢驗CYP3A4內(nèi)含子SNP具有增強(qiáng)子和啟動子功能的報告基因方法，首先需要在人的CYP3A4基因組中選擇內(nèi)含子SNP，其中所述的內(nèi)含子SNP具有至少如下特征:
(I)位于編碼CYP3A4酶的CYP3A4基因的兩個外顯子之間的內(nèi)含子，并且
(II)內(nèi)含子包含典型的GT……AG剪接結(jié)構(gòu)，即5'端有GT剪接位點(diǎn)，3端有AG剪接位點(diǎn)，并且
(III)在內(nèi)含子3'末端剪接點(diǎn)的上游20~50核苷酸范圍內(nèi)，還有一個在剪接中有重要作用的位點(diǎn)，其序列中含有A，稱為分支部位，并且
(IV)體內(nèi)實驗已證實該內(nèi)含子中的SNP影響CYP3A4酶活性，并且 (V)內(nèi)含子中該SNP變異不影響剪接，即不影響II)中的剪接位點(diǎn)及III)中的分支部位，并且
(VI)內(nèi)含子中該SNP變異不編碼microRNA。
[0006]還包括CYP3A4啟動子序列熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建、CYP3A4內(nèi)含子SNP增強(qiáng)子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建、CYP3A4內(nèi)含子SNP啟動子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建、HepG2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶活性測定；具體步驟如下:
步驟1: CYP3A4啟動子序列熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建，過程是:
1.1、DNA提取和基因型分析
取健康志愿者外周靜脈血，EDTA抗凝，并用標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿法提取健康志愿者的全基因組DNA，置于冰箱備用；采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析對CYP3A4內(nèi)含子SNP多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析；通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序驗證基因型檢測方法的可靠性，
1.2、CYP3A4啟動子PCR擴(kuò)增，
1.3、PCR產(chǎn)物膠回收，
1.4、雙酶切膠回收PCR產(chǎn)物及pGL3-Basic Vector載體后，用瓊脂糖凝膠 電泳并分別膠回收目的DNA片段及載體，
1.5、連接酶切后CYP3A4啟動子及pGL3載體，并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α大 腸桿菌，挑取單克隆小提質(zhì)粒，酶切和測序，獲得PGL3-P重組質(zhì)粒，
1.6、pGL3-P重組質(zhì)粒進(jìn)一步培養(yǎng)擴(kuò)增；
步驟2:CYP3A4內(nèi)含子SNP增強(qiáng)子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建，過程是:
2.1、CYP3A4內(nèi)含子SNP的DNA片段PCR擴(kuò)增，包括插入熒光素酶報告基因Iuc上、下游CYP3A4內(nèi)含子SNP目的DNA片段，
2.2、PCR產(chǎn)物膠回收，
2.3、雙酶切膠回收PCR產(chǎn)物及pGL3-P重組質(zhì)粒載體后，用瓊脂糖凝膠電泳并分別膠回收CYP3A4內(nèi)含子SNP及載體，
2.4、連接酶切后CYP3A4內(nèi)含子SNP片段及pGL3-P載體，并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，挑單克隆、小提質(zhì)粒、酶切和測序，獲得獲得正向插入重組質(zhì)粒和反向插入重組質(zhì)粒，
2.5、正向插入重組質(zhì)粒及反向插入重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒進(jìn)一步培養(yǎng)擴(kuò)增；
步驟3:CYP3A4內(nèi)含子SNP啟動子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建，過程是:
3.UCYP3A4內(nèi)含子SNP的DNA片段PCR擴(kuò)增，包括插入熒光素酶報告基因Iuc上游正、反向CYP3A4內(nèi)含子SNP目的DNA片段，3.2、PCR產(chǎn)物膠回收，
3.3、雙酶切膠回收PCR產(chǎn)物及pGL3載體后，用瓊脂糖凝膠電泳并分別膠回收CYP3A4內(nèi)含子SNP及載體，
3.4、連接酶切后CYP3A4內(nèi)含子SNP片段及pGL3載體，并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌，挑單克隆、小提質(zhì)粒、酶切和測序，獲得重組質(zhì)粒，
3.5、將重組質(zhì)粒進(jìn)一步培養(yǎng)擴(kuò)增；
步驟4:HepG2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，過程是:
4.UHepG2細(xì)胞培養(yǎng)，
用含10%小牛血清、含雙抗100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，37°C、5%C02條件下傳代培養(yǎng)，
4.2、轉(zhuǎn)染前一天，細(xì)胞接種于24孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度約90%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染:將pGL3和上述重組質(zhì)粒及內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK,目的質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒以20:1共轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine? 2000說明書瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞；轉(zhuǎn)染前，用適量不含抗生素的無血清培養(yǎng)液分別稀釋質(zhì)粒和Lipofectamine? 2000脂質(zhì)體后，將二者混合，室溫放置20 min，加入培養(yǎng)板孔中，搖板輕混勻后放入37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后5 h換液,換成含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；孵育收集轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性測定；
步驟5:雙熒光素酶活性測定，過程是:
5.1、細(xì)胞收獲:除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后培養(yǎng)液中細(xì)胞培養(yǎng)基，I XPBS沖洗細(xì)胞，加入IXPLB細(xì)胞裂解液100 μ 1，室溫輕緩晃動培養(yǎng)板15 min后，再吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，立即測定或一 80°C保存，
5.2、雙熒光素酶活性測定:細(xì)胞裂解后用雙熒光報告基因試劑盒在發(fā)光檢測儀上檢測熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶的活性與內(nèi)參照質(zhì)粒PRL-TK中的海腎熒光素酶的活性比值作為被檢測的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后所測得的熒光素酶的相對活性。
[0007]本發(fā)明的方法發(fā)現(xiàn)CYP3A4內(nèi)含子SNP同時具有增強(qiáng)子和啟動子的功能，發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)CYP3A4基因的表達(dá)的內(nèi)含子增強(qiáng)子及啟動子，可用來篩選提高CYP3A4酶的產(chǎn)量的SNP，對進(jìn)一步體外研究或篩選CYP3A4酶代謝的藥物將具有重要的應(yīng)用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為本發(fā)明構(gòu)建CYP3A4啟動子、CYP3A4內(nèi)含子SNP增強(qiáng)子及啟動子熒光素酶報告基因載體，瞬時轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞及檢測內(nèi)含子SNP增強(qiáng)子及啟動子功能的技術(shù)路線圖。
[0009]圖2為CYP3A4啟動子報告基因載體啟動子插入部位示意圖。
[0010]圖3為有CYP3A4啟動子時熒光素酶報告基因Iuc上游CYP3A4*1G等位基因插入部位示意圖。
[0011]圖4為有CYP3A4啟動子時熒光素酶報告基因Iuc下游CYP3A4*1G等位基因插入部位示意圖。
[0012]圖5為無啟動子時熒光素酶報告基因Iuc上游CYP3A4*1G等位基因插入部位示意圖。
[0013]圖6為熒光素酶報告基因Iuc上游重組質(zhì)粒酶切結(jié)果。
[0014]圖7為突光素酶報告基因Iuc上游PGL3-P重組質(zhì)粒測序圖。[0015]圖8為熒光素酶報告基因Iuc上游PGL3-P-F-1587 bp G/A重組質(zhì)粒(CYP3A4啟動子上游)測序圖。
[0016]圖9為熒光素酶報告基因Iuc上游PGL3-P-R-1587 bp G重組質(zhì)粒(CYP3A4啟動子上游)測序圖。
[0017]圖10為熒光素酶報告基因Iuc上游PGL3-P-R-1587 bp A重組質(zhì)粒(CYP3A4啟動子上游)測序圖。
[0018]圖11為熒光素酶報告基因Iuc下游PGL3-P-F-1587 bp G/A重組質(zhì)粒(CYP3A4啟動子下游)測序圖。
[0019]圖12為熒光素酶報告基因Iuc下游PGL3-P-R-1587 bp G/A重組質(zhì)粒(CYP3A4啟動子下游)測序圖。
[0020]圖13為熒光素酶報告基因Iuc上游PGL3-F-1587 bp G/A重組質(zhì)粒(無啟動子時)測序圖。
[0021]圖14為熒光素酶報告基因Iuc上游PGL3-R-1587 bp G/A重組質(zhì)粒(無啟動子時)測序圖。
[0022]圖15為!fepG2細(xì)胞中CYP3A4啟動子活性。
[0023]圖16為熒光素酶報告基因Iuc上游CYP3A4*1G對CYP3A4啟動子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)作用。
[0024]圖17為熒光素酶報告基因Iuc下游CYP3A4*1G對CYP3A4啟動子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)作用。
[0025]圖18為CYP3A4*1G等位基因在內(nèi)含子10全長中的轉(zhuǎn)錄激活作用(內(nèi)含子啟動子活性)。
具體實施方案
[0026]本發(fā)明因涉及一種人CYP3A4內(nèi)含子序列和驗證該序列SNP具有增強(qiáng)表達(dá)功能的方法，包括從CYP3A4基因組中選擇內(nèi)含子序列，因此CYP3A4基因組內(nèi)含子序列需滿足的條件如下:
1.1位于編碼CYP3A4酶的CYP3A4基因的兩個外顯子之間的內(nèi)含子，并且1.2內(nèi)含子包含典型的GT……AG剪接結(jié)構(gòu)，即5'端有GT剪接位點(diǎn)，3'端有AG剪接位點(diǎn)，并且
1.3在內(nèi)含子3,端末端剪接點(diǎn)的上游20~50個核苷酸范圍內(nèi)，還有一個在剪接中有重要作用的位點(diǎn)，其序列中含有A，稱為分支部位，并且
1.4體內(nèi)實驗已證實該內(nèi)含子中的SNP影響CYP3A4酶活性，并且1.5內(nèi)含子中該SNP變異不影響剪接，即不影響1.2中的剪接位點(diǎn)及1.3中的分支部位，并且
1.6內(nèi)含子中該SNP變異不編碼micro RNA。
[0027] 一種檢驗人CYP3A4內(nèi)含子SNP具有增強(qiáng)子和啟動子功能的方法，還包括CYP3A4啟動子序列熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建、CYP3A4內(nèi)含子SNP增強(qiáng)子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建、CYP3A4內(nèi)含子SNP啟動子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建、HepG2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶活性測定；步驟1: CYP3A4啟動子序列熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建，過程是:
1.1DNA提取和基因型分析
取健康志愿者外周靜脈血，EDTA抗凝，并用標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿法提取健康志愿者的全基因組DNA，置于冰箱備用；采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析對CYP3A4內(nèi)含子SNP多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析；通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序驗證基因型檢測方法的可靠性 ，
1.2CYP3A4啟動子PCR擴(kuò)增，
1.3PCR產(chǎn)物膠回收，
1.4雙酶切膠回收PCR產(chǎn)物及pGL3-Basic Vector載體后，用瓊脂糖凝膠電泳并分別膠回收目的DNA片段及載體，
1.5連接酶切后CYP3A4啟動子及pGL3載體，并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌，挑取單克隆小提質(zhì)粒，酶切和測序，獲得PGL3-P重組質(zhì)粒，
1.6pGL3-P重組質(zhì)粒進(jìn)一步培養(yǎng)擴(kuò)增；
步驟2:CYP3A4內(nèi)含子SNP增強(qiáng)子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建，過程是:
2.1CYP3A4內(nèi)含子SNP的DNA片段PCR擴(kuò)增，包括插入熒光素酶報告基因Iuc上、下游CYP3A4內(nèi)含子SNP目的DNA片段，
2.2PCR產(chǎn)物膠回收，
2.3雙酶切膠回收PCR產(chǎn)物及pGL3-P重組質(zhì)粒載體后，用瓊脂糖凝膠電泳并分別膠回收CYP3A4內(nèi)含子SNP及載體，
2.4連接酶切后CYP3A4內(nèi)含子SNP片段及pGL3_P載體，并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌，挑單克隆、小提質(zhì)粒、酶切和測序，獲得獲得正向插入重組質(zhì)粒和反向插入重組質(zhì)粒，
2.5正向插入重組質(zhì)粒及反向插入重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒進(jìn)一步培養(yǎng)擴(kuò)增；
步驟3:CYP3A4內(nèi)含子SNP啟動子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建，過程是:
3.1CYP3A4內(nèi)含子SNP的DNA片段PCR擴(kuò)增，包括插入熒光素酶報告基因Iuc上游正、反向CYP3A4內(nèi)含子SNP目的DNA片段，
3.2PCR產(chǎn)物膠回收，
3.3雙酶切膠回收PCR產(chǎn)物及pGL3載體后，用瓊脂糖凝膠電泳并分別膠回收CYP3A4內(nèi)含子SNP及載體，
3.4連接酶切后CYP3A4內(nèi)含子SNP片段及pGL3載體，并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌，挑單克隆、小提質(zhì)粒、酶切和測序，獲得重組質(zhì)粒，
3.5將重組質(zhì)粒進(jìn)一步培養(yǎng)擴(kuò)增；
步驟4:HepG2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，過程是:
4.lHepG2細(xì)胞培養(yǎng)，
用含10%小牛血清、含雙抗100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，37°C、5%C02條件下傳代培養(yǎng)，
4.2轉(zhuǎn)染前一天，細(xì)胞接種于24孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度約90%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染:將pGL3和上述重組質(zhì)粒及內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK,目的質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒以20:1共轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine? 2000說明書瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞；轉(zhuǎn)染前，用適量不含抗生素的無血清培養(yǎng)液分別稀釋質(zhì)粒和Lipofectamine? 2000脂質(zhì)體后，將二者混合，室溫放置20 min，加入培養(yǎng)板孔中，搖板輕混勻后放入37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后5 h換液,換成含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；孵育收集轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性測定；
步驟5:雙熒光素酶活性測定，過程是: 5.1細(xì)胞收獲:除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后培養(yǎng)液中細(xì)胞培養(yǎng)基，I XPBS沖洗細(xì)胞，加入IXPLB細(xì)胞裂解液100 μ 1，室溫輕緩晃動培養(yǎng)板15 min后，再吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，立即測定或一 80°C保存，
5.2雙熒光素酶活性測定:細(xì)胞裂解后用雙熒光報告基因試劑盒在發(fā)光檢測儀上檢測熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶的活性與內(nèi)參照質(zhì)粒PRL-TK中的海腎熒光素酶的活性比值作為被檢測的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后所測得的熒光素酶的相對活性。
[0028]內(nèi)含子增強(qiáng)子對不同物種、不同基因的啟動子的影響程度不同，因此，研究人CYP3A4 (再次出現(xiàn)僅以CYP3A4表示)內(nèi)含子SNP作為增強(qiáng)子時使用CYP3A4基因啟動子區(qū)序列(5’端上游啟動子區(qū))為較理想的選擇。
[0029]CYP3A4 基因內(nèi)含子 10 SNP CYP3A4*1G (20230G>A，rs2242480)在中國人群變異頻率達(dá)30%，且體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)該SNP通過影響CYP3A4酶活性從而影響了阿托伐他汀、環(huán)孢素及芬太尼等藥物對人體的療效。了解CYP3A4酶基因內(nèi)含子10 SNP CYP3A4*1G具體功能和機(jī)制，將從遺傳學(xué)角度解釋CYP3A4酶活性差異形成的原因，對于臨床有關(guān)CYP3A4酶代謝藥物的個體化用藥可提供新的理論基礎(chǔ)及指導(dǎo)。CYP3A4*1G位于具有典型剪接結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子中，該變異不影響剪接/編碼MicroRNA、不通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸或RNA加工/折疊影響RNA水平，是否作為增強(qiáng)子及充當(dāng)啟動子發(fā)揮作用，尚未見報道，現(xiàn)以CYP3A4基因內(nèi)含子10 SNPCYP3A4*1G為例具體說明。
[0030]內(nèi)含子SNP 10 CYP3A4*1G滿足如下條件:
1.1位于編碼CYP3A4酶(蛋白質(zhì))的CYP3A4基因的兩個外顯子之間的內(nèi)含子，并且1.2內(nèi)含子包含典型的GT……AG剪接結(jié)構(gòu)，即5'端有GT剪接位點(diǎn)，3'端有AG剪接位點(diǎn)，并且
1.3在內(nèi)含子3,端末端剪接點(diǎn)的上游20~50個核苷酸范圍內(nèi)，還有一個在剪接中有重要作用的位點(diǎn)，其序列中含有A，稱為分支部位，并且
1.4體內(nèi)實驗已證實該內(nèi)含子中的SNP影響CYP3A4酶活性(Gao Y, Zhang LR, FuQ.Eur J Clin Pharmacol, 2008, 64(9):877-882 ;Zhang ff, Chang YZ, Kan QC, etal.Eur J Clin Pharmacol, 2010, 66 (I): 61-66 ;Dong ZL, Li H, Chen QX, et al.JClin Pharm Ther, 2012, 37 (2): 153-156 ;Yuan R, Zhang X, Deng Q, et al..ClinChim Acta, 2011，412(9-10):755-760 ；Qiu XY, Jiao Z, Zhang M, et al..Eur J ClinPharmacol, 2008, 64 (11): 1069-1084 ;Hu YF, Tu JH, Tan ZR, et al..Xenobiotica,2007，37(3):315-327,有關(guān)文章中的 CYP3A4*18B 實際為 CYP3A4*1G)，并且
1.5內(nèi)含子中該SNP變異不影響剪接，即不影響1.2中的剪接位點(diǎn)及1.3中的分支部位，并且
1.6內(nèi)含子中該SNP變異不編碼micro RNA。
[0031]2.如圖1所示，一種檢驗人CYP3A4內(nèi)含子SNP具有增強(qiáng)子和啟動子功能的方法，包括構(gòu)建含CYP3A4基因啟動子序列熒光素酶報告基因及內(nèi)含子CYP3A4*1G啟動子及增強(qiáng)子序列熒光素酶報告基因載體，HepG2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶活性測定的步驟如下:2.1如圖2所示，步驟一:CYP3A4基因啟動子序列熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建過程
是:
2.1.1 DNA提取和基因型分析
取健康志愿者外周靜脈血疒3 ml, EDTA抗凝，并用標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿法提取健康志愿者的全基因組DNA，置于-20°C冰箱備用。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)對內(nèi)含子 10 SNP CYP3A4*1G (20230G>A, rs2242480)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析(任欣偉，楊衛(wèi)紅，李彥鵬，蔡要欣，賈敏，張莉蓉.河南地區(qū)漢族人群中CYP3A4*1G和CYP3AP1*3多態(tài)性分布及連鎖不平衡分析.中國新藥與臨床雜志.2010;29(8):602-605.)；
2.1.2 CYP3A4啟動子PCR擴(kuò)增；
2.1.2.1引物設(shè)計
根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中CYP3A4基因5’端上游啟動子區(qū)序列(60256~61990，AF280107),設(shè)計一對引物，在上游和下游引物的5’端分別加上XhoI和HindIII酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。CYP3A4啟動子區(qū)PCR引物序列見表1。
[0032]表1構(gòu)建CYP3A4啟動子及CYP3A4*1G等位基因重組質(zhì)粒所用PCR引物
【權(quán)利要求】
1.一種檢驗CYP3A4內(nèi)含子SNP具有增強(qiáng)子和啟動子功能的報告基因方法，需要在人的CYP3A4基因組中選擇內(nèi)含子SNP，其中所述的內(nèi)含子SNP具有至少如下特征: (I)位于編碼CYP3A4酶的CYP3A4基因的兩個外顯子之間的內(nèi)含子，并且 (II)內(nèi)含子包含典型的GT……AG剪接結(jié)構(gòu)，即5'端有GT剪接位點(diǎn)，3端有AG剪接位點(diǎn)，并且 (III)在內(nèi)含子3'末端剪接點(diǎn)的上游20~50核苷酸范圍內(nèi)，還有一個在剪接中有重要作用的位點(diǎn)，其序列中含有A，稱為分支部位，并且 (IV)體內(nèi)實驗已證實該內(nèi)含子中的SNP影響CYP3A4酶活性，并且 (V)內(nèi)含子中該SNP變異不影響剪接，即不影響II)中的剪接位點(diǎn)及III)中的分支部位，并且 (VI)內(nèi)含子中該SNP變異不編碼microRNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢驗CYP3A4內(nèi)含子SNP具有增強(qiáng)子和啟動子功能的報告基因方法，其特征在于:還包括CYP3A4啟動子序列熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建、CYP3A4內(nèi)含子SNP增強(qiáng)子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建、CYP3A4內(nèi)含子SNP啟動子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建、HepG2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶活性測定；具體步驟如下: 步驟1: CYP3A4啟動子序列熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建，過程是: .1.1、DNA提取和基因型分析 取健康志愿者外周靜脈血，EDTA抗凝，并用標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿法提取健康志愿者的全基因組DNA，置于冰箱備用；采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析對CYP3A4內(nèi)含子SNP多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析；通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序驗證基因型檢測方法的可靠性， .1.2、CYP3A4啟動子PCR擴(kuò)增， .1.3、PCR產(chǎn)物膠回收， . 1.4、雙酶切膠回收PCR產(chǎn)物及pGL3-Basic Vector載體后，用瓊脂糖凝膠 電泳并分別膠回收目的DNA片段及載體， .1.5、連接酶切后CYP3A4啟動子及pGL3載體，并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α大 腸桿菌，挑取單克隆小提質(zhì)粒，酶切和測序，獲得PGL3-P重組質(zhì)粒， .1.6、pGL3-P重組質(zhì)粒進(jìn)一步培養(yǎng)擴(kuò)增； 步驟2:CYP3A4內(nèi)含子SNP增強(qiáng)子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建，過程是: .2.1、CYP3A4內(nèi)含子SNP的DNA片段PCR擴(kuò)增，包括插入熒光素酶報告基因Iuc上、下游CYP3A4內(nèi)含子SNP目的DNA片段， . 2.2、PCR產(chǎn)物膠回收， .2.3、雙酶切膠回收PCR產(chǎn)物及pGL3-P重組質(zhì)粒載體后，用瓊脂糖凝膠電泳并分別膠回收CYP3A4內(nèi)含子SNP及載體， .2.4、連接酶切后CYP3A4內(nèi)含子SNP片段及pGL3-P載體，并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，挑單克隆、小提質(zhì)粒、酶切和測序，獲得獲得正向插入重組質(zhì)粒和反向插入重組質(zhì)粒， .2.5、正向插入重組質(zhì)粒及反向插入重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒進(jìn)一步培養(yǎng)擴(kuò)增； 步驟3:CYP3A4內(nèi)含子SNP啟動子熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建，過程是:. 3.UCYP3A4內(nèi)含子SNP的DNA片段PCR擴(kuò)增，包括插入熒光素酶報告基因Iuc上游正、反向CYP3A4內(nèi)含子SNP目的DNA片段， ·3.2、PCR產(chǎn)物膠回收， · 3.3、雙酶切膠回收PCR產(chǎn)物及pGL3載體后，用瓊脂糖凝膠電泳并分別膠回收CYP3A4內(nèi)含子SNP及載體， · 3.4、連接酶切后CYP3A4內(nèi)含子SNP片段及pGL3載體，并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌，挑單克隆、小提質(zhì)粒、酶切和測序，獲得重組質(zhì)粒，· 3.5、將重組質(zhì)粒進(jìn)一步培養(yǎng)擴(kuò)增； 步驟4:HepG2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，過程是:.4.UHepG2細(xì)胞培養(yǎng)， 用含10%小牛血清、含雙抗100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，37°C、5%C02條件下傳代培養(yǎng)， · 4.2、轉(zhuǎn)染前一天，細(xì)胞接種于24孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度約90%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染:將pGL3和上述重組質(zhì)粒及內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK,目的質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒以20:1共轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine?2000說明書瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞；轉(zhuǎn)染前，用適量不含抗生素的無血清培養(yǎng)液分別稀釋質(zhì)粒和LipofectamineTM2000脂質(zhì)體后，將二者混合，室溫放置20 min，加入培養(yǎng)板孔中，搖板輕混勻后放入37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后5 h換液,換成含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；孵育收集轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性測定； 步驟5:雙熒光素酶活性測定，過程是: · 5.1、細(xì)胞收獲:除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后培養(yǎng)液中細(xì)胞培養(yǎng)基，I XPBS沖洗細(xì)胞，加入IXPLB細(xì)胞裂解液100 μ I，室溫輕緩晃動培養(yǎng)板15 min后，再吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，立即測定或一 80°C保存， · 5.2、雙熒光素酶活性測定:細(xì)胞裂解后用雙熒光報告基因試劑盒在發(fā)光檢測儀上檢測熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶的活性與內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK中的海腎熒光素酶的活性比值作為被檢測的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后所測得的熒光素酶的相對活性。
【文檔編號】C12N15/11GK103525940SQ201310518768
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】楊衛(wèi)紅, 張莉蓉, 楊鴿, 韓圣娜, 趙登職, 閆良, 王洋 申請人:鄭州大學(xué)