小麥雄性不育基因wms及其花藥特異性啟動(dòng)子的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種小麥雄性不育基因 WMS及其花藥特異性啟動(dòng)子的應(yīng)用。 二、 技術(shù)背景
[0002] 植物雄性不育對于選擇育種和雜交制種至關(guān)重要。在很多植物上，發(fā)現(xiàn)了大量的 雄性不育株系，對于它們的收集和保存為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)提供了寶貴的遺傳和種質(zhì)資源。近年來， 人工創(chuàng)制的植物雄性不育系，尤其對于重要糧食作物水稻（Oryza sativa L )和玉米（Zea mays L.)，在生產(chǎn)上開始發(fā)揮作用。
[0003] 美國先鋒公司（Pioneer Hi-Bred International)創(chuàng)制了新型種子生產(chǎn)技術(shù) (Seed Production Technology, SPT)(Waltz. 2012. Nature Biotechnology 30:215-217)〇 在玉米上，SPT技術(shù)應(yīng)用到3個(gè)關(guān)鍵基因：顯性雄性可育基因 Ms45,隱性雄性不育基因 ms45 和紅色熒光（可視）標(biāo)記基因 DsRed2。先鋒公司構(gòu)建了攜帶Ms45和DsRed2各自表達(dá)框 架的植物表達(dá)載體（簡稱Ms45-DSRed2)，其中可育基因 Ms45受花藥特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，可 視標(biāo)記基因 DsRed2受組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。先鋒公司將Ms45-DsRed2載體導(dǎo)入玉米雄性不 育系（ms45/ms45)，創(chuàng)制了玉米雄性不育保持系 DP-32138-1 (ms45/ms45, Ms45-DsRed2/_)。 DP-32138-1作為花粉供體，為玉米雄性不育植株（mS45/ms45)授粉，不育株上收獲的種子 再經(jīng)可視熒光自動(dòng)分揀技術(shù)，獲得玉米雄性不育系（m S45/ms45)和玉米雄性不育保持系 DP-32138-l(ms45/ms45, Ms45-DsRed2/_)，其中的不育系可用于雜交種生產(chǎn)。在創(chuàng)制植物 雄性不育系方面，利用花藥特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)不育基因至關(guān)重要，有助于降低其它非預(yù)見 性風(fēng)險(xiǎn)。在水稻上，羅等人（2006)通過cDNA差顯技術(shù)鑒定到花藥絨氈層特異性表達(dá)的 基因 RTS，該基因主要在減數(shù)分裂時(shí)期的絨氈層表達(dá)，其表達(dá)在植株開花前消失（Luo et al. 2006. Plant Molecular Biology 62:397-408)。劉等人（2013)借助高通量技術(shù)發(fā)現(xiàn) 了水稻花藥特異性表達(dá)的基因 LTP6,該基因編碼脂類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Liu et al. 2013. Planta 238:845-857)。總之，采用花藥特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)植物雄蕊育性相關(guān)基因，對于雄性可育/ 不育系的創(chuàng)建和雜交種的生產(chǎn)有重要意義。
[0004] 太谷核不育小麥（Triticum aestivum L.)是我國上世紀(jì)70年代初發(fā)現(xiàn)的"無 花粉型"自然突變體，該表型受單顯性核基因 Ms2(原始命名Tal)控制，位于小麥4D染色 體的短臂（鄧景揚(yáng)，高忠麗.1980.作物學(xué)報(bào)6:85-98)。由于太谷核不育表現(xiàn)為單基因顯 性遺傳，決定雄性不育的基因只能處于雜合狀態(tài)（Ms2/ms2)，當(dāng)接受雄性可育小麥（ms2/ ms2)花粉所產(chǎn)生的種子中，大約50%的種子發(fā)育成雄性可育植株（ms2/ms2)，其余的種 子形成雄性不育植株（Ms2/ms2)。上世紀(jì)80年代，劉秉華等人創(chuàng)制了攜帶顯性矮桿基因 Rht-Dlc (原始命名RhtlO)的太谷核不育小麥（簡稱'矮敗小麥'）（Shu/ed. 2009. Induced Plant Mutations in the Genomics Era/FA0/Rome:370_372)。'矮敗小麥'中 Rht-Dlc 基 因和Ms2基因緊密連鎖（Cao et al. 2009. Genome 52:95 - 99 ;Shu/ed. 2009. Induced Plant Mutations in the Genomics Era/FA0/Rome:370_372)，本發(fā)明稱之為 Rht_Dlc_Ms2 位點(diǎn) (簡稱RMs2位點(diǎn)）。自1983年，Ms2基因和RMs2位點(diǎn)成為小麥輪回選擇的重要工具。到 目前為止，中國已經(jīng)回交轉(zhuǎn)育了數(shù)百份攜帶Ms2或RMs2位點(diǎn)的小麥品系（本發(fā)明統(tǒng)稱'太 谷核不育小麥'），并利用它們選育了 40多份小麥品種。 三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決人為控制植物育性的問題，本發(fā)明提供了一種小麥雄性不育基因麗S及 其花藥特異性啟動(dòng)子的應(yīng)用。具體涉及小麥雄性不育基因 WMS、該基因的花藥特異性啟動(dòng)子 及它們的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明利用RNA測序（RNA-Seq)對比了小麥近等基因系'魯麥15'和'魯麥 15+Ms2'（簡稱'魯麥15 Ms2'）減數(shù)分裂初期的花藥轉(zhuǎn)錄組（transcriptome)，從中鑒定只在 '魯麥15Ms2'花藥組織中表達(dá)的基因；本發(fā)明從'魯麥15 Ms2'中獲得了控制小麥雄性不育的 基因，命名為麗S基因。結(jié)果表明，麗S基因影響小麥雄蕊發(fā)育，人工調(diào)控麗S基因可以改 變植物雄蕊的育性。另外，WMS基因啟動(dòng)子具有花藥特異性驅(qū)動(dòng)的活性，可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因 的花藥特異性表達(dá)。因此，本發(fā)明可用于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的花藥特異性表達(dá)、創(chuàng)建植物雄性不 育特性、建立植物輪回選擇體系、發(fā)展植物雜交制種技術(shù)。
[0007] 麗S基因的全長cDNA序列如SEQ ID NO: 1所示；麗S基因編碼的蛋白（即麗S蛋 白）氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；WMS基因組全長表達(dá)框架，包括啟動(dòng)子、基因組編碼 區(qū)和終止子，其核甘酸序列如SEQ ID NO:4 ;WMS基因啟動(dòng)子核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所 示；麗S基因組轉(zhuǎn)錄區(qū)段的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0008] 本發(fā)明主要涉及編碼小麥WMS蛋白及其同源蛋白的CDNA、合成DNA和基因組DNA 的應(yīng)用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用常規(guī)技術(shù)即可獲得麗S基因相關(guān)的cDNA和基因組DNA。 對于cDNA的制備大致需要如下步驟：a)從'太谷核不育小麥'或其它物種中提取信使 RNA(message RNA，mRNA) ;b)利用mRNA作為模板合成cDNA ;c)根據(jù)本發(fā)明WMS基因全長 cDNA序列SEQ ID NO: 1設(shè)計(jì)PCR引物，然后從cDNA模板中擴(kuò)增WMS基因或其同源基因；d) 將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體，獲得WMS基因或其同源基因的cDNA。同理，本領(lǐng)域的技術(shù)人員 也可以從'太谷核不育小麥'或其它物種中提取基因組DNA，用以創(chuàng)建基因組DNA文庫（如 BAC、cosmid、fosmid等類型文庫），再利用基于本發(fā)明WMS基因組全長表達(dá)框架的核苷酸 序列（SEQ ID NO: 4)的DNA探針或PCR引物篩選DNA文庫，獲得攜帶WMS基因的陽性質(zhì)粒。 也可采用長片段PCR方法，利用本發(fā)明WMS基因組全長表達(dá)框架的核苷酸序列（如SEQ ID NO: 4)的特異PCR引物，從植物基因組DNA或質(zhì)粒DNA直接擴(kuò)增麗S基因或其同源基因，進(jìn) 而將PCR產(chǎn)物連接到克隆載體。
[0009] 本發(fā)明包括任何DNA片段，只要它們編碼的蛋白與麗S蛋白（SEQ ID NO: 2)功能 等價(jià)。本文所指的"與麗S蛋白功能等價(jià)"意味著目標(biāo)DNA片段所編碼的蛋白在生物學(xué)功 能和生理生化特征等方面與本發(fā)明中麗S蛋白（SEQ ID N0:2)類同。麗S蛋白典型的生 物學(xué)功能是誘導(dǎo)植物雄性不育。為驗(yàn)證麗S基因是否誘導(dǎo)小麥雄性不育，可使用甲基磺 酸乙酯（Ethylmethylsulfone，EMS)創(chuàng)建'太谷核不育小麥'的突變?nèi)后w（實(shí)施例7)，再 用定向誘導(dǎo)基因組局部突變（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes，TILLING) 技術(shù)篩選麗S基因敲除（knockout)或敲低（knockdown)的突變植株（實(shí)施例8)，然后 分析麗S基因突變對'太谷核不育小麥'雄蕊發(fā)育的影響。為明確麗S基因的功能，也 可采用遺傳互補(bǔ)（genetic complementation)手段加以驗(yàn)證。本發(fā)明利用基因槍轟擊 (biolistics bombardment)技術(shù)將WMS基因組全長表達(dá)框架載體（SEQ ID N0:7)導(dǎo)入雄 性可育小麥'Bobwhite'（實(shí)施例9);也利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（Agrobacterium-mediated transformation)方法將WMS基因組全長表達(dá)框架（SEQ ID NO: 7)導(dǎo)入雄性可育的禾本科 植物二穗短柄草（Brachypodium distachyon L.)(實(shí)施例10);對于所獲得的轉(zhuǎn)基因植株， 分析了麗S基因的表達(dá)對雄蕊發(fā)育的影響。
[0010] 麗S基因的一個(gè)突出特點(diǎn)為花藥組織的特異性表達(dá)，即麗S基因在花藥組織的表 達(dá)較其它組織高出5倍或更多，優(yōu)選高出10倍或更多，更優(yōu)選高出15倍或更多（實(shí)施例 5)。為評價(jià)基因是否在花藥組織特異性表達(dá)，從各種植物組織分別提取mRNA，再合成相應(yīng)的 cDNA，然后米用定量 PCR (quantitative reverse-transcription PCR，qRT-PCR)測定目標(biāo) 基因 cDNA在不同組織中的相對含量（實(shí)施例5)。
[0011] 如果DNA片段編碼的蛋白功能等價(jià)于麗S蛋白（SEQ ID NO: 2)，這些DNA片段的優(yōu) 選來源是單子葉植物（monocotyledon)，更優(yōu)選來源是禾本科植物（Gramineae)，最優(yōu)選來 源是小麥族植物（Triticeae)。這些DNA片段包括本發(fā)明核苷酸序列（SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:6)對應(yīng)的等位基因、同源基因、突變基因和衍生基因；它們編碼的蛋白類似于本發(fā)明 WMS蛋白氨基酸序列（SEQ ID NO: 2)，或存在一個(gè)、數(shù)個(gè)或數(shù)十個(gè)氨基酸的替換、刪除、或插 入現(xiàn)象，都屬于本
【發(fā)明內(nèi)容】
。
[0012] 基因組編輯（genome editing)技術(shù)，可以定向敲除目的基因，在動(dòng)植物上均有應(yīng) 用（Cheng and Alper. 2014. Current Opinion in Biotechnology 30:87-94)。部分基因 組編輯技術(shù)，如鋅指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFNs)，轉(zhuǎn)錄激活類效應(yīng)因子核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease，TALEN)和規(guī)律性重復(fù)短回文序列 族（clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats，CRISPR)，在主要糧 食作物小麥（Shan et al. 2014. Nature Protocols 9:2395-2410 ;Wang et al. 2014. Nature Biotechnology 32:947-951)和大麥（Wendt et al. 2013. Plant Molecular Biology 83:279-285 ;Gurushidze et al. 2014. PLoS ONE 9:e92046)上得到了成功應(yīng)用?；蚪M編 輯技術(shù)會造成目標(biāo)基因特定區(qū)域發(fā)生一個(gè)、數(shù)個(gè)或數(shù)十個(gè)堿基的刪除或插入、導(dǎo)致基因突 變，位于轉(zhuǎn)錄區(qū)域的DNA變異則可能會造成編碼蛋白的變異或截短（truncation) (Wang et al. 2014. Nature Biotechnology 32:947-951)。轉(zhuǎn)錄區(qū)域DNA的喊基突變也會引起編碼蛋 白的氨基酸改變。利用基因組編輯或堿基突變創(chuàng)建的DNA片段，其編碼的蛋白與WMS蛋白 (SEQ ID N0:2)相比，或存在一個(gè)、數(shù)個(gè)或數(shù)十個(gè)氨基酸的替換、刪除、或插入等現(xiàn)象，但只 要該DNA片段編碼的蛋白與WMS蛋白（SEQ ID N0:2)功能等價(jià)，該DNA片段即屬于本發(fā)明 內(nèi)容。本發(fā)明界定的DNA片段還包括那些發(fā)生了堿基突變，但不改變編碼蛋白序列的突變， 即保守突變（conservative mutation) 〇
[0013] 對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，可以采用基因組編輯技術(shù)改變本
【發(fā)明內(nèi)容】
中麗S基因 (如SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:6)及其同源基因序列。另外，目標(biāo)基因的變異可以通過突 變誘導(dǎo)產(chǎn)生或通過種質(zhì)篩選鑒定本已存在的自然變異。比如，Slade等人（2005)創(chuàng)建了 小麥的EMS突變?nèi)后w，進(jìn)而采用TILLING技術(shù)鑒定目標(biāo)基因的點(diǎn)突變（Slade et al. 2005. Nature Biotechnology 23:75-81)。自然種質(zhì)的長期進(jìn)化積累了大量的變異，也可以采用 Ecotilling手段從自然種質(zhì)或育成品種中鑒定目標(biāo)基因的變異（Till et al. 2006. Nature Protocols 1:2465-2477)。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，可以創(chuàng)建相關(guān)植物材料的突變?nèi)后w，再 從中篩選本
【發(fā)明內(nèi)容】
中DNA片段（SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 6)發(fā)生變異的個(gè)體。本領(lǐng)域 的技術(shù)人員還可以從相關(guān)植物的自然種質(zhì)或育成品種中鑒定本發(fā)明DNA片段（SEQ ID N0:1 或SEQ ID N0:6)的自然變異。因此，本發(fā)明還涵蓋：a)所有通過基因組編輯、誘變或自然 變異篩選而獲得的攜帶本
【發(fā)明內(nèi)容】
的DNA片段（SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 6)發(fā)生變異的 植物細(xì)胞；b)攜帶a)項(xiàng)植物細(xì)胞的植株；c)來自b)項(xiàng)植株的無性克隆或植株后代等，只要 它們?nèi)詳y帶a)項(xiàng)植物細(xì)胞；d)來自b)和c)項(xiàng)內(nèi)容的植物種子、植物組織或植物器官等， 只要它們?nèi)詳y帶a)項(xiàng)植物細(xì)胞。
[0014] 對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，獲得DNA片段、使得它們編碼的蛋白與麗S蛋白（SEQ ID N0:2)功能等價(jià)的方法很多，如 PCR 方法（Saiki et al.l985.Science 230:1350-1354; Hemsley et al. 1989.Nucleic Acids Research 17:6545-6551 ；Landt et al. 1990. Gene 96:125-128)、DNA 重組技術(shù)和 DNA 人工合成技術(shù)（Kosuri and Church. 2014. Nature Methodsl1:499-507)?？梢哉f，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，從小麥或其它植物中獲得與麗S 基因高度同源的DNA片段為常規(guī)技術(shù)，可利用對應(yīng)本發(fā)明核苷酸序列（SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 6)的PCR引物，或使用對應(yīng)本發(fā)明核酸序列（SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 6)的DNA 探針，通過篩選基因組DNA或cDNA文庫，獲得相應(yīng)的DNA片段。對于DNA片段的獲得，無 論是通過PCR方法、DNA重組、DNA人工合成還是其它同類技術(shù)，只要這些DNA片段所編碼 的