0位于基因簇核苷酸序列第37189-36809位，編碼未知功能蛋白，長度為127 個氨基酸；
[0069] txn22位于基因簇核苷酸序列第38570-39670位，編碼未知功能蛋白，長度為367 個氨基酸；
[0070] txn48位于基因簇核苷酸序列第66666-65500位，編碼未知功能蛋白，長度為389 個氨基酸。
[0071] txn54位于基因簇核苷酸序列第73004-73552位，編碼未知功能蛋白，長度為183 個氨基酸。
[0072] 在另一優(yōu)選例中，所述的三欣卡辛生物合成基因簇的序列如SEQ ID NO. :1中第 1-102575 位或第 5384 - 80087 位所示。
[0073] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種三欣卡辛的生物合成相關(guān)蛋白，所述的蛋白氨基 酸序列選自如SEQ ID NO. :2-57中任一所不的氨基酸序列。
[0074] 在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白是txnZ蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. :Z + 1所 示，其中Z為0-55的整數(shù)。
[0075] 本發(fā)明的第三方面，三欣卡辛的生物合成相關(guān)基因，所述的合成相關(guān)基因編碼本 發(fā)明第二方面所述的三欣卡辛的生物合成相關(guān)蛋白。
[0076] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種如本發(fā)明第一方面所述的三欣卡辛生物合成基因 簇，或本發(fā)明第二方面所述的三欣卡辛生物合成相關(guān)蛋白或蛋白組合用于催化合成三欣卡 辛及類似物的用途。
[0077] 在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白組合是txnZ蛋白中2-55個蛋白所構(gòu)成的組合，其中 Z為0-55的整數(shù)。
[0078] 本發(fā)明的第五方面，提供了 一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有如本發(fā)明第一方面 所述的三欣卡辛的生物合成基因簇或如本發(fā)明第三方面所述的三欣卡辛的生物合成相關(guān) 基因。
[0079] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種重組的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有如本發(fā)明第 五方面所述的表達(dá)載體，或其染色體上整合有外源的如本發(fā)明第一方面所述的三欣卡辛的 生物合成基因簇或本發(fā)明第三方面所述的三欣卡辛的生物合成相關(guān)基因。
[0080] 在另一優(yōu)選例中，所述重組的宿主細(xì)胞包括鏈霉菌。
[0081] 本發(fā)明的第七方面，提供了一種產(chǎn)生三欣卡辛的方法，所述方法包括步驟：培養(yǎng)如 本發(fā)明第六方面所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)三欣卡辛；以及
[0082] 分離出所述的三欣卡辛。
[0083] 在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)包括：用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述的發(fā)酵 培養(yǎng)基包括以下組分：吸附性材料；較佳地，所述的吸附性材料是大孔樹脂，更佳地，所述 的吸附性材料是大孔樹脂HP20。
[0084] 在另一優(yōu)選例中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：可溶性淀粉、葡萄糖、酵 母提取物、大孔樹脂HP20,和微量元素；其中，所述的微量元素選自下組：CuS04 · 5H20、 FeSO4 · 7H20、MnCl2 · 4H20、ZnSO4 · 7H20、CoCl2 · 7H20、MgSO4. 7H20、KH2P04、（NH4) 2S04、NaCl。
[0085] 在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)還包括：用種子培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述的種 子培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基。
[0086] 在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)時間為2-10天，較佳地為3-7天。
[0087] 本發(fā)明第八方面，提供了一種突變菌株，所述的突變菌株是以產(chǎn)生三欣卡辛的菌 株為原始菌株，通過將所述原始菌株中的三欣卡辛生物合成基因簇中一個或多個基因失活 而形成的突變菌株。
[0088] 在另一優(yōu)選例中，所述的原始菌株包括鏈霉菌，更佳地包括鏈霉菌Streptomyces bottropensis D0-45。
[0089] 在另一優(yōu)選例中，所述的原始菌株是導(dǎo)入三欣卡辛生物合成基因簇的完整序列， 從而表達(dá)三欣卡辛的菌株。
[0090] 在另一優(yōu)選例中，所述的失活是通過以下方法實現(xiàn)：同源重組、定點突變、基因敲 除、或其組合。
[0091] 在另一優(yōu)選例中，所述的被失活的基因是選自如權(quán)利要求1中所述的三欣卡辛生 物合成所涉及的56個基因中的至少一個基因。
[0092] 在另一優(yōu)選例中，所述的被失活的基因選自下組：txn21、txn41、txn44、txn49、 txn4、txn52,或其組合。
[0093] 本發(fā)明的第九方面，提供了一種本發(fā)明第八方面所述的突變菌株用于制備三欣卡 辛類似物的用途。
[0094] 在另一優(yōu)選例中，所述的三欣卡辛類似物選自下組：Txn_21、Txn-41，Txn-44、 Τχη-49、Τχη-4-1、Τχη-4-2、Τχη_52〇
[0095] 本發(fā)明的第十方面，提供了一種三欣卡辛類似物，所述的三欣卡辛類似物通過以 下方法制備：
[0096] (1)提供本發(fā)明第八方面所述的突變菌株；
[0097] (2)對步驟（1)所述的突變菌株進(jìn)行培養(yǎng)，從而得到所述的三欣卡辛類似物。
[0098] 在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)包括：用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述的發(fā)酵 培養(yǎng)基包括以下組分：吸附性材料；較佳地，所述的吸附性材料是大孔樹脂，更佳地，所述 的吸附性材料是大孔樹脂ΗΡ20。
[0099] 在另一優(yōu)選例中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：可溶性淀粉、葡萄糖、酵 母提取物、大孔樹脂ΗΡ20,和微量元素；其中，所述的微量元素選自下組：CuS0 4 · 5Η20、 FeSO4 · 7H20、MnCl2 · 4H20、ZnSO4 · 7H20、CoCl2 · 7H20、MgSO4. 7H20、KH2P04、（NH4) 2S04、NaCl。
[0100] 在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)還包括：用種子培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述的種 子培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基。
[0101] 在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)時間為2-10天，較佳地為3-7天。
[0102] 在另一優(yōu)選例中，所述的三欣卡辛類似物選自下組：Txn-21、Txn-41，Txn-44、 Τχπ-49λ Txn-4-K Τχπ-4-2λ Τχη-52 ；
[0104] 本發(fā)明的第十一方面，提供了一種提高三欣卡辛產(chǎn)量的方法，所述方法包括步 驟：
[0105] 在吸附性材料存在下，培養(yǎng)三欣卡辛的生產(chǎn)菌，從而產(chǎn)生三欣卡辛；以及
[0106] 從培養(yǎng)體系或培養(yǎng)物中分離所述的三欣卡辛；
[0107] 較佳地，所述的吸附性材料是大孔樹脂，更佳地，所述的吸附性材料是大孔樹脂 HP20。
[0108] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0109] 圖1三欣卡辛A (trioxacarcin A)及其三欣卡辛B (trioxacarcin B)的化學(xué)結(jié)構(gòu) 式。
[0110] 圖2A完整的三欣卡辛生物合成基因簇；圖2B三欣卡辛生物合成基因簇的基因組 成。
[0111] 圖3三欣卡辛A在鏈霉菌Streptomyces bottropensis D0-45中的生物合成途徑。 CoA :輔酶A ;ACP :?；d體蛋白；TxnZ (或txnZ，Z=0-55):合成三欣卡辛的基因。
[0112] 圖4鏈霉菌Streptomyces bottropensis D0-45野生型菌株發(fā)酵產(chǎn)物的液相色 譜-質(zhì)譜（LC-MS)分析。Txn-Α:化合物三欣卡辛A。
[0113] 圖5三欣卡辛生物合成基因簇相關(guān)性的證實與基因簇邊界確定。最終確定 orf〇-〇rf55共56個基因與三欣卡辛生物合成相關(guān)，其他的orf (-12)-〇rf (-1)及orf (56) 到orf (77)為邊界外基因。
[0114] 圖5-1中斷KS (txn8)聚酮合酶后，三欣卡辛不再產(chǎn)生；
[0115] 圖5-2邊界外的AT (orf-3)(酰基轉(zhuǎn)移酶敲除掉后不影響三欣卡辛的產(chǎn)生）；
[0116] 圖 5-3 上游邊界外 orf-1 (membrane protein)及下游最后一個基因 txn55 (SARP) 敲除后對比野生型發(fā)酵圖；
[0117] 圖5-4 :敲除下游邊界外基因 orf58并不影響三欣卡辛的生物合成。
[0118] 圖6改變配方后加入大孔樹脂HP20提高三欣卡辛產(chǎn)生量。
[0119] 圖7pcr_targeting介導(dǎo)的突變株黏粒的構(gòu)建及突變株基因型驗證和發(fā)酵檢測示 意圖。其中，圖7a為pcr-targeting法構(gòu)建突變株黏粒示意圖，圖7b為接合轉(zhuǎn)移后基因型 驗證（帶有Am-marker)(以0rf55為例），圖7c為帶有Marker的基因型和同框缺失刪除 Marker后的基因型PCR驗證圖（以orfl6為例），圖7d為是突變株的發(fā)酵與野生型對比 HPLC圖，以此檢測是否有新化合物產(chǎn)生。M :DL5000的基因標(biāo)準(zhǔn)對照條帶。
[0120] 圖8三欣卡辛合成基因簇中部分基因的敲除實驗結(jié)果。
[0121] 圖9各種新化合物的分析數(shù)據(jù)圖。
[0122] 圖10Txn-49和野生型的生物活性實驗對比圖。
【具體實施方式】
[0123] 本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，以鏈霉菌來源的三欣卡辛為目標(biāo)分子，從克隆 其在Streptomyces bottropensis D0-45中的生物合成基因簇出發(fā)，采用微生物學(xué)、分子生 物學(xué)、生物信息學(xué)、生物化學(xué)及有機(jī)化學(xué)相結(jié)合的方法研究其生物合成，通過對其生物合成 機(jī)制的研究揭示蒽環(huán)骨架結(jié)構(gòu)及乙酰脫氧糖基獨特化學(xué)結(jié)構(gòu)形成的酶學(xué)機(jī)理，在此基礎(chǔ)上 運用基因工程的原理，合理修飾三欣卡辛的生物合成途徑，提高三欣卡辛的產(chǎn)量，并分離得 到可能具有更好活性的一些列新化合物。
[0124] 術(shù)語
[0125] 如本文所用，術(shù)語"三欣卡辛"或"trioxacarcin"可互換使用，均指化合物三欣卡 辛A或三欣卡辛B，其結(jié)構(gòu)如說明書附圖1中所示。
[0126] 以下結(jié)合圖1-圖9對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0127] 利用保守基因的同源序列克隆完整生物合成基因簇
[0128] 分析前人報道的三欣卡辛的分子結(jié)構(gòu)式發(fā)現(xiàn)，其分子中具有一個蒽醌類骨架結(jié)構(gòu) (圖1)，蒽醌類抗生素家族是聚酮類天然產(chǎn)物中非常有特色的一類，它們中的絕大多數(shù)是 由放線菌產(chǎn)生的，具有良好的抗腫瘤活性。從生物合成角度看，蒽環(huán)類抗生素是由Π 型PKS 體系催化形成的。在這一催化體系中，KSa，KSe與ACP是II型PKS的核心蛋白，它們通過 相互作用形成minimalPKS異源復(fù)合物。其中的KS a負(fù)責(zé)催化合成砌塊之間的Claisen縮 合，從而將C鏈延長；而KSe控制著Claisen縮合發(fā)生的次數(shù)，從而決定最終形成的C鏈的 長度，因此又稱為鏈延伸因子（CLF)。合成過程中的聚酮鏈結(jié)合在ACP上形成聚酮酰ACP。 合成結(jié)束后的聚酮鏈與KS a、KS β脫離，經(jīng)環(huán)化、氧化、還原、甲基化以及其它一些后修飾 形成成熟的蒽環(huán)骨架結(jié)構(gòu)。（圖3)
[0129] 本發(fā)明人根據(jù)已經(jīng)報道的蒽醌類抗生素 KSa和KSi3的氨基酸序列，分析它們 的保守序列，設(shè)計了簡并引物（For(KS) :A TC ACC GTG GCC TGY TTY GAY GCSATC-3'， Rev(CLF) :CC GGT GTT GAC SGS RTA GAA CCA NGC ;S=C 或G, Y=C或T, R=A 或G)進(jìn)行PCR，從 Streptomyces bottropensis D0-45 基因組 DNA 中擴(kuò)增得到了 I. Ikb 的片段，克隆入 pGEM-T Easy載體。DNA序列分析表明插入片段與聚酮合酶（KS)同源性很高[IdentitieS=79%， Positives=85%],因此,該片段很可能與三欣卡辛的生物合成相關(guān)。
[0130] 將上述克隆得到的基因片段進(jìn)行地高辛標(biāo)記，用于文庫篩選。對篩選到的正確黏 粒測序，利用已知序列信息進(jìn)行染色體步移，直至得到的黏粒能夠完整地覆蓋整個基因簇。 使用基因簇序列同源性在線分析軟件FramePlot4. Obeta(http://nocardia. nih. go. jp/ fp4/)，對所獲得的102575bp核苷酸序列進(jìn)行的分析發(fā)現(xiàn)了 75個orf和I個不完整的 orf (圖2B)。目的蛋白氨基酸序列同源性分析是使用美國國家生物信息中心提供的Blast 搜索引擎（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)。序列中各個基因?qū)?yīng)的核苷酸位置和 編碼蛋白功能的生物信息學(xué)分析結(jié)果如表1所示（與三欣卡辛生物合成不相關(guān)的基因僅顯 示了一部分）。以上實驗內(nèi)容表明，三欣卡辛的生物合成基因簇是通過同源序列克隆得到， 同時，三欣卡辛生物合成基因簇中的保守基因也可以用作同源探針或者其他形式的同源參 考序列來篩選與三欣卡辛類似的次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇。
[0131] 表1 :全序列功能分析
[0132]
[0133]
[0134]
[0135] 其中，"位置"一欄的數(shù)字表示SEQ ID NO: 1中對應(yīng)序列的核苷酸；數(shù)字從小到大， 表明該氨基酸序列是由SEQ ID NO: 1中對應(yīng)序列的核