于適當(dāng)體積的TE緩沖液（pH8. 0) 中。
[0183] 實(shí)施例2
[0184] PCR克隆三欣卡辛合成基因：
[0185] 50 μ L PCR體系的組成：
[0186]
[0187] PCR 程序：
[0188] Taq 酶
[0189] 循環(huán) I :94°C，3min，1 輪循環(huán)；
[0190] 循環(huán) 2 :94°C，30s ;55-65°C，30 ;72°C，lmin/kb ;35 輪循環(huán)；
[0191] 循環(huán) 3 :72°C，5-10min ;1 輪循環(huán)。
[0192] Primestar ：
[0193] 步驟 l:98°C，10s
[0194] 步驟 2 :58_65°C，15s
[0195] 步驟 3 :72°C，lmin_3min
[0196] 步驟1-3循環(huán)30輪
[0197] 步驟 4 :72°C，IOmin
[0198] 不同引物的PCR條件都是以上述條件為基礎(chǔ)進(jìn)行優(yōu)化的。
[0199] PCR以后，將預(yù)期大小的DNA條帶低熔點(diǎn)膠回收純化，并連接到PCR克隆載體 pGEM-TEasy載體中，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a，涂布在含有氨節(jié)青霉素（ampicillin，Amp)，異丙 基硫代 _β _D_ 半乳糖苷（isopropyl β -D-thiogalactoside，IPTG)和 5-溴 _4_ 氯 _3_ 口引 哚-D-半乳糖苷（5-Br-4-Cl-3-indole_i3 -D-galactoside，X_gal)的 LB 平板上進(jìn)行藍(lán) 白斑篩選，挑取白色克隆進(jìn)行鑒定。插入有預(yù)期大小DNA片段的質(zhì)粒測(cè)序。
[0200] 有時(shí)，引物兩端設(shè)計(jì)有酶切位點(diǎn)，可以克隆入合適的載體中，酶切鑒定或測(cè)序。
[0201] 實(shí)施例3核酸分子雜交
[0202] 1)地高辛DNA標(biāo)記：將待標(biāo)記的DNA用無菌水稀釋至總體積15 μ L，沸水浴中加 熱變性10分鐘，立即置于冰鹽浴中冷卻。接著加入2 μ L引物混合物，2 μ L dNTP混合物， 1 μ L酶，混合均勻后，37°C水浴約16小時(shí)。加入0. 8 μ L0. 8M EDTA (pH8. 0)以終止反應(yīng)，加 入2. 5 μ L4M LiCl混合均勻，再加入75 μ L預(yù)冷的無水乙醇沉淀標(biāo)記后的DNA，置于-80°C 沉降40分鐘。4°C，12000rpm離心20分鐘收集DNA，用預(yù)冷的70%乙醇洗滌DNA沉淀，真空 干燥后重新溶于50 μ L TE (ρΗ8· 0)中。
[0203] 2)菌落雜交（文庫(kù)篩選）的膜轉(zhuǎn)移：將保存于-80°C的基因文庫(kù)稍融，取50 μ L，用 450 μ L LB稀釋得到KT1的稀釋倍數(shù)，倍比稀釋得到10_2,10_3,10_ 4,10_5,10_6。300 μ L涂平板 (15cmX 15cm，平板為L(zhǎng)B/50 μ g/mL卡那霉素）。選取合適的比例，使每塊平板約1200-1500 個(gè)克隆。照選定的比例均勻涂布四塊平板，37°C培養(yǎng)過夜。根據(jù)平板的大小剪取尼龍膜，小 心地覆蓋于平板表面不要產(chǎn)生氣泡，做好位置標(biāo)記，1分鐘后取下尼龍膜置于干燥濾紙上， 干燥10分鐘直至菌落結(jié)合在尼龍膜上。原始的平板置于培養(yǎng)箱中4-5hr，使克隆重新生長(zhǎng) 作為原平板。將尼龍膜置于變性液（〇. 25MNa0H，I. 5M NaCl)飽和的濾紙上15分鐘（不要 浸過膜），轉(zhuǎn)移至中和液（1.0M Tris.HCl，1.5M NaCl，pH7. 5)飽和的濾紙上5分鐘。轉(zhuǎn)移 至2XSSC(20xSSC儲(chǔ)備液（Γ1) :NaCl，175. 3g，檸檬酸鈉，88. 2g，pH=7. 0)飽和的濾紙上自 然風(fēng)干。取下尼龍膜置于烘箱中，120°C固定45分鐘。常溫下于3XSSC/0. 1%SDS溶液中振 蕩洗滌3小時(shí)，以除去細(xì)胞碎片。
[0204] 3)預(yù)雜交和雜交：預(yù)熱雜交液（20mL/100cm2)至雜交溫度68°C，放入雜交尼龍膜， 輕輕振蕩并保溫30分鐘。將DIG標(biāo)記的DNA探針在沸水浴中變性5分鐘，立即置于冰鹽浴 中冷卻。冷卻后，將DNA探針與合適體積的DIG雜交液（2. 5mL/100cm2)混合均勻。去除預(yù) 雜交液并立即把DNA探針/DIG雜交液加入，輕輕振蕩保持雜交溫度64°C或68°C約16小 時(shí)。
[0205] 4)雜交后洗脫：室溫下用2XSSC/0. 1%SDS漂洗兩次，每次5分鐘。68°C，用 0.1 X SSC/0. 1%SDS振蕩漂洗兩次，每次15分鐘。
[0206] 5)顯色反應(yīng)和檢測(cè)：嚴(yán)緊洗脫后的尼龍膜在洗滌緩沖液（0.1 M馬來酸， 0· 15MNaCl，pH=7. 5, 0· 3%(v/v)吐溫20)中平衡1-5分鐘，接著在封閉緩沖液（封閉試劑以 10%的濃度溶于〇. IM馬來酸，0. 15M NaCl，pH=7. 5)中封閉30分鐘，然后在抗體中浸泡30分 鐘。用洗滌緩沖液漂洗尼龍膜兩次后，用檢測(cè)緩沖液（〇. IM Tris-HCl，0. lMNaCl，pH=9. 5)中 平衡2-5分鐘，最后將尼龍膜置于IOmL新配制的顯色溶液[NBT溶于70%DMF，濃度為70mg/ mL，BCIP溶于水，濃度為50mg/mL。用時(shí)IOmL顯色溶液中加45yL NBT，35yL BCIP]中，置 于黑暗中顯色。顯色合適后用去離子水漂洗以終止反應(yīng)。
[0207] 實(shí)施例4三欣卡辛生物合成基因簇的克隆
[0208] 提取Streptomyces bottropensis D0-45的總DNA,利用試劑盒進(jìn)行基因組文庫(kù) 構(gòu)建，構(gòu)建方法按照試劑盒的說明進(jìn)行。所使用的試劑盒為CopyControl? Fosmid Library Production Kit,購(gòu)自 EPICENTRE Biotechnologies 公司。
[0209] 如前文所述，根據(jù)KS α和KSe的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物（For (KS α ) :ATC ACC GTG GCC TGY TTY GAY GCS ATC-3'， Rev(KSP) :CC GGT GTT GAC SGS RTA GAA CCA NGC ;S=C 或 G, Y=C 或 T, R=A 或 G)進(jìn)行 PCR，從 Micromonospora sp. TP-A1304 基因組 DNA 中 擴(kuò)增得到了 I. Ikb的片段，克隆入pGEM-TEasy載體，測(cè)序驗(yàn)證其的確與II型PKS相關(guān)。用 地高辛標(biāo)記上述I. Ikb片段作為探針，通過原位雜交從基因組文庫(kù)中篩選陽性克隆，得到 黏粒CZM04-4 ;通過PCR分析該黏粒，發(fā)現(xiàn)該黏粒不僅包括KS基因，同時(shí)也包括UDP-葡萄 糖-4, 6-脫水酶的基因信息，再根據(jù)CZM04-4端基測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)其一端已經(jīng)包含基礎(chǔ)代謝 的基因信息（編碼膜蛋白和脂蛋白），另外一端則編碼信息為未知蛋白，故對(duì)其進(jìn)行全菌測(cè) 序。獲得其完整信息后經(jīng)體內(nèi)中斷實(shí)驗(yàn)證實(shí)其確實(shí)與三欣卡辛合成相關(guān)。根據(jù)該黏粒設(shè)計(jì) 探針進(jìn)行染色體步移，得到黏粒CZM05-09-2。由于這兩個(gè)黏粒還是未完全包含合成三欣卡 辛的信息，包括糖基轉(zhuǎn)移酶及氧甲基轉(zhuǎn)移酶的信息均不完全，故再在CZM05-09-2末端設(shè)計(jì) 探針進(jìn)行菌落原位雜交實(shí)驗(yàn)，最終獲得第三個(gè)黏粒CZM06-10-2,該三個(gè)黏粒進(jìn)行拼接后共 包含有102, 575bp的基因信息。包含了完整的三欣卡辛生物合成基因簇（圖2A)。3個(gè)相 互交疊的黏粒代表了三欣卡辛產(chǎn)生菌Streptomyces bottropensis DO-45基因組已測(cè)序的 102. 6kb DNA區(qū)域。如圖2B所示，三欣卡辛生物合成基因簇的基因組成；II PKS=II型聚酮 合酶基因 ；PKS initiation :聚酮合酶起始單元相關(guān)基因 ；Tailoring :后修飾基因 ；Sugar : 糖基合成相關(guān)基因；Regulation/resistance :調(diào)節(jié)/抗性基因 ；Unknown :無明顯作用的基 因 ；Beyond cluster:三欣卡辛基因簇外的基因。
[0210] 實(shí)施例5PCR_targeting技術(shù)（Red-ET基因打革巴）
[0211] I. PCR-targeting 片段制備
[0212] 以商業(yè)化的盒子為模板為模版（含Am抗性基因），PCR溶液組分同前，聚合酶采用 高保真酶primer star和Takara Taq DNA polymerase -起，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用瓊 脂糖凝膠電泳分離分析，與預(yù)期大小符合的條帶，Kit回收，溶于50 μ 1無
[0213] 酶雙蒸水。
[0214] PCR 程序
[0215] 循環(huán) I :94°C,2min，1 輪；
[0216] 循環(huán) 2 :94°C，45sec;5(TC，45sec;72°C，90sec ;10 輪；
[0217] 循環(huán) 3 :94°C，45sec;55t：，45sec;72°C，90sec ;15 輪；
[0218] 循環(huán) 4 :72°C，5min ;1 輪。
[0219] 2. 11. 2 電轉(zhuǎn)化
[0220] 將黏粒轉(zhuǎn)化入E. coli BW25114感受態(tài)細(xì)胞（含有pIJ790)，涂布于含有50yg/ mLAmp和30 μ g/mLCm的LB平板上30°C培養(yǎng)過夜。挑選取大腸桿菌單菌落接種入3ml含有 25 μ g/mLCm50 μ g/mLAmp的SOB中，30°C搖床培養(yǎng)過夜。接種500 μ L菌液至50mL新鮮的SOB 培養(yǎng)基（含25yg/mL Cm，50yg/mLAm)中，同時(shí)添加50(^1^]\^-阿拉伯糖，301：培養(yǎng)約2~ 3h至0D600~0. 6。3800rpm，4°C離心10min回收菌體，盡量棄掉上清，加入lmLIO%甘油，打 散沉淀，再加9mL10%甘油，搖勻。3800rpm，4?離心10min,棄掉上清，用10%甘油洗漆。重復(fù) 上面操作4次左右：3800rpm，4°C離心10min，盡量棄去上清，用100 μ L10%甘油重懸。與此 同時(shí)準(zhǔn)備電擊杯，洗凈后泡于70%的乙醇中，從乙醇中取出保存好的電擊杯，在超凈臺(tái)下用 無水乙醇洗滌兩次，最大風(fēng)力下吹干，置于冰上或冰箱預(yù)冷30min。將100 μ L感受態(tài)細(xì)胞與 1~2 μ LPCR產(chǎn)物混勻，加入預(yù)冷的0.1 cm的電擊杯中，電擊條件采用200 Ω，25uF，I. 8kv， 電擊時(shí)間4. 5~4. 9ms，立即加入1ml預(yù)冷的LB，37°C培養(yǎng)60min后；涂布于含有50μ g/ml Am和50 μ g/ml Cm的LB平板，37 ° C過夜培養(yǎng)。挑取單克隆接種至50 μ g/mlAm和50 μ g/ mlCm的液體LB中，而后抽提質(zhì)粒，溶于50μ1 TE溶液，再次轉(zhuǎn)化E.coli S17-1中進(jìn)行純 化，而后挑取單克隆接種，菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切或者PCR鑒定。
[0221] 實(shí)施例6三欣卡辛產(chǎn)生菌Streptomyces bottropensis D0-45基因敲除方法
[0222] (一）帶有Marker的基因置換突變株（以txn8為例）
[0223] (1)基因置換黏粒的構(gòu)建
[0224] 設(shè)計(jì)引物 Tg-ks8-f: ACTTCTCACCGATGGCCGATCGGCCACACGCACCATCAGATTCCGGGGATC CGTCGACC 和 Tg-ks8-R:GTACTTCCCTCGCGGATCAGCTCCACCGCGTGTCCGATCTGTAGGCTGGAGCTGCTT C，以Targeting盒子為模板擴(kuò)增得到I. 5kb左右的片段（兩端包含有39bp的同源臂），按 照實(shí)施例5的方法獲得包含有目標(biāo)缺失基因置換成Am抗性的黏粒，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 S17-1中，經(jīng)過PCR驗(yàn)證正確后，作為接合轉(zhuǎn)移的供體菌。
[0225] (2)通過接合轉(zhuǎn)移獲得基因置換單交換突變株
[0226] 從經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸桿菌（E. coli S17-1)培養(yǎng)平板上挑取單菌落接到試管中培養(yǎng) 過夜，吸取500 μ 1的菌液接到25ml LB中，置于37°C搖床中培養(yǎng)至OD6tltl為0. 4-0. 6。將菌 液離心沉淀，用35mL LB培養(yǎng)基洗滌兩次，然后用Iml的LB培養(yǎng)基重懸，作為供體菌。
[0227] 取凍存于-80°C、20% 甘油保存的鏈霉菌 Streptomyces bottropensis D0-45 的 孢子懸液500 μ L，用等體積的TES緩沖液洗兩次，重懸于等體積的TES緩沖液，50°C熱激 IOmin使孢子萌發(fā)。再加等體積的TSB，37°C溫育2-5hr。離心重懸于ImL LB中作為受體 菌。
[0228] 將不同濃度的受體細(xì)胞10 0 μ L與等體積的供體細(xì)胞混合直接涂布在含有 10mMMgC12的IWL-4或MS平板上，30°C培養(yǎng)12-18hr后，在每一平板的表面覆蓋含萘啶酮酸 (nalidixic acid,終濃度為50 μ g/mL)和Am抗生素的ImL無菌水。30°C培養(yǎng)5天以上挑 取接合子。接合子如果能夠在含有阿泊拉霉素50 μ g/ml的TSB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，則為目標(biāo)基 因被替換（至少已是單交換）的突變株。（圖7)
[0229] (3)基因置換雙交換突變株的獲得
[0230] 已經(jīng)搖濃的帶有Am抗性的TSB菌液，取IOul加入到無抗的TSB中（松弛培養(yǎng)）， 30°C培養(yǎng)24hr后，取l-5ul菌液經(jīng)過200ul無菌水的稀釋后涂在