一種異煙棒曲霉素c的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物堿類化合物的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種異煙棒曲霉素 C的制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)世界衛(wèi)生組織（WTO)估計(jì)，每天約5萬人死于感染性疾病。革蘭陽性菌（如葡 萄球菌和鏈球菌）是引起人類感染甚至導(dǎo)致死亡的主要致病菌。其中葡萄球菌可引起輕度 皮膚膿皰癥、呼吸道感染和膿毒癥等多種疾病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。肺炎鏈球菌主要引起 急性呼吸道感染，如中耳炎、咽炎、鼻竇炎和肺炎等。此外，肺炎鏈球菌和其他鏈球菌也 可引起皮膚感染、腦膜炎和膿毒癥，這些感染性疾病給人類帶來了極大的痛苦。目前針對(duì) 革蘭氏陽性菌感染的藥物主要為抗生素類藥物，如青霉素、頭孢類、紅霉素、喹諾酮類等藥 物。近年來致病菌的多重耐藥性已嚴(yán)重影響抗菌藥的臨床療效，革蘭氏陽性菌耐藥性問題 尤為突出，以葡萄球菌、鏈球菌和腸球菌的耐藥性最為常見和嚴(yán)重。如何克服抗生素耐藥 性，成為人們關(guān)注和研宄的熱點(diǎn)之一。如何更有效地解決這個(gè)問題，當(dāng)務(wù)之急就是尋找并 開發(fā)新型有效的抗菌藥。本發(fā)明旨在提供一種具有抗革蘭氏陽性菌活性的異煙棒曲霉素 C (Roquefortine C)，其結(jié)構(gòu)如式如下：
它是一種具有較強(qiáng)的革蘭氏陽性菌抑制活性的生物堿類化合物，可作為革蘭氏陽性菌 抑制劑用于由革蘭氏陽性菌感染所導(dǎo)致的疾病的治療，還可作為抑制革蘭氏陽性菌的低分 子生物探針，用于生命科學(xué)研宄，為進(jìn)一步研發(fā)新型抗菌藥提供了備選藥物。本發(fā)明從印度 洋深海沉積物來源的青霉菌Penicillium sp. Y32中，分離得到了異煙棒曲霉素 C，通過反 復(fù)實(shí)驗(yàn)、探索，得到了規(guī)?；a(chǎn)異煙棒曲霉素 C較佳的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作方便、產(chǎn)率高、 產(chǎn)品純度高的異煙棒曲霉素 C的制備方法。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種異煙棒曲霉素 C的制備方法， 其特征在于：包括如下步驟： 1)復(fù)蘇固體培養(yǎng)基的配制：每升水中下列各組分按重量百分比為：麥芽浸膏 I. 5~1. 8%、大豆蛋白胨0. 15~0. 35%、瓊脂I. 8~2. 3%，該培養(yǎng)基的初始pH值為5. 5~6. 0 ;在 生物安全柜中，將經(jīng)過滅菌后的復(fù)蘇培養(yǎng)基在溫度大于40°C時(shí)，倒入經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)皿中， 自然冷卻備用； 2) 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：每升水中下列各組分按重量百分比為：麥芽浸膏 I. 5~1. 8%、大豆蛋白胨0. 15~0. 35%，該培養(yǎng)基的初始pH值為5. 5~6. 0 ;將該培養(yǎng)基倒入燒 瓶中，封口、滅菌備用； 3) 菌種復(fù)蘇：取一定量的青霉菌Penicillium sp.Y32,將其接種到步驟1所述的復(fù)蘇 固體培養(yǎng)基上，放入25 °C~30 °C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)一至兩天； 4) 發(fā)酵培養(yǎng)：在生物安全柜中，將步驟3中在復(fù)蘇固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的菌種孢子，接 種到步驟2所述的含有液體培養(yǎng)基的燒瓶中，在溫度為25°C~30°C恒溫靜置培養(yǎng)25-35 天； 5) 過濾、萃取：將步驟4所得的菌液與菌絲體進(jìn)行過濾、分離； 取菌液，用1~2倍體積的乙酸乙酯，超聲萃取三次； 取菌絲體，先用80%丙酮水溶液浸泡2~4小時(shí)，超聲、機(jī)械破碎，過濾后的混合液蒸發(fā) 掉丙酮后，采用1~2倍體積的乙酸乙酯超聲萃取三次； 合并兩者的乙酸乙酯萃取物； 6) 粗制：將步驟5所得的乙酸乙酯萃取物進(jìn)行濃縮，與100-300目的硅膠拌樣；將拌樣 硅膠加到3倍體積的300-400目的硅膠柱層析上，依次使用二氯甲烷、60:1的二氯甲烷-甲 醇、30:1的二氯甲烷-甲醇三種溶劑進(jìn)行系統(tǒng)洗脫；將使用30:1的二氯甲烷-甲醇所得的 洗脫液進(jìn)行收集，并濃縮至固態(tài)，得到粗品； 7) 精制：將上述粗品使用甲醇進(jìn)行溶解、用濾膜過濾，濾液加載于高效液相色譜儀以一 定的流速，進(jìn)行分離純化，洗脫溶劑使用80:20的甲醇-水，從而得到異煙棒曲霉素 C。
[0005] 優(yōu)選的，步驟2)中，所述復(fù)蘇固體培養(yǎng)基中，上述麥芽浸膏1.6%、大豆蛋白胨 0. 2%、瓊脂 2%。
[0006] 優(yōu)選的，步驟2)中，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，上述麥芽浸膏1.6%、大豆蛋白胨 0. 2%〇
[0007] 優(yōu)選的，步驟6)中，所述拌樣硅膠為200目。
[0008] 優(yōu)選的，步驟7)中，所述高效液相色譜的流速為2~3 mL/min。
[0009] 優(yōu)選的，步驟7)中，所述濾膜為0. 45mm。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：1、本發(fā)明的培養(yǎng)基簡(jiǎn)單易得、成本低，青 霉菌Penicillium sp. Y32復(fù)蘇所需的時(shí)間僅需一、二天，比傳統(tǒng)培養(yǎng)基的復(fù)蘇時(shí)間至少 縮短兩天；配合較高的培養(yǎng)溫度（28°C)，真菌生長速度快、孢子活力高；在發(fā)酵培養(yǎng)中，選 用直接接種到液體培養(yǎng)基中，相比傳統(tǒng)的種子液培養(yǎng)，傳代的時(shí)間極大縮短，提高了工作效 率；本發(fā)明提供的發(fā)酵方法，簡(jiǎn)單易行。2、本發(fā)明相比文獻(xiàn)報(bào)道的普通分離方法，污染小、 效率高、產(chǎn)率高、純度高，可操作性強(qiáng)。具體為：（1)采用二氯甲烷取代氯仿，洗脫劑毒性減 小。（2)粗制僅需二種體系洗脫劑，步驟大大簡(jiǎn)化，精制米用恒梯度以甲醇-水（80 :20)洗 脫，促使操作簡(jiǎn)單，減少由于步驟繁瑣造成的樣品損失，提高了制備效率。（3)結(jié)合高效發(fā) 酵培養(yǎng)與簡(jiǎn)易分離步驟，比現(xiàn)有技術(shù)的產(chǎn)率提高了約5倍，即由6.8 yg/mL提高到33 yg/ mL。（4)結(jié)合高效液相色譜制備，目標(biāo)產(chǎn)物的純度高達(dá)99. 3%。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述： 實(shí)施例一 按照水：麥芽浸膏：大豆蛋白胨：瓊脂=100 :1. 6 :0. 2 :2的重量百分比，配制復(fù)蘇固體 培養(yǎng)基，使得其pH值為5. 5;將一定量的青霉菌Penicillium sp. Y32接種到上述復(fù)蘇 固體培養(yǎng)基上，在28°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2天；按照水：麥芽浸膏：大豆蛋白胨=100 :1. 6 : 〇. 2的重量百分比，配制液體培養(yǎng)液，使得其pH值為5. 5 ;取復(fù)蘇固體培養(yǎng)基上的青霉菌 Penicillium sp. Y32適量，將其接種到裝有上述液體培養(yǎng)液的三角瓶中，進(jìn)行為期30天的 恒溫28 °C的靜置培養(yǎng)。
[0012] 30天后，經(jīng)過過濾，先將與菌絲體相分離的發(fā)酵液亦即菌液，采用等體積的乙酸乙 酯將發(fā)酵液萃取三次，合并萃取液，獲得發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮至固態(tài)； 再將菌絲體先用80%丙酮水溶液浸泡4小時(shí)、機(jī)械破碎、水浴超聲提取60分鐘；經(jīng)三次 提取后，合并三次所得的菌絲體提取液；將該菌絲體提取液減壓濃縮至不含丙酮，得到的菌 絲體提取物，使用等體積的乙酸乙酯萃取三次，得到菌絲體提取物的乙酸乙酯萃取液；再將