一種don及乙?；痙on毒素的培養(yǎng)制備及提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種DON毒素及乙?；疍ON毒素的培養(yǎng)制備及提取純化方法，特別是涉及一種簡便有效培養(yǎng)禾谷鐮刀菌大型分生孢子的方法，以及從接種培養(yǎng)物中同時分離提取純化DON毒素及其乙?；苌锏姆椒?。
【背景技術(shù)】
[0002]由鐮刀菌引起的赤霉病(Fusarium head blight)是危害小麥、大麥、燕麥、玉米、水稻、黑麥等多種禾谷類作物的一種重要病害，廣泛分布于北美、歐洲和亞洲等溫暖潮濕地區(qū)，近年來隨著全球氣候變暖呈逐步蔓延之勢。農(nóng)作物在生長或儲備過程中均可感染鐮刀菌，不但造成作物產(chǎn)量下降，更重要的是產(chǎn)生的鐮刀菌毒素直接留存累積在禾谷類籽粒中，嚴重威脅人畜健康。
[0003]在我國，禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)是赤霉病的主要病原菌。禾谷鐮刀菌產(chǎn)生B族單端孢霉烯族毒素,其中以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)又名嘔吐毒素(vomitoxin, VT)為主。DON依靠其半職烯結(jié)構(gòu)作用于真核細胞蛋白質(zhì)翻譯過程的不同階段，抑制蛋白質(zhì)合成，破壞人畜的免疫系統(tǒng)，使中毒者出現(xiàn)腹瀉、嘔吐和頭暈等癥狀，是最主要的導(dǎo)致食物中毒的真菌毒素之一。目前，各國針對谷物及其制品中DON的含量制定了嚴格的限量標(biāo)準(zhǔn)，我國谷物中DON的限量標(biāo)準(zhǔn)為1.0mg/kg(lppm)。
[0004]DON毒素具有兩種乙?；a(chǎn)物，分別為3-乙?；撗跹└牭毒┐?3-Acetyldeoxynivalenol, 3-AcD0N)和15-乙?；撗跹└牭毒┐?15-Acetyldeoxynivalenol, 15-AcDON)。一般認為，乙酸化 DON 的毒性與 DON 相當(dāng)。亦有研究報道，產(chǎn)生3-AcDON的鐮刀菌具有更強的產(chǎn)孢率和生長速度，對麥類作物的危害更為嚴重，并且正在取代產(chǎn)生其他毒素的鐮刀菌，表現(xiàn)出更強的適應(yīng)性(Ward TJ et al，An adaptive evolut1nary shift in Fusarium head blight pathogen populat1nsis driving the rapid spread of more toxigenic Fusarium graminearum in NorthAmerica.Fungal Genet.B1l.2008,45:473-484)。因此，需重視 DON 乙?；a(chǎn)物的相關(guān)研究。
[0005]鑒于真菌毒素DON和乙酰化DON在小麥等谷物中普遍存在，繼而對人類和動物的安全造成嚴重威脅的現(xiàn)實，近年來，針對DON及DON相關(guān)毒素的分析檢測、體內(nèi)外毒性研究及安全性評價等己引起廣泛關(guān)注，這亦對于保證我國食品衛(wèi)生安全具有重要意義。
[0006]但是由于國內(nèi)DON標(biāo)準(zhǔn)品、參考品的制備尚屬空白，而且目前歐美多國遵循禁止向非澳大利亞公約組織國家出售毒素及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品的禁運規(guī)定，給國內(nèi)有關(guān)此類毒素的相關(guān)研究設(shè)置了較大障礙。因此，亟需研發(fā)一種簡便的、可有效制備獲得大量DON及乙酰化DON化合物的方法。
[0007]DON屬于倍半萜烯類化合物，具有較為復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，迄今為止尚未實現(xiàn)DON的化學(xué)全合成。一般而言，DON毒素系從菌株培養(yǎng)提取后制備純化而得。其中關(guān)鍵步驟之一為種子液的獲得，即通過培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量的大型分生孢子以作接種擴大培養(yǎng)之用。但采用傳統(tǒng)震蕩式培養(yǎng)時，菌絲的抱團生長會對孢子的產(chǎn)生造成極大限制，極其影響其后的接種效率。此外，DON適用的接種培養(yǎng)基分為固體(米飯或者麥粒)培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。一般認為，固體培養(yǎng)基產(chǎn)生DON的效率要優(yōu)于液體培養(yǎng)基，因此在DON毒素的制備純化過程中，固體培養(yǎng)基仍是首選。但是，采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時，由于小麥和大米中含有較豐富的蛋白質(zhì)和糖類等組分，導(dǎo)致DON毒素粗提液中往往存在較多的雜質(zhì)，進而導(dǎo)致了制備純化步驟較為繁瑣耗力，效率較低；而且，上述制備純化步驟是否適用于粗提物中的乙?；疍ON等相關(guān)毒素，尚未有相關(guān)報道述及。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于:針對目前DON毒素存在接種效率較低、制備純化步驟繁瑣以及效率低的實際問題，提供一種簡便高效的DON及其乙?；a(chǎn)物的大量培養(yǎng)制備及純化方法。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述步驟實現(xiàn):一種DON毒素及乙?；a(chǎn)物的大量培養(yǎng)制備及純化方法，是利用禾谷鐮刀菌產(chǎn)生DON毒素及乙酰化DON毒素，其特征之一在于:采用以液體培養(yǎng)基生成孢子，以固體培養(yǎng)基接種產(chǎn)毒；其特征之二在于:放置種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中加入玻璃珠，再行震蕩培養(yǎng)可限制菌絲的生長，優(yōu)先生成大型分生孢子；其特征之三在于:從毒素粗提液中，僅需通過硅膠柱一步分離洗脫，即可獲得純DON毒素，并采取一步結(jié)晶法進行結(jié)晶；其特征之四在于:從毒素粗提液中，采用硅膠柱層析法同時純化乙?；疍ON毒素。具體的實施步驟是:
[0010]a)將禾谷鐮刀菌經(jīng)活化，接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)瓶中放置有適當(dāng)數(shù)目及合適粒徑的玻璃珠，于25°C，200-250rpm搖床震蕩培養(yǎng)3_5天，獲得種子液；
[0011]所述“種子培養(yǎng)基”，是指能促進禾谷鐮刀菌分生孢子生成的液體培養(yǎng)基，譬如本發(fā)明實施例中采用的4%綠豆水培養(yǎng)基。
[0012]所述玻璃珠“適當(dāng)數(shù)目及合適粒徑”是指在震蕩培養(yǎng)中足以產(chǎn)生足夠大的剪切力，從而有效抑制菌絲抱團生長的玻璃珠的選擇條件，可依據(jù)培養(yǎng)瓶底面積及培養(yǎng)基體積進行調(diào)整。
[0013]b)種子液經(jīng)六層紗布過濾除去菌絲，用血球計數(shù)器對過濾液中的大型分生孢子進行計數(shù)；
[0014]c)接種合適數(shù)量的孢子至無菌米飯培養(yǎng)基中，20?25°C靜置培養(yǎng)，每天拍打瓶子底部防止培養(yǎng)基結(jié)塊，適宜天數(shù)后獲得固體培養(yǎng)物；
[0015]所述“合適數(shù)量的孢子”是指接種于米飯培養(yǎng)基中能產(chǎn)生最大產(chǎn)毒效率的孢子數(shù)目，可依據(jù)菌株不同進行相應(yīng)優(yōu)化，例如本發(fā)明實施例中比較每10g米飯培養(yǎng)基接種16?17孢子，最優(yōu)選16孢子數(shù)。
[0016]所述“適宜天數(shù)”是指根據(jù)培養(yǎng)時間-濃度曲線所選擇的培養(yǎng)時間，例如本發(fā)明實施例中的10?60天,最優(yōu)選30?40天。
[0017]d)毒素粗提液制備。分別采用70%甲醇和純甲醇溶液浸泡、超聲固體培養(yǎng)物，合并提取液，減壓蒸去甲醇，加入1/3體積的飽和氯化鈉水溶液，靜置Ih后去除沉淀，用乙酸乙酯萃取二次，將萃取所得的乙酸乙酯濃縮，得毒素的粗提取液；
[0018]e)濕法制備適宜規(guī)格的硅膠柱(20cmX2.5cm 1.d.)，將d)制備的毒素粗提液上樣，以二氯甲烷和四氫呋喃體積比為10: 3的混合洗脫液一步洗脫；
[0019]所述“適宜規(guī)格”是指硅膠柱的硅膠粒徑一般選擇100?300目，硅膠柱裝填的規(guī)格可以依據(jù)實驗需要選擇。
[0020]f)收集第30?80mL流份，用TLC方法檢測每管洗脫液中含有乙?；疍ON毒素的情況，將目標(biāo)流份合并蒸干后用正己烷提取3次，棄去正己烷相，剩余溶液濃縮至獲得棕紅色油狀物；
[0021]g)另干法制備適宜規(guī)格的硅膠柱(25cmX 1.0em 1.d.)，將f)中制備的棕紅色油狀物上樣，以正己烷和乙酸乙酯體積比為1:1的混合液常壓洗脫，保持流速大約為ImL/min,收集第適宜段流份，旋蒸至干，獲得產(chǎn)物呈淡黃色油狀物；
[0022]所述“適宜規(guī)格”是指硅膠柱的硅膠粒徑一般選擇100-300目，硅膠柱裝填的規(guī)格可以依據(jù)實驗需要選擇，
[0023]所述“適宜段流份”，是指需要通過TLC方法鑒別后，判斷收集何段的流份洗脫液。
[0024]h)上步g)中獲得的產(chǎn)物在乙酸乙酯和正己烷混合體系中結(jié)晶，抽濾后得白色晶體，即為純化的乙酰化DON;
[0025]i)經(jīng)e)步驟收集適宜段流份洗脫液，用TLC方法檢測每管洗脫液中含有DON毒素的情況；
[0026]所述“適宜段流份”，是指需要通過TLC方法鑒別后，判斷收集何段的流份洗脫液。
[0027]j)合并含有DON毒素的收集管并旋轉(zhuǎn)蒸干，溶解于少量的正己烷和乙醚體系中，進行結(jié)晶，獲得純化的DON毒素。
[0028]本發(fā)明的優(yōu)點在于:通過種子培養(yǎng)基中玻璃珠的引入，大大提高分生孢子的產(chǎn)生效率；
[0029]本發(fā)明的優(yōu)點還在于:改變常規(guī)多步驟分離洗脫的繁瑣方法，采用一步洗脫分段收集及簡單結(jié)晶法從毒素粗提取液中分別制備獲得DON毒素及乙?；疍ON毒素，由此提供了一種切實有效的、大量制備純化DON相關(guān)毒素的簡便方法。
【附圖說明】
[0030]圖1.DON及乙?；疍ON毒素的培養(yǎng)制備及提取純化流程圖
[0031]圖2.禾谷鐮刀菌ACCC31058粗毒的液相色譜-質(zhì)譜鑒定總離子流圖
[0032]a.DON和3’ Ac-DON的混合標(biāo)準(zhǔn)品
[0033]b.DON和15’ Ac-DON的混合標(biāo)準(zhǔn)品
[0034]c.禾谷鐮刀菌ACCC31058粗毒提取液
[0035]峰1:D0N 峰 2:3，Ac-DON 峰 3:15’ Ac-DON
[0036]圖3.DON的質(zhì)譜鑒定圖譜(電噴霧MS及MS/MS圖)
[0037]Mw296.1 ；m/z355.1 [M+CH3C00H-H] ^ ；m/z295.1 [Μ-ΗΓ ；m/z265.1 [M-CH2O-H] ^ ；
[0038]m/z247.1 [M-CH2O-H2O-H] ^ ；m/z217.1 [M-2CH20-H20_H] ^
[0039]圖4.DON 的 1H-NMR 圖譜
[0040]H2, 3.66 ;Η3，4.63 ;Η4，2.20 ;Η7，4.95 ；Η10, 6.79 ；Η11, 4.50 ；H13a, 3.14 ；13b,
3.25 ；Η14, 1.15 ；
[0041]H15a，3.66 ；H15b,3.98 ；Η16,1.92ppm
[0042]圖5.3’ Ac-DON的質(zhì)譜鑒定圖譜(電噴霧MS及MS/MS圖)
[0043]Mw338.1 ；m/z397.1 [M+CH3C00H-H]_ ；m/z383.1 [M+HCOOH-H] —；
[0044]m/z3