核苷酸，不僅具有較好的分離度和較短的分離時(shí)間，且靈敏度高，分離效果佳。在梯度洗脫時(shí)間為40min時(shí)，就能很好地完成對(duì)樣品的分離。
[0030]本發(fā)明步驟c中，對(duì)轉(zhuǎn)鹽后的產(chǎn)品濾液用截留分子量200的中空纖維膜納濾濃縮至100~150g/L，然后用真空冷凍干燥機(jī)凍干即可得到高純度的和高收益的凍干產(chǎn)品。
[0031]本發(fā)明中，流動(dòng)相流速:50-3000 mL/min，優(yōu)選地，流動(dòng)相流速為50-80 mL/min、400-500 mL/min或2500-3000 mL/min。本發(fā)明色譜柱，在增加流動(dòng)相流速時(shí)，氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸能快速分離，并具有較好分離效果。
[0032]本發(fā)明中，柱子直徑和長度為:5cmX 30cm、15cmX 30cm或30cmX 30cm。
[0033]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明。
[0034]實(shí)施例1
1.樣品處理:對(duì)酶催化反應(yīng)所得反應(yīng)液先后進(jìn)行微濾和納濾，微濾采用0.35 μ m的微濾膜過濾，其操作壓力為0.1Mpa，微濾用于除掉微生物，納濾采用截留分子量200的中空纖維膜將濾液濃縮至30-50g/L，收集濃縮液備用。
[0035]2.純化:
純化條件:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:5cmX30cm。流動(dòng)相:A相:用甲酸和氫氧化鈉配成20mM pH為3的緩沖鹽溶液；B相:乙醇。流速:50-80 mL/mino檢測波長:260 nm。梯度:B%:3%?15%(洗脫時(shí)間40 min)。進(jìn)樣量為 10-15go
[0036]純化過程:將濃縮后的樣品濾液加入磷酸或鹽酸調(diào)節(jié)pH至3-5，將色譜柱用30%以上的乙醇沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為10-15g樣品濾液。線性梯度洗脫40min，收集目的峰。
[0037]3濃縮及凍干:將純化后的濾液用納濾膜(截留分子量200的中空纖維膜)納濾濃縮至100~150g/L，然后用真空冷凍干燥機(jī)凍干即可得到純度大于99%的凍干產(chǎn)品，總收率可以達(dá)到90.3%ο
[0038]實(shí)施例2:
1.樣品處理:對(duì)酶催化反應(yīng)所得反應(yīng)液先后進(jìn)行微濾和納濾，微濾采用0.35 μ m的微孔濾膜過濾，其操作壓力為0.1Mpa，微濾用于除掉微生物，納濾采用截留分子量200的中空纖維膜將濾液濃縮至30-50g/L，收集濃縮液備用。
[0039]2.純化:
純化條件:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:15cmX30cm。流動(dòng)相:A相:用甲酸和氫氧化鈉配成20mM pH為4的緩沖鹽溶液出相:乙醇。流速:400-500 mL/mino檢測波長:260 nm。梯度:B%:3%?15%(洗脫時(shí)間40 min)。進(jìn)樣量為 80-100g。
[0040]純化過程:在濃縮液中加入磷酸或鹽酸調(diào)節(jié)pH至3-5，將色譜柱用30%以上的乙醇沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為80-100g樣品濾液。線性梯度洗脫40min，收集目的峰。
[0041]3.濃縮及凍干:將純化后的濾液用納濾膜(截留分子量200的中空纖維膜)納濾濃縮至100~150g/L，然后用真空冷凍干燥機(jī)凍干即可得到純度大于99%的凍干產(chǎn)品，總收率可以達(dá)到91.5%。
[0042]實(shí)施例3:
1.樣品處理:對(duì)酶催化反應(yīng)所得反應(yīng)液先后進(jìn)行微濾和納濾，微濾采用0.35 μ m的微孔濾膜過濾，其操作壓力為0.1Mpa，微濾用于除掉微生物，微濾除掉微生物，納濾采用截留分子量200的中空纖維膜將濾液濃縮至30-50g/L，收集濃縮液備用。
[0043]2.純化:
純化條件:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:30cmX 30cm。流動(dòng)相:A相:用甲酸和氫氧化鈉配成20mM pH為5的緩沖鹽溶液出相:乙醇。流速:2500-3000 mL/mino檢測波長:260 nm。梯度:B%:3%?15%(洗脫時(shí)間40 min)。進(jìn)樣量為400-500g。
[0044]純化過程:在濃縮液中加入20mM的四甲基氫氧化錢，將色譜柱用30%以上的乙醇沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為400-500g樣品濾液。線性梯度洗脫40min，收集目的峰。
[0045]3.濃縮及凍干:將純化后的溶液用納濾膜(截留分子量200的中空纖維膜)納濾濃縮至100~150g/L，然后用真空冷凍干燥機(jī)凍干即可得到純度大于99%的凍干產(chǎn)品，總收率可以達(dá)到91.2%。
[0046]通過上述實(shí)施例可知，采用反相高效液相色譜法純化氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，獲得的產(chǎn)品純度高達(dá)99%，收率高達(dá)90%以上，生產(chǎn)效率也比其他工藝提高了 I倍以上，大大降低了生產(chǎn)成本，符合市場對(duì)產(chǎn)量和價(jià)格的需求，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0047]可以理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種純化氧化型β -煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于，包括步驟: a、對(duì)酶催化反應(yīng)所得反應(yīng)液先后進(jìn)行微濾和納濾，收集濃縮液備用； b、然后在濃縮液中加入磷酸或鹽酸調(diào)節(jié)pH至3-5，用反相色譜柱為固定相，以緩沖鹽溶液為A相、乙醇為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化； C、對(duì)步驟b所得的濾液進(jìn)行納濾，最后用真空冷凍干燥機(jī)凍干。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于，所述步驟a中納濾采用的納濾膜為截留分子量200的中空纖維膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于，所述步驟a中濃縮液的濃度為30-50g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于，所述步驟b中反相色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于，所述步驟b中緩沖鹽溶液為甲酸和氫氧化鈉配成的濃度為20mM的緩沖鹽溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于，所述步驟b中緩沖鹽溶液的pH為3-5。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于，所述步驟b中A相和B相的體積比大于3:97,小于I。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于，所述步驟b中梯度洗脫時(shí)間為40min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于，所述步驟b中檢測波長為260 nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于，所述步驟c納濾濃縮后的溶液濃度為100~150g/L。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種純化氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步驟：將酶催化反應(yīng)所得反應(yīng)液用濾膜進(jìn)行微濾和納濾，收集濃縮液備用；然后將濃縮后的濾液加入酸調(diào)節(jié)濃縮液pH，用反相色譜柱為固定相，以緩沖鹽溶液為A相、乙醇為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化；將純化所得的溶液用濾膜納濾濃縮，然后用真空冷凍干燥機(jī)凍干。本發(fā)明使用反相高效液相色譜純化氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，使得氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸純度高、收益好，達(dá)到產(chǎn)業(yè)化要求。
【IPC分類】C07H19-207, C07H1-06
【公開號(hào)】CN104876994
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510255149
【發(fā)明人】傅榮昭, 戴柱, 張琦
【申請(qǐng)人】邦泰生物工程(深圳)有限公司
【公開日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2015年5月19日