一種利用混合菌群發(fā)酵木質(zhì)纖維素制備丁酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備丁酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]丁酸是一種重要的化工原料，廣泛用于化工產(chǎn)品、食品和藥品等行業(yè)。從物理化學(xué)角度，丁酸較乙酸更適合作為生產(chǎn)生物燃料的中間產(chǎn)物，因?yàn)槎∷峋哂懈L(zhǎng)的碳鏈和更低的ο/c比，能夠增加能量的密度。并且丁酸含量高的混合羧酸可以用來(lái)生產(chǎn)聚羥基丁酸酯(PHB)，其可以作為生物可降解塑料的原料。目前，丁酸的工業(yè)生產(chǎn)主要采用源于石油化工的正丁醛氧化法。與化學(xué)法相比，生物發(fā)酵法具有原料廣泛、環(huán)境友好和可持續(xù)等優(yōu)點(diǎn)。目前生物發(fā)酵產(chǎn)丁酸的研宄主要是以淀粉、糖蜜、乳清、馬鈴薯、纖維素水解物為原料。每年通過(guò)光合作用產(chǎn)生的生物質(zhì)約200億t，其中大部分為木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源。如果以木質(zhì)纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，不僅可保證相關(guān)產(chǎn)業(yè)的良性可持續(xù)發(fā)展，同時(shí)也可大幅降低原料成本，提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。已有的利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)丁酸的研宄中，一般是先利用纖維素酶將木質(zhì)纖維素水解為葡萄糖、木糖等單糖，再利用微生物發(fā)酵產(chǎn)丁酸。而纖維素酶的高成本被認(rèn)為是生物轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素的最大障礙。篩選和利用可以直接降解木質(zhì)纖維素的丁酸發(fā)酵菌群，則是攻克這一障礙的有效途徑之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種中溫條件下利用不明確混合菌群發(fā)酵木質(zhì)纖維素制備丁酸的方法，避免傳統(tǒng)方法中纖維素酶的大量使用，完成丁酸的中溫混合菌群發(fā)酵制備過(guò)程，降低制備成本。
[0004]本發(fā)明的一種利用混合菌群發(fā)酵木質(zhì)纖維素制備丁酸的方法，它是按照以下步驟進(jìn)tx的:
[0005]一、采用富集自牛糞、豬糞堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物為初始菌群，以PCS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以預(yù)處理稻草稻桿為原料，配制種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0006]二、將初始菌群接種于種子培養(yǎng)基，靜置進(jìn)行厭氧培養(yǎng)；
[0007]三、將步驟二培養(yǎng)后的菌群接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在140rpm轉(zhuǎn)速條件下進(jìn)行厭氧發(fā)酵，制備丁酸；
[0008]四、將步驟三制備的丁酸接種到槽式攪拌反應(yīng)器中，進(jìn)行丁酸發(fā)酵；
[0009]其中，步驟二中厭氧培養(yǎng)條件為:混合菌群培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時(shí)間為14d ;
[0010]步驟三中接種的種子發(fā)酵液的體積為10mL，厭氧培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時(shí)間為7d ；
[0011]步驟四中發(fā)酵液的體積為發(fā)酵系統(tǒng)體積的5%，厭氧培養(yǎng)條件為:35°C培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7?15d。
[0012]本發(fā)明包含以下有益效果:
[0013]本發(fā)明所采用的混合菌群富集自牛糞、豬糞堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物，以PCS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以預(yù)處理稻草秸桿為原料，其主要步驟如下:
[0014]A、將混合菌群接種于種子培養(yǎng)基，進(jìn)行厭氧培養(yǎng)；
[0015]B、將步驟A培養(yǎng)的混合菌群接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧液態(tài)發(fā)酵，制備丁酸；
[0016]本發(fā)明采用預(yù)處理秸桿為原料，大幅降低原料成本；利用菌群中的微生物產(chǎn)生纖維素酶，避免商業(yè)酶制劑帶來(lái)的高昂成本；利用篩選的菌群，降低中間產(chǎn)物對(duì)纖維素酶活性的抑制。本發(fā)明使用農(nóng)業(yè)廢棄秸桿為原料進(jìn)行丁酸的生物發(fā)酵制備，對(duì)資源的再生利用及無(wú)污染新資源的開(kāi)發(fā)都具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1 丁酸發(fā)酵裝置。
【具體實(shí)施方式】
[0018]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式的一種利用混合菌群發(fā)酵木質(zhì)纖維素制備丁酸的方法，它是按照以下步驟進(jìn)行的:
[0019]—、采用富集自牛糞、豬糞堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物為初始菌群，以PCS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以預(yù)處理稻草稻桿為原料，配制種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0020]二、將初始菌群接種于種子培養(yǎng)基，靜置進(jìn)行厭氧培養(yǎng)；
[0021]三、將步驟二培養(yǎng)后的菌群接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在140rpm轉(zhuǎn)速條件下進(jìn)行厭氧發(fā)酵，制備丁酸；
[0022]四、將步驟三制備的丁酸接種到槽式攪拌反應(yīng)器中，進(jìn)行丁酸發(fā)酵；
[0023]其中，步驟二中厭氧培養(yǎng)條件為:混合菌群培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時(shí)間為14d ;
[0024]步驟三中接種的種子發(fā)酵液的體積為10mL，厭氧培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時(shí)間為7d ；
[0025]步驟四中發(fā)酵液的體積為發(fā)酵系統(tǒng)體積的5%，厭氧培養(yǎng)條件為:35°C培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7?15d。
[0026]本實(shí)施方式步驟一中所述的初始菌群篩選過(guò)程為:將采集的樣品置于以水稻秸桿為碳源的富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，在富集培養(yǎng)基中添加一片濾紙條作為指示物，以濾紙條完全崩解為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)5個(gè)月(淘汰源于沼氣渣、水溝底泥、灌木叢土壤和腐葉的富集培養(yǎng)物，保留源于牛糞、豬糞堆肥、玉米地土壤、和腐木的富集培養(yǎng)物)，然后將第17代(即培養(yǎng)5個(gè)月)的牛糞、玉米地土壤和腐木富集培養(yǎng)物以及第20代(即培養(yǎng)5個(gè)月)的豬糞堆肥富集培養(yǎng)物等比例混合，然后以水稻秸桿為碳源的富集培養(yǎng)基作為傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)3個(gè)月，即得初始菌群。這5個(gè)混合菌群的纖維素降解能力趨于穩(wěn)定，并最終進(jìn)入基于丁酸發(fā)酵能力的復(fù)篩。
[0027]對(duì)個(gè)篩選的初始菌群的液相發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)試，其中，源于牛糞、豬糞堆肥、玉米地土壤和腐木組合的混合菌群丁酸產(chǎn)量最高，為6.0g/L同時(shí)丁酸比例也最高，為75.4%。
[0028]本實(shí)施方式所述的初始菌群包含:梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、擬桿菌屬(Bacteroides)和顫螺旋菌屬(Oscillospira)。
[0029]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟一中所述的初始菌群包含以下菌株:纖維素降解菌、半纖維素降解菌、丁酸發(fā)酵菌、乙酸發(fā)酵菌和其它產(chǎn)酸發(fā)酵菌；
[0030]其中，纖維素降解菌包括:化糖梭狀芽胞桿菌(Clostridium saccharolyticum)、多糖所裝芽抱桿菌(Clostridium polysaccharolyticum)、嗜糖假單胞菌(Pelomonassaccharophila)、纖維化纖維單胞菌(Cellulosimicrobium cellulans)和 Clostridiumphytofermentans ；
[0031]半纖維素降解菌包括:Bacteroidesgraminisolvens、Clostridiumxylanolyticum、和 Ruminobacillusxylanolyticum ；
[0032]氨基酸降解菌包括:Aminobacteriumcolombiense 和 Proteiniphilumacetatigenes ；
[0033]丁酸發(fā)酵菌包括:柔嫩梭菌(Clostridium Iepturn)和 Roseburia intestinali ；
[0034]乙酸發(fā)酵菌包括:Clostridiumhathewayi 和 Bacteroides oleiciplenus ；
[0035]其它產(chǎn)酸發(fā)酵菌包括:0scillibactervalericigenes、Clostridialesbacterium>Bacteroidetes bacterium 和 Sedimentibacter sp。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0036]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟一中的種子培養(yǎng)基是以PCS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配置的種子培養(yǎng)基，以預(yù)處理稻草秸桿為原料，其配制方法為:在IL培養(yǎng)基中加入:10g預(yù)處理過(guò)的稻草、5g蛋白胨、Ig酵母粉、5g NaCl、2g CaCCVfP 0.5g半胱氨酸；通入氮?dú)?0分鐘，以保持培養(yǎng)基厭氧狀態(tài)，密封，115°C滅菌20分鐘。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0037]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟一中的發(fā)酵培養(yǎng)基是為基礎(chǔ)配置的種子培養(yǎng)基，以預(yù)處理稻草秸桿為原料，其配制方法為:在IL培養(yǎng)基中加入:20g預(yù)處理過(guò)的稻草、5g蛋白胨、Ig酵母粉、5g NaCl、2g CaCOjP 0.5g半胱氨酸；通入氮?dú)?0分鐘，以保持培養(yǎng)基厭氧狀態(tài)，密封，115°C滅菌20分鐘。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0038]本
【發(fā)明內(nèi)容】
不僅限于上述各實(shí)施方式的內(nèi)容，其中一個(gè)或幾個(gè)【具體實(shí)施方式】的組合同樣也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。
[0039]通過(guò)以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果:
[0040]實(shí)施例1
[0041]1、配制種子培養(yǎng)基
[0042]種子液體培養(yǎng)基具體配制方法如下:
[0043]在IL培養(yǎng)基中加入:10g NaOH預(yù)處理過(guò)的稻草，5g蛋白胨，Ig酵母粉，5g NaCl,2gCaC03，0.5g半胱氨酸。通入氮?dú)?0分鐘，以保持培養(yǎng)基厭氧狀態(tài)。每150mL血清瓶中裝10mL培養(yǎng)基，密封，115°C滅菌20分鐘。培養(yǎng)基配制，接種，取樣均在厭氧條件下進(jìn)行。
[0044]2、配制發(fā)酵培養(yǎng)基
[0045]發(fā)酵培養(yǎng)基具體配制方法如下:
[0046]在IL培養(yǎng)基中加入:20g NaOH預(yù)處理過(guò)的稻草，5g蛋白胨，Ig酵母粉，5g NaCl,2gCaC03，0.5g半胱氨酸。通入氮?dú)?0分鐘，以保持培養(yǎng)基厭氧狀態(tài)。每500mL血清瓶中裝200mL培養(yǎng)基，密封，115°C滅菌20分鐘。培養(yǎng)基配制，接種，取樣均在厭氧條件下進(jìn)行。
[0047]3、發(fā)酵工藝
[0048](I)采用富集自牛糞、豬糞堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物為初始菌群，以PCS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以預(yù)處理稻草稻桿為原料，配制種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0049]其中，步驟一中所述的初始菌群篩選過(guò)程為:將采集的樣品置于以水稻秸桿為碳源的富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，在富集培養(yǎng)基中添加一片濾紙條作為指示物，以濾紙條完全崩解為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)5個(gè)月(淘汰源于沼氣渣、水溝底泥、灌木叢土壤和腐葉的富集培養(yǎng)物，保留源于牛糞、豬糞堆肥、玉米地土壤、和腐木的富集培養(yǎng)物)，然后將第17代(即培養(yǎng)5個(gè)月)的牛糞、玉米地土壤和腐木富集培養(yǎng)物以及第