一種使用兩種菌株藕合發(fā)酵實(shí)現(xiàn)丁二酸高產(chǎn)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 一種使用兩種菌株截合發(fā)酵實(shí)現(xiàn)下二酸高產(chǎn)的方法，本發(fā)明涉及使用兩種菌株， 兩個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)高效利用纖維素水解液中的還原糖組分，實(shí)現(xiàn)下二酸高產(chǎn)的方法，屬于生物 工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國(guó)北方的玉米枯桿和南方的稻谷枯桿、甘藏渣等是非常優(yōu)良的纖維素資源。盡 管，近幾年來(lái)，學(xué)術(shù)界對(duì)于纖維素的預(yù)處理，酶解糖化等工藝的研究日臻成熟，但是目前，真 正使用纖維素水解糖大規(guī)模制備化學(xué)物質(zhì)還處在初級(jí)階段。
[0003] 該其中有一個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題，即不管纖維素是采用何種方式的預(yù)處理方法，例如酸 解、堿解和蒸汽爆破或幾種方法的組合等方法；再使用多種酶的組合進(jìn)行酶解，例如纖維素 酶，木糖酶，果糖酶，葡聚糖酶，果膠酶，半纖維素酶等多種酶及其組合，而纖維素的水解液 中總會(huì)有20 wt°/cK30wt%的五碳水解糖(戊糖)，該是大部分微生物難W利用的，特別是目前 為學(xué)界熟練應(yīng)用的基因工程菌。如何使基因工程菌再具備一條能夠利用戊糖的代謝途徑是 目前學(xué)術(shù)界重點(diǎn)研究的課題。
[0004] 然而，許多基于天然菌株篩選的細(xì)菌，例如可W代謝產(chǎn)生下二酸的玻巧桿菌CGMCC 1593就可W輕松的利用戊糖進(jìn)行下二酸的代謝，而CGMCC 1593的原始菌株恰恰是從食草 動(dòng)物的消化道里提取的。
[0005] 基因工程菌存在著諸多的優(yōu)勢(shì)，例如代謝產(chǎn)物的單一選擇性，葡萄糖利用率遠(yuǎn)高 于天然菌株，發(fā)酵效率遠(yuǎn)高于天然菌株。CN102634474B (申請(qǐng)?zhí)?01210094742. 6)披露的 嗜己醜己酸棒桿菌（仿/yne知YF/ A 7t/WCTCC NO ;M2012041, 是一株典型的可W高產(chǎn)下二酸的基因工程菌，發(fā)酵性能比較如下表：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種使用兩種菌株藕合發(fā)酵實(shí)現(xiàn)丁二酸高產(chǎn)的方法，其特征在于利用產(chǎn)丁二酸的基 因工程菌CCTCC NO :M2012041和篩選自野生菌的放線桿菌CGMCC 1593兩個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)藕合 代謝，提高纖維素水解糖中葡萄糖和戊糖的利用率，同時(shí)兼顧了兩種菌各自的優(yōu)勢(shì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用兩種菌株藕合發(fā)酵實(shí)現(xiàn)丁二酸高產(chǎn)的方法，其特征在于 步驟為： (1) 纖維素水解糖的制備 根據(jù)傳統(tǒng)的制備纖維素水解液的方法制備葡萄糖和戊糖混合物，本發(fā)明中以甘蔗渣作 為纖維素原料，其組成控制為纖維素及半纖維素含量為18%，木質(zhì)素含量為12%，水分含量 70%，產(chǎn)自廣西； 纖維素水解液制備后，其中葡萄糖及戊糖在總糖含量中的比例分別控制為70%及30% ; (2) 基因工程菌CCTCC NO :M 2012041發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，用去離子水配制； 感受態(tài)培養(yǎng)基：甘氨酸30 g/L，Tween-80 I g/L，用去離子水配制； 活化培養(yǎng)基LBHIS:酵母粉2.5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，腦心浸液18.5 g/L， 山梨醇91 g/L，用去離子水配制； 種子培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基中添加5 g/L葡萄糖； 菌體培養(yǎng)基：葡萄糖 25 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，MgSO4 ·7Η20 0.6 g/L，F(xiàn)eSO4 5 mg/L，硫 胺素0. 2 mg/L，尿素2. 5 g/L，玉米楽10 g/L，生物素0. 2 mg/L，用去離子水配制； 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：K2HP04 0· 5 g/L，KH2PO4 0· 5 g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5 g/L，F(xiàn)eSO4 6 mg/L， MnSO4 4.2 mg/L，生物素0.2 mg/L，硫胺素0.2 mg/L，用去離子水配制； 種子于種子培養(yǎng)基中30°C、200 r/min下耗氧培養(yǎng)24 h;然后以5% V/V的接種量接 于菌體培養(yǎng)基中，30°C、200 r/min下耗氧培養(yǎng)16 h;培養(yǎng)好的菌體在4000r/min下離心富 集，以干重20 g/L的菌體濃度懸浮于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，30°C、200 r/min下恒溫振蕩5h; 恒溫振蕩5h后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基在4000r/min的條件下離心后，富集下層菌體，并以干重 20 g/L的菌體濃度加到纖維素水解液中，纖維素水解液總糖100g/L，葡萄糖控制為70g/L， 戊糖控制為30g/L，轉(zhuǎn)化40h后，丁二酸含量66. 5g/L ; (3) 放線桿菌CGMCC 1593發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵 第二種子培養(yǎng)基：蛋白胨5g/L，玉米漿20g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氫鉀I. 5g/L，磷酸 氫二鈉 I. 5g/L，酵母膏5g/L，用去離子水配制； 發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨5g/L，玉米漿10g/L，葡萄糖25g/L，磷酸二氫鉀2. 5g/L，磷酸氫二 鈉2. 5g/L，酵母膏5g/L，乙酸鈉 l~5g/L，用去離子水配制； 種子一級(jí)為T(mén)SB培養(yǎng)液，培養(yǎng)14h后接于第二種子培養(yǎng)基中，接種量4%，種子培養(yǎng)達(dá)到 7h后，將培養(yǎng)液接入?yún)捬醢l(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵罐中，接種量10%，發(fā)酵過(guò)程中使用碳酸氫鈉溶液 維持發(fā)酵系統(tǒng)的pH值為5. 5~6. 5,溫度為37~39°C，直到體系中葡萄糖含量降低至5g/L ; CGMCC 1593發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵液量為步驟（2)基因工程菌CCTCC NO :M 2012041菌種的 發(fā)酵系統(tǒng)發(fā)酵液量的15%~30% ; 在CCTCC NO :M 2012041菌種的發(fā)酵系統(tǒng)將葡萄糖消耗殆盡后，將發(fā)酵液升溫至 60~70°C，停留時(shí)間為30min，使體系中的CCTCC NO :M 2012041菌種徹底失活；將CGMCC 1593發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵液接入CCTCC NO :M 2012041菌種發(fā)酵罐中，維持發(fā)酵系統(tǒng)的pH值為 5. 5~6. 5,溫度為37~39°C，24h后，體系中還原糖含量降低至5g/L ; 發(fā)酵液中還原糖含量、丁二酸含量均使用液相色譜測(cè)定，總的發(fā)酵體系中葡萄糖含量 為<2g/L，戊糖含量<2g/L，綜合糖酸轉(zhuǎn)化率>90%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的使用兩種菌株藕合發(fā)酵實(shí)現(xiàn)丁二酸高產(chǎn)的方法，其特征在于 步驟（3)放線桿菌CGMCC 1593發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中使用碳酸氫鈉溶液維持發(fā)酵系 統(tǒng)的pH值為6. 0~6. 2,溫度為37~39°C，直到體系中葡萄糖含量降低至5g/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的使用兩種菌株藕合發(fā)酵實(shí)現(xiàn)丁二酸高產(chǎn)的方法，其特征在于 步驟（3)放線桿菌CGMCC 1593發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵，CGMCC 1593發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵液量為基因工 程菌CCTCC NO :M 2012041菌種的發(fā)酵系統(tǒng)發(fā)酵液量的15%~20%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的使用兩種菌株藕合發(fā)酵實(shí)現(xiàn)丁二酸高產(chǎn)的方法，其特征在 于步驟（3)放線桿菌CGMCC 1593發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵，將CGMCC 1593發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵液接 入CCTCC NO :M 2012041菌種發(fā)酵罐中，維持發(fā)酵系統(tǒng)的pH值控制在6. 0~6. 2,溫度為 37~39°C，24h后，體系中還原糖含量降低至5g/L。
【專利摘要】一種使用兩種菌株藕合發(fā)酵實(shí)現(xiàn)丁二酸高產(chǎn)的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用產(chǎn)丁二酸的基因工程菌CCTCC NO：M2012041和篩選自野生菌的放線桿菌CGMCC 1593兩個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)藕合代謝，工藝分三步：1、根據(jù)傳統(tǒng)的制備纖維素水解液的方法制備葡萄糖和戊糖混合物，2、基因工程菌CCTCC NO：M 2012041發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵，3、放線桿菌CGMCC 1593發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵?；诨蚬こ叹鶦CTCC NO：M 2012041在發(fā)酵系統(tǒng)中利用纖維素水解糖中的葡萄糖，而天然菌株CGMCC 1593在發(fā)酵系統(tǒng)中利用纖維素水解糖中的戊糖，兩個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)藕合代謝，提高纖維素水解糖中葡萄糖和戊糖的利用率，同時(shí)兼顧了兩種菌各自的優(yōu)勢(shì)。
【IPC分類】C12R1-15, C12P7-46, C12R1-01
【公開(kāi)號(hào)】CN104630291
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510110556
【發(fā)明人】呂濤
【申請(qǐng)人】呂濤
【公開(kāi)日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年3月13日