一種堿性木聚糖酶的高密度發(fā)酵生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)堿性木聚糖酶的方法，尤其是一種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)堿性木聚糖酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]木聚糖廣泛存在于自然界，其含量僅次于纖維素，約占植物干重的15-30%，木聚糖酶由木糖經(jīng)糖苷鍵鏈接形成主鏈，并且由阿拉伯糖、乙酰基、葡萄糖醛酸、干樓堂等復(fù)雜側(cè)鏈組成。因此，木聚糖酶具有十分重要的工業(yè)應(yīng)用價值，在飼料、紡織、食品、造紙以及生物能源行業(yè)具有重要的應(yīng)用價值。堿性木聚糖酶能夠應(yīng)用于造紙行業(yè)處理紙漿，降低漂白時候氯的用量，減少了環(huán)境污染的風(fēng)險。
[0003]嗜鹽菌Gracilibacillus imrinus 一種中度嗜鹽菌，其最佳生長pH為8.5,生長需要氯化鈉的存在，生長范圍為l_20%Nacl，我們實驗證明，在木聚糖誘導(dǎo)的條件下其能夠包內(nèi)產(chǎn)生堿性木聚糖酶。
[0004]但目前木聚糖酶多為酸性木聚糖酶，有少數(shù)產(chǎn)堿性木聚糖酶也存在著一定的問題,例如產(chǎn)量不高,并且由于細菌產(chǎn)木聚糖酶為胞內(nèi)酶,需要破碎細胞也是影響木聚糖酶生產(chǎn)的一個主要問題，因此，開發(fā)高效生產(chǎn)堿性木聚糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法對工業(yè)應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種通過海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)堿性木聚糖酶的方法。
[0006]本發(fā)明利用嗜鹽菌來生產(chǎn)堿性木聚糖酶，相比其他生產(chǎn)方法，其中優(yōu)點是破壁容易，由于嗜鹽菌細胞釋放到淡水中的時候，滲透壓的改變造成細菌破壁死亡，胞內(nèi)物質(zhì)就釋放到溶液當(dāng)中。本方法生產(chǎn)堿性木聚糖酶工藝較為簡單，成本較低。
[0007]實現(xiàn)本發(fā)明目的的一種通過海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)堿性木聚糖酶的方法，包括以下步驟。
[0008](I)將能夠產(chǎn)四氫嘧啶羥化酶的海洋微生物菌種接種在試管中活化18_26h，然后接種到搖瓶中擴大培養(yǎng)。
[0009](2)將搖瓶中的菌種接種到種子罐擴大培養(yǎng)，接種量為3-8%，然后種子罐培養(yǎng)20-24h后以5-10%的接種量接入發(fā)酵罐發(fā)酵。
[0010](3)發(fā)酵罐發(fā)酵過程中流加木聚糖和氯化銨作為碳氮源，發(fā)酵28-36小時后海洋微生物產(chǎn)酶結(jié)束。
[0011](4)將發(fā)酵液離心收集細胞然后將收集到的濕細胞加入為其20倍的水中釋放2-10分鐘，然后離心，收集液體，即為粗酶液，根據(jù)用途將粗酶液進一步純化分離結(jié)晶。
[0012]實現(xiàn)本發(fā)明所用的海洋微生物為來自德國菌種保藏中心的Gracilibacillusmarinus DSM 23372τ?！揪唧w實施方式】
[0013] 實施例1
(1)菌種活化，選用德國菌種保藏中心的/feJofflmasdoflgaieDSM2581τ作為發(fā)酵菌種，選用營養(yǎng)培養(yǎng)基作為試管和三角瓶培養(yǎng)的活化培養(yǎng)基，比例如下(g/L):5g酵母膏，5g蛋白胨，0.5M NaCl, pH調(diào)整到8.5。試管裝液量6ml，500ml錐形瓶裝液量10ml ；
(2)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)，麩皮10g，玉米粉5g，豆柏粉，10g，木聚糖lg，硫酸鎂0.0lg,硫酸亞鐵，0.005g，2M NaCl，pH調(diào)整到8.5;
(3)將保存于-80度冰箱的種子取出到試管中活化20h，240轉(zhuǎn)/秒搖床培養(yǎng)。然后接種于錐形瓶中，240轉(zhuǎn)/秒搖床搖瓶培養(yǎng)24h ；
(4)將搖瓶培養(yǎng)的種子接入35升種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20h后接種到300升發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵36h，發(fā)酵過程中流加木聚糖和氯化銨作為碳氮源；
(5)將步驟四得到的發(fā)酵液通過高速離心機10000轉(zhuǎn)離心收集菌體，然后將菌體置入儲藏罐加入20倍水，攪拌2-5分鐘，離心收集液體即為粗酶液。粗酶液通過硫酸銨沉淀收集，然后進一步純化為目的酶制劑。
【主權(quán)項】
1.一種堿性木聚糖酶的高密度發(fā)酵方法，包括以下步驟: (1)將能夠產(chǎn)四氫嘧啶羥化酶的海洋微生物菌種接種在試管中活化18-26h，然后接種到搖瓶中擴大培養(yǎng)； (2)將搖瓶中的菌種接種到種子罐擴大培養(yǎng),接種量為3-3%，然后種子罐培養(yǎng)20-24h后以5-10%的接種量接入發(fā)酵罐發(fā)酵； (3)發(fā)酵罐發(fā)酵20小時后將發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中鹽濃度提高到23%，然后持續(xù)發(fā)酵10-15小時，然后海洋微生物產(chǎn)酶結(jié)束； (4)將發(fā)酵液離心收集細胞然后將收集到的濕細胞加入為其20倍的水中釋放2-10分鐘，然后離心，收集液體，即為粗酶液，根據(jù)用途將粗酶液進一步純化分離結(jié)晶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)堿性木聚糖酶的方法，其特征在于:所述海洋微生物為能夠產(chǎn)堿性木聚糖酶的嗜鹽菌Greicilibeicillus marinus。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種從海洋微生物中經(jīng)過高密度發(fā)酵生產(chǎn)堿性木聚糖酶的方法，將能夠產(chǎn)堿性木聚糖酶的海洋微生物菌種活化，然后經(jīng)過搖瓶擴大，以3-5%的接種量接到種子罐，然后以5-10%的接種量從種子罐接種到發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵，發(fā)酵過程中流加木聚糖糖和氯化銨作為碳氮源，持續(xù)發(fā)酵28-36h，發(fā)酵液通過高速離心機收集菌體細胞，然后將離心收集到的濕細胞加入重量為其20倍的水中釋放2-10分鐘，然后離心，收集液體，即為粗酶液。然后根據(jù)需要進一步純化制備成不同純度和活性的酶制劑。
【IPC分類】C12R1-01, C12N9-42
【公開號】CN104560915
【申請?zhí)枴緾N201310472081
【發(fā)明人】朱道辰, 陳焱, 朱淑靜, 洪好
【申請人】鎮(zhèn)江拜因諾生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月11日