纖維細(xì)胞中特異表達(dá)的蛋白質(zhì)CYP734A1 like-1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及纖維細(xì)胞中特異表達(dá)的蛋白質(zhì)CYP734A1 Iike-I及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 棉花是世界上主要的纖維作物之一。棉花纖維細(xì)胞是棉花胚珠外珠被表皮細(xì)胞經(jīng) 分化突起和極性伸長(zhǎng)而成的單細(xì)胞。其生長(zhǎng)發(fā)育過程分為四個(gè)既明顯區(qū)分又有所重疊的 時(shí)期：纖維細(xì)胞起始期、纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)期、次生壁增厚期和脫水成熟期。每個(gè)時(shí)期都有各自 的特點(diǎn)，但相鄰發(fā)育時(shí)期又有所重疊。纖維發(fā)育的每個(gè)時(shí)期對(duì)纖維的產(chǎn)量和/或品質(zhì)都有 影響，纖維的分化起始決定了單粒胚珠中纖維的數(shù)量，纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)速率和持續(xù)時(shí)間主要 決定了纖維的長(zhǎng)度，次生壁沉積的方式和持續(xù)時(shí)間主要決定了成熟纖維的強(qiáng)度和次生壁厚 度。纖維伸長(zhǎng)期是（初生壁合成期）從開花當(dāng)天開始，可以持續(xù)到開花后25天（2OTPA)，主 要進(jìn)行細(xì)胞極性伸長(zhǎng)和初生細(xì)胞壁的合成，這時(shí)期的纖維伸長(zhǎng)速率和持續(xù)時(shí)間決定纖維的 最終長(zhǎng)度，陸地棉纖維長(zhǎng)徑比可達(dá)1000-3000。但迄今為止，我們對(duì)調(diào)控其發(fā)育過程的分子 機(jī)制仍知之甚少。
[0003] 由于棉花纖維細(xì)胞是一個(gè)特殊的細(xì)胞，其發(fā)育過程中必定有特殊的基因表達(dá)和相 關(guān)調(diào)控機(jī)制。因此篩選纖維細(xì)胞特異表達(dá)的基因成為棉花纖維分子生物學(xué)研宄的熱點(diǎn)。通 過CDNA文庫(kù)差示篩選、CDNA代表性差異分析、抑制差減雜交和mRNA差異顯示技術(shù)，以及近 年來發(fā)展而成的基因芯片技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)等，克隆和分析了纖維中特異或優(yōu)勢(shì)表達(dá) 基因。John和Crow于1992年首次通過cDNA文庫(kù)差異篩選，克隆了纖維發(fā)育早期特異表達(dá) 的 E6 基因 [John M E, Crow L J. 1992. Gene expression in cotton (Gossypium hirsutum L.) fiber :Cloning of the mRNAs. Proc Natl Acad Sci USA，89 (13) :5769-5773].利用 同樣的方法，Rinehart等（1996)分離到了纖維發(fā)育中后期特異表達(dá)基因 FbL2A[Rinehart J A，Petersen M W，John M E. 1996. Tissue specific and developmental regulation of cotton gene FbL2A. Plant Physiology, 112 (3): 1331-1334]。近年來，纖維特異或優(yōu)勢(shì) 表達(dá)的微管蛋白基因、伸展蛋白基因、脂轉(zhuǎn)移蛋白基因等被相繼克隆和分析[呂少溥，王 旭靜，唐巧玲，等.2014.棉纖維特異基因及其特異啟動(dòng)子的研宄進(jìn)展.生物技術(shù)進(jìn)展， 4(1) : 1-6]。這些研宄結(jié)果不僅證實(shí)了纖維特異或優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因?qū)w維細(xì)胞的發(fā)育具有重 要作用，而且為解析了纖維細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。但是到目前為止，獲 得的纖維特異或優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因還是太少，還不能滿足改良棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)分子設(shè)計(jì) 的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為改善棉花纖維品質(zhì)提供一種新選擇，以改善目前得 的纖維特異或優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因還是太少，還不能滿足改良棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)分子設(shè)計(jì)的 需要。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是在纖維細(xì)胞中特異表達(dá)的蛋白質(zhì)CYP734A1 like-1，具有（a) 如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。
[0006] 具體的，所述蛋白的編碼GhCYP734AlL-l基因具有：
[0007] (a)如SEQ ID NO. 1所示的cDNA(cDNA即互補(bǔ)脫氧核糖核酸，為具有與mRNA (信使 RNA)鏈呈互補(bǔ)的堿基序列的單鏈DNA);
[0008] 或（b)如SEQ ID NO. 2所示的基因組DNA (基因組DNA即gDNA)。
[0009] 本發(fā)明還提供了表達(dá)所述蛋白質(zhì)的植物表達(dá)載體。
[0010] 具體的，所述的植物表達(dá)載體為超量表達(dá)GhCYP734AlL-l基因或者反義抑制 GhCYP734AlL-l基因的載體。
[0011] 本發(fā)明還提供了含有所述載體的宿主細(xì)胞。
[0012] 具體的，所述的宿主細(xì)胞為農(nóng)桿菌。
[0013] 本發(fā)明還提供了所述的CYP734A1 Iike-I或植物表達(dá)載體在改良棉花品種中的應(yīng) 用。
[0014] 本發(fā)明還提供了所述CYP734A1 Iike-I或植物表達(dá)載體在改良棉花纖維品質(zhì)中的 應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明中，蛋白質(zhì)GhCYP734AlL-l包括，具有SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列；或 將SEQ ID NO. 3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有 與SEQ ID NO. 3的氨基酸殘基序列相同生物活性的衍生的蛋白質(zhì)。
[0016] SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列為編碼棉花GhCYP734AlL-l基因的cDNA序列，SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列為gGhCYP734AlL-l基因的gDNA(基因組DNA)序列。其中所述 cDNA序列包含5'-非翻譯區(qū)序列、開放閱讀框（ORF)序列和3'-非翻譯區(qū)序列，其中開放閱 讀框序列為編碼序列，gDNA序列含有外顯子和內(nèi)含子序列。
[0017] 本發(fā)明的植物表達(dá)載體，可采用增強(qiáng)型、組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子中的至少一種來 調(diào)控GhCYP734AlL-l基因的表達(dá)。用于構(gòu)建本發(fā)明植物表達(dá)載體的啟動(dòng)子優(yōu)選組成型啟動(dòng) 子或組織特異性啟動(dòng)子，更優(yōu)選來源于花椰菜花葉病毒的植物組成型啟動(dòng)子CaMV35S。通 常，將GhCYP734AlL-l基因構(gòu)建在CaMV35S的下游。用于構(gòu)建本發(fā)明植物表達(dá)載體的出發(fā) 載體可以是任意一種雙元農(nóng)桿菌載體或者可用于基因槍轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體。為了篩選和 表達(dá)的需要，還可選地在表達(dá)載體中包含篩選基因序列、報(bào)告基因序列以及其它的為基因 工程操作的需要而插入的各種內(nèi)切酶位點(diǎn)，篩選基因和報(bào)告基因可以從本領(lǐng)域常用的基因 序列中選擇，優(yōu)選地，本發(fā)明的植物表達(dá)具有如圖5所示的結(jié)構(gòu)。例如，可以在所述表達(dá)載 體中加入在植物中能表達(dá)的編碼可發(fā)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因，如GUS(f3 -葡 萄糖苷酸酶）基因、GFP(綠色熒光蛋白）基因、熒光素酶等；具有抗性的抗生素標(biāo)記物，如 抗慶大霉素標(biāo)記物、抗卡拉霉素標(biāo)記物等；抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因，如抗除草劑基因等。
[0018] 本發(fā)明采用超量或抑制GhCYP734AlL-l表達(dá)載體制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括以 下步驟：
[0019] 1)將GhCYP734AlL-l基因與啟動(dòng)子可操作地連接；
[0020] 2)構(gòu)建含有GhCYP734AlL-l基因與啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體；
[0021] 3)用所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主，獲得轉(zhuǎn)化體；
[0022] 4)用所述轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物。
[0023] 本發(fā)明中，可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物或微生物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、 微注射、電導(dǎo)或農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法，將含有本發(fā)明GhCYP734AlL-l基因的表達(dá) 載體轉(zhuǎn)染棉花而獲得轉(zhuǎn)化體。
[0024] 本發(fā)明的有益效果：
[0025] 本發(fā)明所公開GhCYP734AlL-l基因的編碼蛋白質(zhì)可促進(jìn)棉花纖維伸長(zhǎng)，提高棉花 纖維長(zhǎng)度，增加纖維品質(zhì)和產(chǎn)量；因此可利用該基因來改良棉花纖維品質(zhì)，同時(shí)還可以根據(jù) 需要選用不同類型的啟動(dòng)子，來改良棉花纖維品質(zhì)或者改善棉花株型，以有利于棉花產(chǎn)量 品質(zhì)的提高和特殊的栽培操作（如機(jī)械采收操作和高密度栽培等）。
【附圖說明】
[0026] 圖I :GhCYP734AlL-l蛋白質(zhì)與其他物種相關(guān)蛋白質(zhì)的同源性比較；
[0027] gi 144905179 :豌豆（Pisum sativum)細(xì)胞色素 P450 家族蛋白；gi 15225777 : 擬南芥（Arabidopsis thaliana)細(xì)胞色素 P450 蛋白（CYP734A1) ;gi225445412:葡萄 (Vitis vinifera)類細(xì)胞色素 P450 蛋白（CYP734Al-like) ;gi255566913:蓖麻（Ricinus communis)類細(xì)胞色素 P450蛋白；gi356563055 :大豆（Glycine max)類細(xì)胞色素 P450 蛋白（CYP734A1-1 ike) ;gi590577824 :可可（Theobroma cacao)細(xì)胞色素 P450 蛋白； gi728846626 :中棉假擬蛋白。本圖顯示GhCYP734AlL-l與其他物種的細(xì)胞色素 P450蛋白 (CYP734A1)具有較高的同源性，GhCYP734AlL-l基因是CYP734A1的同源基因。
[0028] 圖 2 :GhCYP734AlL-l 的進(jìn)化樹分析；
[0029] 本圖顯示GhCYP734AlL-l基因與中棉和可可中的同源基因親緣關(guān)系最近。
[0030] 圖3 :GhCYP734AlL-l基因的表達(dá)分析；
[0031] 其中A :GhCYP734AlL-l基因在不同組織、器官和細(xì)胞中的表達(dá)模式；
[0032] 其中B :GhCYP734AlL-l基因在纖維細(xì)胞和胚珠不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水