該基因在開花當天（ODPA)和開花后2天（2DPA)的胚珠纖維中幾乎不表達，在開 花后4天（4DPA)胚珠纖維中有微弱表達；在開花后6天（6DPA)至開花后10天（10DPA)的 纖維細胞中大量表達，并隨著纖維細胞的生長，表達水平逐漸升高，在10DPA時達到表達最 高峰；10DPA以后，隨著纖維細胞的繼續(xù)生長，GhCYP734AlL-l基因的表達水平逐漸降低，但 在開花后16天（16DPA)纖維細胞中仍有較高的表達水平。胚珠中的表達水平都遠遠低于 相同發(fā)育時期纖維中的表達水平，在16DPA胚珠中幾乎檢測不到GhCYP734AlL-l基因的表 達。胚珠中的微弱表達可能是纖維從胚珠表面剝離時殘留的部分纖維所致（圖3B)。這一 表達模式顯示GhCYP734AlL-l基因在纖維細胞快速伸長期表達水平最高，其表達水平與纖 維細胞伸長速率成正比，說明該基因在纖維細胞伸長中具有重要作用。
[0090] 2、在超短纖維突變體纖維中的表達差異
[0091] Iigonless-I(Ii-I)是一個超短纖維突變體，其纖維在發(fā)育早期與其野生型TM-I 的纖維發(fā)育沒有明顯的差異，開花后5天時，兩者的纖維發(fā)育開始出現差異，到纖維成熟 時，Ii-I突變體的纖維長度僅有6毫米左右，而野生型TM-I的纖維長度為29毫米左右。 Ii-I的纖維細胞伸長收到嚴重抑制，因此該突變體是研宄纖維細胞伸長的良好材料。為了 進一步明確GhCYP734AlL-l基因在纖維細胞伸長中的作用，利用實時定量RT-PCR檢測了 TM-I和Ii-I突變體開花當天的胚珠纖維（FO-ODPA)、開花后6天的胚珠纖維（F0-6DPA)、開 花后10天的纖維細胞（F-10DPA)和開花后10天的胚珠（0-10DPA)中GhCYP734AlL-l基因 的表達差異。結果表明該基因的表達水平在6DPA胚珠纖維和10DPA纖維中出現顯著差異， 特別是在10DPA纖維中，該基因在Ii-I纖維中幾乎不表達，而在野生型纖維中該基因具有 極高的表達水平。在ODPA胚珠纖維和10DPA胚珠中，該基因在野生型和Ii-I突變體中都 不表達（圖4)。由此推測GhCYP734AlL-l基因在6DPA胚珠纖維中的表達差異主要也來源 于6DPA纖維細胞中的差異表達。這結果說明GhCYP734AlL-l基因在纖維細胞伸長中具有 重要作用。
[0092] 實施例3超量表達和反義抑制GhCYP734AlL-l基因植物表達載體的構建以及棉 花的遺傳轉化
[0093] 1、超量和反義表達載體的構建
[0094] pGEm-GhCYP734AlL-l載體是在克隆GhCYP734AlL-l基因時構建，其上的 GhCYP734AlL-l片段已測序。植物表達載體為改造的pCambia載體（廣州吉賽生物科技有 限公司），該載體的HPT II基因用XhoI單酶切后替換為NPT II基因（設計引物從pBI121 載體中擴增獲得，引物設計兩端帶XhoI位點），限制性酶切和測序結果驗證了 NPT II基因 的方向。在PBI121載體中擴增獲得CaMV35S啟動子和NOS終止子，同時這兩個元件兩端也 引入了相應的酶切位點，這兩個元件最后分別導入pCambia的多克隆位點，形成CaMV35S :: MCS : :N0S單元。該植物表達載體（圖5)含有一套2XCaMV35S啟動子控制NPTII基因的 植物表達元件、一套CaMV35S啟動子控制報告基因 GRP-GusPlus-His6的植物表達元件和一 套CaMV35S啟動子控制目標基因的植物表達元件，可實現Kan和⑶S活性的雙標記篩選。在 多克隆位點（Multiple cloning site，MCS)插入外源基因，可以實現外源基因的超量表達。
[0095] 為了在轉基因植物中超量表達GhCYP734AlL-l基因，需要將GhCYP734AlL-l 基因正向插入植物表達載體中，并用CaMV35S啟動子啟動子啟動表達，構建了超量 表達 GhCYP734AlL-l 基因植物表達載體 pCambia-35S-GhCYP734AlL-l-N0S(簡稱 pC-GhCYP734AlL-l)(圖6)。將GhCYP734AlL-l基因反向插入植物表達載體pCambia中， 用CaMV35S啟動子啟動表達，構建了含有GhCYP734AlL-l基因反義序列的植物表達載體 pC-CaMV 35S-反義 GhCYP734AlL-l，（簡稱 pC-反義 GhCYP734AlL-l)(圖 7)。
[0096] 2.棉花的遺傳轉化
[0097] 用電激法將構建的植物表達載體質粒導入農桿菌LBA4404菌株并進行棉花遺傳 轉化。參考Bio-RAD MicroPulser用戶說明書，將上述載體通過電激轉化法導入農桿菌 LBA4404 菌株。
[0098] 上述的植物表達載體通過農桿菌介導棉花下胚軸轉化方法導入棉花。具體方法如 下：
[0099] 冀棉14種子剝去外殼，用0. 1 %的升汞（HgCl2)滅菌lOmin，用大量無菌水沖洗8 次。在125mL三角瓶中加入約35mL無菌水震蕩過夜，次日換一次無菌水。當種子長出下胚 軸根后，播種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，在28°C，黑暗條件下萌發(fā)2-3d，此時種子下胚軸開始進 入快速伸長的時期，適宜進行遺傳轉化。
[0100] 轉化用的含 pC-CaMV35S-GhCYP734AlL-l 和 pC-CaMV35S-反義 GhCYP734AlL-l 植 物表達載體的農桿菌菌株在含50mg/L Km和125mg/L Sm的YEB固體培養(yǎng)基上活化。挑取 其單菌落，接種于5ml含相同抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C、200r/min震蕩培養(yǎng)過夜。 培養(yǎng)后的農桿菌菌液按1 :20的比例轉接到25ml含相同抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù) 培養(yǎng)至0D600值約為0. 6-0. 8,10, OOOr/min、lmin離心收集菌體，菌體用等體積的液體共培 養(yǎng)基重懸備用。
[0101] 轉化時，將棉花下胚軸切成I. 5-2. Ocm的小段，放入三角瓶中用制備好的農桿菌 菌液侵染，條件為28°C搖床120r/min侵染30min。然后吸干菌液，將下胚軸段轉到共培養(yǎng) 基上，28 °C暗培養(yǎng)2-3天。
[0102] 共培養(yǎng)后，下胚軸段轉入到下胚段篩選培養(yǎng)基，28°C光照培養(yǎng)，約20天繼代一次， 直到出現大量愈傷組織。愈傷組織連同下胚段轉移到胚性愈傷誘導培養(yǎng)基，約15天繼代一 次，直到出現大量的淺黃色胚性愈傷。胚性愈傷挑到胚性愈傷懸浮培養(yǎng)基中，28°C、120r/ min搖床培養(yǎng)一周左右。用減去尖頭的LOmL槍頭吸取細沙狀的體胚平鋪于體胚伸長培養(yǎng) 基，20-30天后出現大量的綠色小體胚。挑取生長狀態(tài)良好的體胚繼代培養(yǎng)，待體胚伸長到 l-2cm時，將其轉移到成苗培養(yǎng)基生根出苗。幼苗生長到3-5cm高時，通過嫁接或者移栽的 方式轉移到溫室花缽中生長。其中，本實驗例中所用的培養(yǎng)基如表1所示。
[0103] 表1根癌農桿菌介導的棉花下胚軸遺傳轉化所用培養(yǎng)基
[0104]
【主權項】
1. 纖維細胞中特異表達的蛋白質CYP734Allike-l，具有如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸 序列。
2. 如權利要求1所述的蛋白質，其特征在于：所述CYP734Allike-l的編碼基因 GhCYP734AlL-l 具有： (a)如 SEQ ID NO. 1 所示的 cDNA ; 或（b)如SEQ ID NO. 2所示的基因組DNA。
3. 表達權利要求1或2所述蛋白質的植物表達載體。
4. 如權利要求3所述的載體，其特征在于：所述的植物表達載體為超量表達 GhCYP734AlL-l基因或者反義抑制GhCYP734AlL-l基因的載體。
5. 含有權利要求3或4所述載體的宿主細胞。
6. 如權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于：所述的宿主細胞為農桿菌。
7. 權利要求1或2所述的CYP734Allike-l蛋白質在改良棉花品種中的應用。
8. 權利要求3或4所述的植物表達載體在改良棉花品種中的應用。
9. 權利要求1或2所述的CYP734Allike-l蛋白質在改良棉花纖維品質中的應用。
10. 權利要求3或4所述的植物表達載體在改良棉花纖維品質中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程領域，具體涉及纖維細胞中特異表 達的蛋白質CYP734A1?like-1及其應用。本發(fā)明要解決的技術問題是為改善目前得的纖維特異或優(yōu)勢表達的基因還是太少，還不能滿足改良棉花纖維 產量和品質分子設計的需要。本發(fā)明公開的蛋白質CYP734A1like-1，具有如SEQ?ID?NO.3所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了表達所述蛋 白的植物表達載體。本發(fā)明為改善棉花纖維品質和改良棉花品種提供新選擇。
【IPC分類】C12N1-21, C12N15-84, C12N15-53, A01H5-00, C12N9-02
【公開號】CN104560906
【申請?zhí)枴緾N201510063409
【發(fā)明人】羅明, 李芳 , 隗廷, 翟云蘭, 曾志鋒, 裴炎, 肖月華, 侯磊, 李先碧
【申請人】西南大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年2月6日