一種嗜熱四膜蟲的高密度發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種嗜熱四膜蟲的高密度發(fā)酵方法。本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)四膜蟲的方法，包括如下步驟：將四膜蟲接種至pH5-9的發(fā)酵培養(yǎng)基，使四膜蟲的初始密度為3125-50000cells/ml，然后采用50-200rpm轉速培養(yǎng)10-96小時。本發(fā)明解決了四膜蟲高密度發(fā)酵中兩個迫在眉睫的問題，即培養(yǎng)基貴的問題和沒有發(fā)酵工藝的問題，與現(xiàn)有技術相比其優(yōu)點在于：⑴大大節(jié)省了成本，適合大批量培養(yǎng)四膜蟲，為工業(yè)化生產四膜蟲奠定了堅實的基礎；⑵本發(fā)明在國內首次建立了發(fā)酵罐培養(yǎng)四膜蟲的發(fā)酵工藝，并實現(xiàn)了四膜蟲的高密度發(fā)酵，為四膜蟲高密度生產產物奠定了堅實的基礎。
【專利說明】一種嗜熱四膜蟲的高密度發(fā)酵方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種嗜熱四膜蟲的高密度發(fā)酵方法。
【背景技術】
[0002]四膜蟲(Tetrahymena)是一種單細胞真核生物，分布在全球的淡水水域中，屬于原生動物亞界中的纖毛門寡毛綱膜口目膜口科四膜蟲屬，與一般人所熟知的草履蟲(Paramecium)在形態(tài)生理上十分相似。四膜蟲外觀呈橢圓長梨狀，體長約50微米,全身布滿數(shù)百根長約4-6微米長的纖毛，纖毛排列成數(shù)十條縱列，是不同種間纖毛蟲分類的特征之一。四膜蟲身體前端具有口器(oral apparatus)，有三組三列的口部纖毛，早期在光學顯微鏡下觀察時看似有四列膜狀構造，因此據(jù)以命名。
[0003]在過去的50年中，以四膜蟲為實驗對象在基礎研究中取得了一系列突破性的成果，如上世紀60年代第I個微管動力蛋白的發(fā)現(xiàn)；70~80年代端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)及其作用機制的研究(獲得2009年諾貝爾生理與醫(yī)學獎)，大大促進了對細胞老化過程的認識；80年代核酶及RNA自我拼接的發(fā)現(xiàn)(獲得1989年諾貝爾化學獎)，打破了人們關于“酶都是由蛋白質組成的”的固有觀念；90年代組蛋白乙?；g后修飾功能的發(fā)現(xiàn)成為當下熱點研究表觀遺傳學的經典文獻之一；大核DNA重整中RNAi機制的存在作為共同發(fā)現(xiàn)者被評為2002年美國Science雜志十大科學發(fā)現(xiàn)之一。
[0004]同時，四膜蟲作為第一種實現(xiàn)細胞同步化的真核生物可以進行無菌純培養(yǎng)，而且生長快(2-2. 5h/代)、培養(yǎng)簡單、操作精確度高和可控性強；2005年底美國科學家完成了嗜熱四膜蟲大核基因組的測序并建立了相應的預測基因數(shù)據(jù)厙(Tetrahymena GenomeDatabase, http://ciliate.0rg/ index, php/home/we I come),比較基因組學的研究顯不嗜熱四膜蟲較酵母等模式生物和人類具有更高程度的功能保守性；加之四膜蟲中已建立了成熟的基因操作技術，使得在嗜熱四膜蟲中進行基因敲除和插入、基因表達抑制和基因過表達等十分方便快捷；美國科學家又完成了嗜熱四膜蟲小核基因組的測序并把數(shù)據(jù)共享在預測基因數(shù)據(jù)厙(Tetrahymena Genome Database,
[0005]http://ciliate.0rg/ index, php/home/we I come),再加上 Miao Lab 等基于嗜熱四膜蟲基因芯片、RNA-Seq和基因網絡建立的四膜蟲功能基因組學數(shù)據(jù)庫(TetrahymenaFunctional Genomics Database, http: //tfgd.1hb.ac.cn/),為四膜蟲基因功能的研究提供了很好的平臺。因此，四膜蟲是在基因組水平開展真核生物重要代謝通路及基因調控網絡研究的良好模式生物。
[0006]發(fā)酵的定義由使用場合的不同而不同，通常所說的發(fā)酵，多是指生物體對于有機物的某種分解過程。發(fā)酵按工藝流程分為分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵和補料分批發(fā)酵。分批發(fā)酵，即在一個密閉系統(tǒng)內一次性投入有限數(shù)量的營養(yǎng)物進行培養(yǎng)的方法。連續(xù)發(fā)酵，是在開放系統(tǒng)中進行的，指以一定的速率向發(fā)酵罐內添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內的液量維持恒定，使培養(yǎng)物在近似恒定的狀態(tài)下生長的培養(yǎng)方法。補料分批發(fā)酵是指在分批發(fā)酵過程中，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法(即間歇補料分批發(fā)酵或恒速補料分批發(fā)酵)。
[0007]四膜蟲作為良好的模式生物，許多學者正在嘗試用四膜蟲表達各種產物，如溶酶體酶、磷脂酶和抗菌肽等。所以，對四膜蟲進行高密度發(fā)酵很有必要，可以為四膜蟲高密度生產產物奠定堅實基礎。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種嗜熱四膜蟲的高密度發(fā)酵方法。
[0009]本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)四膜蟲的方法，包括如下步驟:將四膜蟲接種至PH5-9的發(fā)酵培養(yǎng)基，使四膜蟲的初始密度為3125cells/ml-50000cells/ml，然后采用50_200rpm轉速培養(yǎng)10-96小時。
[0010]所述方法中，四膜蟲的初始密度具體可為6250cells/ml。
[0011]所述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH具體可為pH7.0。
[0012]所述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基具體可為gspp培養(yǎng)基。gspp培養(yǎng)基的溶劑為雙蒸水，溶質及其濃度如下:葡萄糖2g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸出物lg/L、檸檬酸鐵0.03g/L。
[0013]所述方法中，所述培養(yǎng)具體可采用IOOrpm的轉速。
[0014]所述方法中，所述培養(yǎng)采用的溫度具體可為30°C。
[0015]所述方法中，所述培養(yǎng)具體可采用20%_55%的發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量。
[0016]所述方法中，所述培養(yǎng)具體可為搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為20%。
`[0017]所述方法中，所述培養(yǎng)具體可為發(fā)酵罐培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為50%±5%。
[0018]所述方法中，所述培養(yǎng)為發(fā)酵罐培養(yǎng)時，可采用6L/min的空氣流速。
[0019]所述方法中，所述培養(yǎng)為發(fā)酵罐培養(yǎng)時，可在發(fā)酵體系的殘?zhí)菨舛鹊陀?.8g/L時一次性加入補料培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基與所述補料培養(yǎng)基的體積配比為4L發(fā)酵培養(yǎng)基:400ml補料培養(yǎng)基。
[0020]所述方法中，所述培養(yǎng)為發(fā)酵罐培養(yǎng)時，可在發(fā)酵體系的殘?zhí)菨舛鹊陀?.8g/L時以100ml/h的速度持續(xù)加入補料培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基與所述補料培養(yǎng)基的體積配比為4L發(fā)酵培養(yǎng)基:400ml補料培養(yǎng)基。
[0021]所述補料培養(yǎng)基的溶劑為雙蒸水，溶質及其濃度如下:葡萄糖20g/L、蛋白胨200g/L、酵母浸出物10g/L、檸檬酸鐵0.3g/L。所述補料培養(yǎng)基的pH具體可為7.0。
[0022]所述四膜蟲可為嗜熱四膜蟲，具體可為嗜熱四膜蟲B2086株系。
[0023]本發(fā)明摸索了四膜蟲的最佳培養(yǎng)條件。通過單因素實驗，對發(fā)酵培養(yǎng)基的pH、發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量、起始接種密度和轉速進行優(yōu)化，最終確定四膜蟲發(fā)酵的最適條件(發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為7.0、搖瓶裝液量為20%、發(fā)酵罐裝液量為50%±5%、起始接種密度為6250cells/ml、轉速為 lOOrpm)。
[0024]本發(fā)明在確定了培養(yǎng)四膜蟲的最佳條件后，對四膜蟲進行了發(fā)酵罐的分批高密度發(fā)酵實驗，得出MPD為1222416cells/ml、GTP為2.5h，獲得干重達到2.15g/L。在此基礎上，為了進一步提高細胞密度，發(fā)明人嘗試了一次性間歇補料高密度發(fā)酵實驗和恒速補料高密度發(fā)酵實驗，得出一次性間歇補料高密度發(fā)酵實驗的MPD為2053241 ce 11 s/ml、GTP為
3.2h、獲得干重達到4.4g/L，恒速補料高密度發(fā)酵實驗的MPD為1849138cells/ml、GTP為2.8h、獲得干重達到4.3g/L。綜合比較三次用發(fā)酵罐高密度發(fā)酵四膜蟲的實驗，可以看出補料能顯著提高細胞的密度和細胞干重，其中一次性間歇補料高密度發(fā)酵的MPD比分批發(fā)酵提高了 67.97%，細胞干重提高了 104.65%，恒速補料高密度發(fā)酵的MPD比分批發(fā)酵提高了51.27%，細胞干重提高了 100.00%,說明一次性間歇補料比恒速補料密度和干重提高的都更明顯。在應用中，一次性間歇補料比恒速補料操作簡單且克服了雜菌污染和菌株不穩(wěn)定的缺點，所以，對于四膜蟲而言，一次性間歇補料是最佳的補料方式，最大細胞密度能達到2053241cells/ml，干重達到 4.4g/L。
[0025]本發(fā)明解決了四膜蟲高密度發(fā)酵中兩個迫在眉睫的問題，即培養(yǎng)基貴的問題和沒有發(fā)酵工藝的問題，與現(xiàn)有技術相比其優(yōu)點在于:⑴本發(fā)明使用的gspp培養(yǎng)基價格非常便宜，2.2元 /L，是常用spp培養(yǎng)基的1/33，大大節(jié)省了成本，解決了培養(yǎng)基貴的問題，適合大批量培養(yǎng)四膜蟲，為工業(yè)化生產四膜蟲奠定了堅實的基礎；⑵本發(fā)明在國內首次建立了發(fā)酵罐培養(yǎng)四膜蟲的發(fā)酵工藝，并實現(xiàn)了四膜蟲的高密度發(fā)酵，最高密度可達
2.05X 106cellS/ml，干重可達4.4g/L，為四膜蟲高密度生產產物奠定了堅實的基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為葡萄糖標準曲線。
[0027]圖2為實施例1中gspp培養(yǎng)基與spp培養(yǎng)基的效果比較的結果。
[0028]圖3為實施例2中的密度生長曲線圖。
[0029]圖4為實施例2中的MPD和GTP。
[0030]圖5為實施例3中的密度生長曲線圖。
[0031 ] 圖6為實施例3中的MPD和GTP。
[0032]圖7為實施例4中的密度生長曲線圖。
[0033]圖8為實施例4中的MPD和GTP。
[0034]圖9為實施例5中的密度生長曲線圖。
[0035]圖10為實施例5中的MPD和GTP。
[0036]圖11為實施例6中的密度生長曲線圖和殘?zhí)菨舛茸兓瘓D。圖12為實施例7中的密度生長曲線圖和殘?zhí)菨舛茸兓瘓D。
[0037]圖13為實施例8中的密度生長曲線圖和殘?zhí)菨舛茸兓瘓D。
[0038]圖14為實施例6 (分批)、實施例7 (間歇)和實施例8 (恒速)的密度生長曲線比較。
【具體實施方式】
[0039]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。葡萄糖:國藥公司。proteose peptone:BD公司。yeast extract:0X0ID公司。蛋白胨:雙旋公司。酵母浸出物:雙旋公司。實施例中的搖瓶實驗中采用的搖床的擺振幅度均為 C>26mm。
[0040]DNS法的具體步驟如下:
[0041]①DNS試劑的配制(1L):10g3, 5-二硝基水楊酸，16g氫氧化鈉,300g四水合酒石酸鉀鈉，三種試劑分別用雙蒸水溶解后混合在一起，用雙蒸水定容至1L，用棕色瓶裝好避光放置一周后使用；
[0042]②葡萄糖標準曲線制作方法:將葡萄糖105°C烘干后，稱取0.05g溶于雙蒸水中，定容 100ml,即 500 μ g/ml 的母液；稀釋成 10 種濃度:5 μ g/ml、10 μ g/ml、15 μ g/ml、20 μ g/ml、25 μ g/ml、30 μ g/ml、35 μ g/ml、40 μ g/ml、45 μ g/ml 和 50 μ g/ml (以蒸懼水為空白對照，即葡萄糖濃度為O μ g/ml));取幾支干凈的試管，分別加入不同濃度的葡萄糖溶液1ml，加入1.5ml DNS試劑，置于100°C水浴lOmin，冷卻至室溫，在540nm處測吸光度，以吸光度的減少量(各濃度吸光度與空白對照的吸光度之差)為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線，見圖1 ;
[0043]③測定:取1.5ml待測液相于1.5ml的EP管中，12000rpm離心5min,取上清Iml,加入1.5ml DNS試劑，混勻沸水浴lOmin，立即取出冷卻，在540nm的波長處測吸光值，根據(jù)標準曲線計數(shù)殘?zhí)呛俊?br> [0044]Gompertz的數(shù)學方程式:
[0045]Log Nt=A+C X exp {-exp [-B X (t_M) ]}
[0046]其中，A，初始體系中微生物數(shù)量以10為底的對數(shù)值；B，最大生長速率；C，穩(wěn)定期體系中微生物數(shù)量以10為底的對數(shù)值與初始體系中微生物數(shù)量以10為底的對數(shù)值的差值；M，最大生長速率時所對應的時刻；log(Nt)，在t時刻體系中微生物數(shù)量以10為底的對數(shù)值。
[0047]根據(jù)上述公式用OriginS即可直接得出參數(shù)A、C、B和M，進而算出:
【權利要求】
1.一種培養(yǎng)四膜蟲的方法，包括如下步驟:將四膜蟲接種至PH5-9的發(fā)酵培養(yǎng)基，使四膜蟲的初始密度為3125cells/ml-50000cells/ml，然后采用50_200rpm轉速培養(yǎng)10-96小時。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法中，四膜蟲的初始密度為6250cells/ml。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為pH7.0。
4.如權利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基為gspp培養(yǎng)基；gspp培養(yǎng)基的溶劑為水,溶質及其濃度如下:葡萄糖2g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸出物lg/L、檸檬酸鐵0.03g/L。
5.如權利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)采用的轉速為lOOrpm。
6.如權利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)為搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為20%。
7.如權利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)為發(fā)酵罐培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為50%±5%。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)的過程中，采用6L/min的空氣流速。
9.如權利要求7或 8所述的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)的過程中，在發(fā)酵體系的殘?zhí)菨舛鹊陀?.8g/L時一次性加入補料培養(yǎng)基,所述發(fā)酵培養(yǎng)基與所述補料培養(yǎng)基的體積配比為4L發(fā)酵培養(yǎng)基:400ml補料培養(yǎng)基；所述補料培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質及其濃度如下:葡萄糖20g/L、蛋白胨200g/L、酵母浸出物10g/L、檸檬酸鐵0.3g/L。
10.如權利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)的過程中，在發(fā)酵體系的殘?zhí)菨舛鹊陀?.8g/L時以100ml/h的速度持續(xù)加入補料培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基與所述補料培養(yǎng)基的體積配比為4L發(fā)酵培養(yǎng)基:400ml補料培養(yǎng)基；所述補料培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質及其濃度如下:葡萄糖20g/L、蛋白胨200g/L、酵母浸出物10g/L、檸檬酸鐵0.3g/L。
【文檔編號】C12R1/90GK103756906SQ201410024085
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月20日 優(yōu)先權日:2014年1月20日
【發(fā)明者】繆煒, 鐘秋萍, 周志剛, 袁冬霞, 李青 申請人:中國科學院水生生物研究所, 中國農業(yè)科學院飼料研究所