專利名稱:器官移植患者移植排斥的非侵入性診斷的制作方法
器官移植患者移植排斥的非侵入性診斷
發(fā)明背景
器官移植是一個重要的醫(yī)學(xué)方法，在患者出現(xiàn)器官衰竭或損壞的病例中可挽救生命，并且現(xiàn)在可以移植很多器官，包括心臟，臟，腎，和肝。在一些病例中，移植的器官被接受的病人排斥，產(chǎn)生威脅生命的情況。難以監(jiān)控患者排異并且花費昂貴，經(jīng)常需要侵入性診斷。另外，當前的監(jiān)測方法缺乏足夠的靈敏度。
本發(fā)明通過提供監(jiān)控器官移植患者排異的非侵入性方法來解決這些問題，所述診斷敏感，迅速并且便宜。
發(fā)明概述本方面提供用于診斷和/或預(yù)測接受移植物的對象的移植狀態(tài)或結(jié)果的方法，設(shè)備，組合物和試劑盒。在一些實施方式中，發(fā)明提供診斷或預(yù)測移植狀態(tài)或結(jié)果的方法，所述方法包括以下步驟(i)提供已經(jīng)從供體接受移植物的對象的樣品；(ii)測定從供體移植的一個或多個核酸是否出現(xiàn)，其中供體的一個或多個核酸根據(jù)預(yù)定的標記分布鑒定；和
(iii)根據(jù)一個或多個核酸是否出現(xiàn)來診斷或預(yù)測移植狀態(tài)或結(jié)果。
在一些實施方式中，移植狀態(tài)或結(jié)果包括排異，耐受性，基于非排異的同種異體移植物損傷，移植功能，移植存活，慢性移植損傷，或免疫抑制藥理學(xué)效價。一些實施方式中，基于非排異的同種異體移植物損傷選自下組缺血損傷，病毒感染，圍手術(shù)期缺血，再灌注損傷，高血壓，生理應(yīng)激，活性氧自由基造成的損傷和藥物試劑造成的損傷。
—些實施方式中，樣品選自血液,血清,尿,和糞便。一些實施方式中，標記分布是多態(tài)性標記分布。一些實施方式中，多態(tài)性標記分布包括一種或多種單核苷酸多態(tài)性(SNP’S)，一種或多種限制性片段長度多態(tài)性(RFLP’S)，一種或多種短串聯(lián)重復(fù)(STR)，一種或多種可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR’ S)，一個或多個超變區(qū)，一個或多個小衛(wèi)星，一個或多個二核苷酸重復(fù)，一個或多個三核苷酸重復(fù)，一個或多個四核苷酸重復(fù)，一個或多個簡單重復(fù)序列，或一個或多個插入兀件。一些實施方式中，多態(tài)性標記分布包括一種或多種SNP。
—些實施方式中,標記分布通過移植供體基因分型測定。一些實施方式中，所述方法還包括接受移植的對象的基因分型。一些實施方式中，所述方法還包括建立標記分布，其中標記在移植供體和接受移植的對象之間可以區(qū)分開。一些實施方式中，基因分型由選自測序、核酸陣列和PCR的方法完成。
本文描述的任何一個實施方式中，移植可以是任何固體器官和皮膚移植。一些實施方式中，移植選自腎移植，心臟移植，肝移植，胰腺移植，肺移植，腸移植和皮膚移植。
一些實施方式中，核酸選自雙鏈DNA，單鏈DNA，單鏈DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，DNA/RNA雜交體，RNA和RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。一些實施方式中，核酸選自雙鏈DNA，單鏈DNA和cDNA。一些實施方式中，核酸是mRNA。一些實施方式中，核酸得自循環(huán)供體細胞。一些實施方式中，核酸是游離循環(huán) DNA (circulating cell-free DNA)。
一些實施方式中，一個或多個核酸是否存在由選自測序、核酸陣列和PCR的的方法測定。在一些實施方式中，所述測序是鳥槍測序。一些實施方式中，所述陣列是DNA陣列。一些實施方式中，DNA陣列是多態(tài)性陣列。一些實施方式中，多態(tài)性陣列是SNP陣列。[0012]一些實施方式中，所述方法還包括測定定量一個或多個核酸。一些實施方式中，一個或多個核酸的量指示移植狀態(tài)或結(jié)果。一些實施方式中，高于預(yù)定閾值的一個或多個核酸量指示移植狀態(tài)或結(jié)果。一些實施方式中，閾值是沒有移植排斥或其他病變跡象的移植后患者臨床穩(wěn)定的標準值。一些實施方式中，不同的移植結(jié)果或狀態(tài)有不同的預(yù)定閾值。一些實施方式中，一個或多個核酸量的暫時差異指示移植狀態(tài)或結(jié)果。
一些實施方式中，本文所述方法有至少56%靈敏度。一些實施方式中，本文所述方法有至少78%靈敏度。一些實施方式中，本文所述方法有約70%-約100%特異性。一些實施方式中，本文所述方法有約80%-約100%特異性。一些實施方式中，本文所述方法有約90%-約100%特異性。一些實施方式中，本文所述方法有約100%特異性。
—些實施方式中，發(fā)明提供計算機可讀介質(zhì),所述介質(zhì)包括記錄其上的使計算機執(zhí)行以下步驟的一組指令(i)從接受供體移植的對象樣品檢測的一個或多個核酸中接收·數(shù)據(jù)，其中一個或多個核酸是得自供體移植的核酸，并且其中供體的一個或多個核酸根據(jù)預(yù)定標記分布鑒定；和(ii)根據(jù)一個或多個核酸是否出現(xiàn)診斷或預(yù)測移植狀態(tài)或結(jié)果。
—些實施方式中，發(fā)明提供實施本文所述一種或多種方法的試劑和試劑盒。
通過引用納入
本說明書中提到的所有發(fā)表物和專利申請通過引用納入本文，就好像將各篇單獨的發(fā)表物或?qū)＠暾執(zhí)貏e和單獨地通過引用納入本文那樣。

附圖簡要說明
所附權(quán)利要求
書中具體說明了本發(fā)明的新特征?？蓞⒖家韵略斒龈玫乩斫獗景l(fā)明的特征和優(yōu)點，這些詳述列出利用本發(fā)明原理的說明性實施方式和附圖
圖I顯示診斷CAV后患者的存活。
圖2顯示接受性別不匹配移植患者的供體DNA檢測。
圖3顯示接受性別不匹配移植和遭受3A排異事件的移植患者中供體DNA檢測的時程研究。
圖4顯示接受性別不匹配移植和遭受3A排斥反應(yīng)的移植患者中供體DNA檢測的時程研究。
圖5描述發(fā)明的一個實施方式中監(jiān)控所有移植患者的通用策略。
圖6顯示測序結(jié)果,對比供體DNA和受體DNA的四個替代水平。
發(fā)明詳述
下面詳細說明本發(fā)明的具體優(yōu)選實施方式。優(yōu)選實施方式的示例在下列實施例部分闡述。
除非另外定義，否則，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的同樣含義。本發(fā)明中提及的所有專利和出版物通過引用全文納入本文。
提供為診斷或預(yù)測接受移植物的對象的移植狀態(tài)或結(jié)果的方法，設(shè)備，組合物和試劑盒。移植狀態(tài)或結(jié)果可以包括排異，耐受性，基于非排異的移植損傷，移植功能，移植存活，慢性移植損傷，或免疫抑制藥理學(xué)效價。
發(fā)明描述用于監(jiān)控器官移植患者，和/或診斷或預(yù)測移植狀態(tài)或結(jié)果(例如移植排斥)的靈敏且非侵入性方法，設(shè)備，組合物和試劑盒。一些實施方式中，采用所述方法，設(shè)備，組合物和試劑盒在移植前建立供體和受體的基因型以能夠檢測移植后器官受體的體液如血液或尿液中的供體特異性核酸如DNA或RNA。
一些實施方式中，發(fā)明提供測定患者或?qū)ο笫欠耧@示移植耐受性的方法。術(shù)語“移植耐受性”包括對象不排斥引入該對象內(nèi)/上的移植器官，組織或細胞。換句話說，對象耐受或維持移植入的器官，組織或細胞。本文所用的術(shù)語“患者”或“對象”包括人和其他哺乳動物。
一些實施方式中，發(fā)明提供診斷或預(yù)測移植排斥的方法。術(shù)語“移植排斥”包括急性和慢性移植排斥?！凹毙耘懦饣駻R”是當移植組織在免疫學(xué)上是異源時，組織移植受體免疫系統(tǒng)的排斥。急性 排異的特性是受體免疫細胞向移植組織浸潤滲透，所述細胞行使其效應(yīng)物功能并破壞移植組織。急性排斥開始迅速并一般在人體移植手術(shù)后幾周內(nèi)發(fā)生。通常，急性排斥能用如免疫抑制藥物例如雷帕霉素，環(huán)孢素A，抗CD40L單克隆抗體等阻抑或抑制。
“慢性移植排異或CR”一般發(fā)生在人體移植后數(shù)月到數(shù)年內(nèi)，甚至在急性排斥免疫抑制成功的情況下。纖維化是所有器官移植類型慢性排斥的常見因素。慢性排斥一般能描述為有具體器官特征的特異疾病范圍。例如，在肺移植中，這些疾病包括破壞氣道的纖維增生(閉塞性細支氣管炎)；在心臟移植或心臟組織移植如瓣膜置換術(shù)中，這些疾病包括纖維化動脈粥樣硬化；腎臟移植中，這些疾病包括梗阻性腎病，腎硬化，腎小管間質(zhì)腎??；和肝臟移植中，這些疾病包括肝內(nèi)膽管消失綜合征。慢性排斥的特征也可以是缺血損傷，移植組織去神經(jīng)支配，和與免疫抑制藥物相關(guān)的高脂血和高血壓。
一些實施方式中，發(fā)明還包括確定接受移植例如同種異體移植物的對象的免抑制疫方案。
發(fā)明的某些實施方式提供預(yù)測接受移植物的對象的移植存活的方法。發(fā)明提供診斷或預(yù)測移植患者或?qū)ο蟮囊浦参锸欠翊婊罨騿适У姆椒?。某些實施方式中，發(fā)明提供診斷或預(yù)測出現(xiàn)長期移植物存活的方法?！伴L期”移植物存活指當前取樣后移植物存活至少約5年，盡管出現(xiàn)一個或多個之前的急性排斥反應(yīng)。某些實施方式中，測定至少發(fā)生一次急性排斥反應(yīng)的患者的移植存活。如此，這些實施方式提供測定或預(yù)測急性排斥后移植存活的方法。移植存活在移植治療例如免疫抑制治療情況下的某些實施方式中測定或預(yù)測，其中免疫抑制治療為本領(lǐng)域已知。在其他實施方式中，提供測定急性排斥(并且不只是其存在)種類和/或嚴重性的方法。
一些實施方式中，發(fā)明提供診斷或預(yù)測基于非排異的移植損傷的方法。基于非排異的移植損傷示例包括但不限于，缺血損傷，病毒感染，圍手術(shù)期缺血，再灌注損傷，高血壓，生理應(yīng)激，活性氧自由基造成的損傷和藥物試劑造成的損傷。
如移植領(lǐng)域所知，移植器官、組織或細胞可以異體或異種，從而移植物可以同種異體移植物或異種異體移植物。由對象方法檢測或鑒定的移植物耐受表型特征是沒有免疫抑制治療時產(chǎn)生的表型，即，在沒有接受免疫抑制治療的宿主中存在，從而沒有將免疫抑制劑給予宿主。移植物可以是任何固體器官和皮膚移植?？梢杂帽疚乃龇椒ǚ治龅钠鞴僖浦彩纠ǖ幌抻?，腎移植，胰腺移植，肝移植，心臟移植，肺移植，腸移植，腎移植后胰腺移植，和胰腎聯(lián)合移植。
應(yīng)理解，給出數(shù)值范圍時，除非文中另有明確說明，該范圍上下限之間、到下限單位的十分之一的各中間值，以及所述范圍的任何其它標注或中間值均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。所述較小范圍內(nèi)可獨立地包含這些較小范圍的上下限，它們也屬于本發(fā)明范圍，受到所述范圍明確排除的限值制約。設(shè)定范圍包含一個或兩個限值時，本發(fā)明也包括排除這一個或兩個所含限值的范圍。
本文提出的某些范圍的數(shù)值前面存在術(shù)語“約”。本文使用的術(shù)語“約”為其后準確數(shù)字以及該術(shù)語后面數(shù)字附近或逼近的數(shù)字提供字面支持。在確定數(shù)字是否接近或逼近特定提及數(shù)字時，接近或者逼近的未提及數(shù)字可能是在其所代表的內(nèi)容中提供了特定提及數(shù)字的大致等同的數(shù)字。
除非另有說明，本發(fā)明的實施將采用免疫學(xué)、生物化學(xué)、化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細胞生物學(xué)、基因組學(xué)和重組DNA的常規(guī)技術(shù)，它們均在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。參見Sambrook，F(xiàn)ritsch 和 Maniatis，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL (《分子克隆實驗室手冊》)第二版(1989) !CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (《新編分子生物學(xué)實驗指南》)(F. EAusubel等編(1987));METH0DS IN ENZYM0L0GY (《酶學(xué)方法》叢書)(學(xué)術(shù)出版社公司(Academic Press, Inc. )) PCR 2 :APRACTICAL APPROACH (((PCR 2 :實踐方法》)(M. J. MacPherson, B. D. Hames 和 G. R. Taylor 編(1995)), Harlow 和 Lane 編(1988)ANTIBODIES, ALAB0RAT0RY MANUAL (《抗體，實驗室手冊》)，和 ANIMAL CELL CULTURE (《動物細胞培養(yǎng)》)(R. I. Freshney 編(1987))。
導(dǎo)言
提供用于診斷或預(yù)測接受移植物的對象的移植狀態(tài)或結(jié)果的方法，設(shè)備，組合物和試劑盒。
如上所述，難以監(jiān)控移植患者的移植狀態(tài)或結(jié)果且花費昂貴，經(jīng)常需要非敏感和侵入性方法。例如，心臟移植患者急性排斥監(jiān)控需要連續(xù)心內(nèi)膜心肌活檢，所述活檢在移植后第一年中以每周和每月間隔常規(guī)進行，大部分患者共進行6-8次活檢。免疫抑制、排斥監(jiān)測和威脅生命的感染的早期識別和治療的進展可持續(xù)改善心臟移植后的早期結(jié)果。(Taylor, D. 0.等，J Heart Lung Transplant, 27,943-956 (2008))。然而，晚期死亡率沒有相應(yīng)改善，大部分可歸因于心臟同種異體移植物血管病變(CAV)。(圖I)現(xiàn)在，在美國接近22，000個活心臟移植受體中，CAV仍是晚期移植失敗和死亡的主要原因。在血管造影明顯疾病發(fā)展、移植物功能障礙或癥狀發(fā)作前的CAV早期檢測重要，因為冠狀血管造影檢測(護理標準)后的患者死亡率之高難以承受，已報道2年死亡率為50%。目前的CAV監(jiān)測方法缺少足夠靈敏度或需要侵入性過程，并且最經(jīng)常應(yīng)用的方法-冠狀血管造影缺乏靈敏度(Kobashigawa，J. A.等，J Am Coll Cardiol,45,1532-1537 (2005))。低估疾病嚴重性造成的延誤診斷是冠狀血管造影的特征，其很大程度上用血管內(nèi)超聲(IVUS)克服。(Fitzgerald, P. J.等，Circulation, 86,154-158 (1992))然而，這兩種侵入性左心臟、動脈導(dǎo)管方法昂貴，為資源密集型，并且與顯著死亡風(fēng)險和患者不適相關(guān)聯(lián)。血管造影明顯疾病發(fā)展、移植物功能障礙或癥狀發(fā)作前的CAV早期檢測對指導(dǎo)新型治療的合適使用至關(guān)重要，所述治療延緩且偶爾逆轉(zhuǎn)CAV的進展。開發(fā)用于急性排斥和CAV的早期、非侵入性、安全且有成本效益的檢測的標記，和其快速轉(zhuǎn)化成能用于臨床的可行和可靠檢測，對美國接近22，000個和全世界相似數(shù)目的活心臟移植受體而言，是主要的未得到滿足的醫(yī)療需要。
近期研究還強調(diào)早期診斷和風(fēng)險分級的緊迫需要，證明在較新的免疫抑制方案后，CAV的進展延遲和/或逆轉(zhuǎn)。因為使用這些較新的療法受到副作用、藥物相互作用和成本的阻礙，重要的是鑒定受益超過風(fēng)險的患者。除對死亡率和發(fā)病率的影響外，CAV監(jiān)測在患者并發(fā)癥的資源利用和潛力方面花費昂貴。鑒于心臟移植后前五年每年施行冠狀血管造影的現(xiàn)行護理標準，每個存活5年的患者會接受4張血管造影照片，平均總成本是每張血管造影照片25，OOO美元。因為心臟移植后5年存活率是72%，接受心臟移植的2，000患者中約1，440患者每年會經(jīng)歷4次過程，總共至 少5，760次過程。每個冠狀血管造影的平均成本是25，000美元，每年監(jiān)控心臟移植后患者的保健花費總計144，000，000美元。鑒定低CAV風(fēng)險的非侵入性測試會指出冠狀血管造影可以在該組中安全避開，因此大幅降低長期管理的成本。
接受其他移植類型的患者經(jīng)歷相同的困難和花費。
a.循環(huán)核酸
循環(huán)或游離的DNA于1948年在人體血漿中首次檢測到。(Mandel，P. Metais，P.，C R Acad.Sci.巴黎，142，241-243 (1948))。此后，在多個領(lǐng)域建立其與疾病的聯(lián)系。(Tong, Y. K. Lo, Y. M. ,Clin Chim Acta，363，187-196(2006))。研究發(fā)現(xiàn)，在疾病例如癌癥中觀察到源自壞死或凋亡細胞血液的大量循環(huán)核酸(Giacona, M. B.等，Pancreas, 17,89-97(1998))和凋亡中核酸水平的大幅提高。(Giacona, ,M. B.等，Pancreas，17，89-97 (1998)；Fournie, G. J.等，Cancer Lett, 91, 221-227 (1995))。特別對于腫瘤，其中循環(huán) DNA 攜帶包括致癌基因突變、微衛(wèi)星改變在內(nèi)的疾病標記信號，并且對某些癌癥，病毒基因組序列、血漿中DNA或RNA已經(jīng)作為疾病潛在生物標記來越來越多地進行研究。例如，Diehl等近期顯示，與臨床使用的標準生物標記癌胚抗原相比，總循環(huán)DNA中低水平循環(huán)腫瘤DNA的定量分析可以作為檢測結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的更好標記。(Diehl,F.等,Proc Natl Acad Sci, 102,16368-16373 (2005) ；Diehl,F.等，Nat Med，14，985-990 (2008))。Maheswaran 等報道使用肺癌患者血漿中循環(huán)細胞基因分型來檢測會影響藥物治療的表皮生長因子受體的活性突變。(Maheswaran, S.等，N Engl J Med，359，366-377 (2008))。這些結(jié)果共同建立兩種循環(huán)DNA-血漿中游離的或來自循環(huán)細胞，作為癌癥檢測和治療的有用物質(zhì)。循環(huán)DNA也能用于健康患者的胎兒診斷，用母親血液中循環(huán)的胎兒DNA作為性別、恒河猴D (RhD)狀態(tài)，胎兒異倍體性和性別相關(guān)疾病的標記。Fan等近期顯示通過對取自母體血液樣品的游離DNA進行鳥槍測序來檢測胎兒異倍體性的策略，所述方法能取代更具侵入性和危險的技術(shù)，例如羊膜穿刺術(shù)或絨毛采樣。(Fan, H. C.，Blumenfeld, Y. J.，Chitkara, U.，Hudgins, L.，Quake, S. R. , Proc Natl Acad Sci，105，16266-16271 (2008))。
在循環(huán)核酸的所有這些應(yīng)用中，存在不同于患者正?；蛐偷男蛄杏糜跈z測疾病。在癌癥中，基因突變是疾病發(fā)展的信號；胎兒診斷中，與母體DNA相比，胎兒特異序列的檢測可以分析胎兒健康。
一些實施方式中，發(fā)明提供用于器官移植患者的非侵入性診斷，其中器官供體的序列在其他方面對患者為“異源”，可特定定量。不希望限于任何理論，由于游離DNA或RNA常由凋亡細胞產(chǎn)生，循環(huán)核酸中供體特異序列的相對量應(yīng)就包括但不限于心、肺、肝和腎的多種固體器官移植，提供移植患者中即將發(fā)生的器官衰竭的預(yù)測指標。
b.循環(huán)核酸和移植排斥
一些實施方式中，發(fā)明提供檢測和/或定量游離在血漿或來自循環(huán)細胞的循環(huán)核酸的方法，設(shè)備，組合物和試劑盒，以診斷、預(yù)測、檢測和/或治療移植狀態(tài)或結(jié)果。性別不匹配的肝和腎移植患者有供體DNA檢測的權(quán)利要求
；傳統(tǒng)PCR用于檢索女性患者血液中的男性供體Y染色體序列。(Lo, Y. M.等，Lancet，351，1329-1330 (1998))然而，在后續(xù)研究中，使用更加精確的定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)分析，Y染色體特異序列在上述背景18例患者中的16例沒有檢測到。(Lui, Y. Y.等，Clin Chem，49，495-496 (2003))腎移植中，分析相似性別不匹配移植患者的尿液樣品，并且在患者移植后和移植排斥反應(yīng)期間立即檢測Y染色體 DNA。(Zhang，J.等，Clin Chem，45，1741-1746 (1999) ；Zhong, X. Y.等，Ann N YAcad Sci，945，250-257 (2001))
實施例I檢測性別不匹配心臟移植受體并應(yīng)用數(shù)字PCR (Warren, L. , Bryder,D.，Weissman, I.L.，Quake, S. R.，Proc Natl Acad Sci,103,17807-17812 (2006) ；Fan,H. C. Quake, S. R.，Anal Chem, 79，7576-7579 (2007))以檢測與心內(nèi)膜心肌活檢測定 3A 或3B排斥反應(yīng)同時獲取的血漿樣品中源自供體染色體Y信號的水平。而4例對照女性-女性移植患者中沒有檢測到任何重要染色體Y信號，對三例跨越四個排斥反應(yīng)的男性-女性移植患者，觀察到排斥時間點染色體Y信號的I. 5-8%總基因組部分(圖2)。這些患者之一的時程研究顯示血漿中檢測的染色體Y水平在排斥前三個月血漿中可以忽略(neglible)，但是活檢確定排斥的時間，增加>10倍達到2%的總基因組部分(見圖3和4)。這些結(jié)果共同確立，就心臟移植患者而言血漿中出現(xiàn)的源自供體DNA可以作為器官衰竭開始的潛在標記。
盡管這些研究各顯示不同固體器官移植體液中的供體DNA，其都限于女性接受男性器官的特定病例，并且對女性接受女性、男性接受男性或男性接受女性并不適用。這種策略的其他問題源自女性患者普遍存在微嵌合性，其中，過去男性懷孕或輸血可以產(chǎn)生移植器官以外來源的Y染色體特異信號。(Hubacek, J. A.，Vymetalova, Y.，Bohuslavova,R. , Kocik, M. , Malek, I. , Transplant Proc,39,1593-1595 (2007) ；Vymetalova, Y 等，Transplant Proc，40，3685-3687 (2008))循環(huán)DNA中的供體特異人類白細胞抗原(HLA)等位基因檢測視作器官排斥的信號，特別是腎和胰腺移植患者。(Gadi，V. K.，Nelson, J. L.，Boespflug, N. D.，Guthrie, K. A.，Kuhr, C. S.，Clin Chem，52，379-382 (2006))然而，這種策略也受限在于不能區(qū)分所有供體和受體之間的HLA等位基因，特別是對普通HLA類型，以及微嵌合體如來自輸血的潛在復(fù)雜性。(Baxter-Lowe, L. A. Busch, M. P. , Clin Chem, 52,559-561 (2006))
一些實施方式中，發(fā)明提供移植患者的移植物排斥非侵入性檢測的通用方法，繞開其他外源DNA微嵌合體的潛在問題，并對所有器官受體通用而不考慮性別。一些實施方式中，生成供體器官的遺傳指紋。這種方法可對僅來自以獨立于供體和受體性別的方式完成器官移植的序列進行可靠鑒定。
一些實施方式中，供體和受體在移植前都能作基因型分析。能用于對移植供體和移植受體基因分型的方法示例包括但不限于，全基因組測序，外顯子組測序或多態(tài)性陣列(例如SNP陣列)。建立兩個來源之間的相關(guān)和可區(qū)分標記組。一些實施方式中，標記組包括多態(tài)標記組。多態(tài)標記包括單核苷酸多態(tài)性(SNP’S)，限制性片段長度多態(tài)性(RFLP’S)，短 串聯(lián)重復(fù)(STR)，可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(VNTR’ S)，超變區(qū)，小衛(wèi)星，二核苷酸重復(fù)，三核苷酸重復(fù)，四核苷酸重復(fù)，簡單重復(fù)序列，和插入元件例如Alu。一些實施方式中，標記組包括SNP。[0056]移植之后，能從患者得到體液例如血液，并分析標記。體液示例包括但不限于涂片，痰，活檢，分泌物，腦脊液，膽汁，血液，淋巴液，唾液，和尿液。供體特異標記(例如多態(tài)標記如SNP)的檢測、鑒定和/或定量能用循環(huán)核酸(例如游離DNA)的實時PCR、芯片(例如SNP芯片)、高通量鳥槍測序和包括本文所述方法的本領(lǐng)域其他方法進行。供體核酸比例能隨著時間監(jiān)控，并此比例增加能用于確定移植狀態(tài)或結(jié)果(例如移植排斥)。
在所述移植是異種移植的一些實施方式中，供體特異標記的檢測、鑒定和/或定量能通過對物種基因組的一個或多個核酸(例如DNA)作圖進行，以確定一個或多個核酸是否來自移植供體。當所述移植是異種移植時也可使用上述多態(tài)標記。
在本文所述的任何一個實施方式中，移植可以是任何固體器官或皮膚移植?？梢杂帽疚乃龇椒ǚ治龅钠鞴僖浦彩纠ǖ幌抻?，腎移植，胰腺移植，肝移植，心臟移植，肺移植，腸移植，腎移植后胰腺移植，和胰腎聯(lián)合移植。
樣品
—些實施方式中，本文所述方法包括對核酸進行一個或多個遺傳分析或檢測步驟。一些實施方式中，靶核酸來自接受移植物對象的所獲樣品。這些對象能是人或馴養(yǎng)動物，例如牛，雞，豬，馬，兔，狗，貓，或山羊。一些實施方式中，本發(fā)明使用的細胞取自患者。獲自動物例如人的樣品可包括，例如全血，汗，淚水，唾液，耳流出物，痰，淋巴，骨髓懸液，淋巴，尿液，唾液，精液，陰道流，腦脊液，腦液，腹水，乳汁，呼吸道分泌液，腸道或泌尿生殖道液，組織或器官(如肺)或從器官取下的組織灌洗液，如乳腺、肺、腸、皮膚、宮頸、前列腺、胰腺、心臟、肝和胃。例如，組織樣品可以包括功能相關(guān)細胞或相鄰細胞區(qū)域。這些樣品能包括細胞復(fù)合群，能用作群分析，或分成亞群。這些細胞和非細胞樣品能用離心，淘析，密度梯度分離，脫落分離，親和選擇，淘盤洗選，F(xiàn)ACS，泛影酸鹽離心等分離。通過使用特定細胞類型鑒定的標記特異性抗體，可以得到細胞的相對均一群?；蛘呖梢允褂卯愘|(zhì)細胞群。細胞還可以用濾器分開。例如，全血也能用于改造成包括選擇所需細胞類型或種類的孔尺寸的濾器。使用孔尺寸為5-10 μ m的濾器，細胞能從紅細胞裂解后稀釋的全血中過濾出，如美國專利申請?zhí)?9/790，673所公開。其他設(shè)備能從血流中分離細胞,見Demirci U,TonerM. , Direct etch method for microfluidic channel and nanoheight post-fabricationby picoliter droplets (微流體管道和皮升滴的納米高度制作后的直接侵蝕方法)，Applied Physics Letters2006 ;88(5)，053117 JPIrimia D,Geba D,Toner Μ. ,Universalmicrofluidic gradient generator (通用微流體梯度發(fā)生器)，Analytical Chemistry2006 ;78:3472-3477。一旦得到樣品，可以直接使用，冷凍，或短時間維持在適當培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明方法使用的分離一種或多種細胞的方法按本領(lǐng)域明確的標準技術(shù)和方法操作。
為得到血液樣品，可使用本領(lǐng)域任何已知技術(shù)，例如注射器或其他吸真空設(shè)備。血液樣品能任選預(yù)處理或富集前處理。預(yù)處理步驟的示例包括加入試劑，例如穩(wěn)定劑，防腐齊 ，固定劑，裂解試劑，稀釋劑，抗凋亡試劑，抗凝血劑，抗血栓劑，磁性調(diào)節(jié)劑，緩沖試劑，滲透壓調(diào)節(jié)劑，PH調(diào)節(jié)劑和/或交聯(lián)試劑。
當?shù)玫窖簶悠窌r，防腐劑例如抗凝血劑和/或穩(wěn)定劑能在富集前加入樣品。這能延伸分析/檢測時間。因此，從得到樣品時間的I周，6天，5天，4天，3天，2天，I天，12小時，6小時，3小時，2小時或I小時內(nèi)，能以本文任何方法和系統(tǒng)分析樣品,例如血液樣品。
一些實施方式中，血液樣品能與選擇性裂解血液樣品中一種或多種細胞或成分的試劑聯(lián)合。例如，選擇性裂解血小板和/或無核紅細胞以生成有核細胞富集樣品。隨后使用本領(lǐng)域已知方法分離感興趣細胞。
當從對象中得到樣品(例如血液樣品)時，數(shù)量根據(jù)對象大小和篩選情況而不同。一些實施方式中，得到多至50，40，30，20，10，9，8，7，6，5，4，3，2或11^樣品。一些實施方式中，得到1-50，2-40，3-30，或4_20mL樣品。一些實施方式中，得到多于5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95 或 IOOmL 樣品。
核酸
能用本文方法分析的樣品核酸包括雙鏈DNA，單鏈DNA，單鏈DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，DNA/RNA雜交體，RNA (例如mRNA或miRNA)和RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。能用于核酸操作的遺傳分析示例包括，例如測序，SNP檢測，STR檢測，RNA表達分析和基因表達。
一些實施方式中，從樣品中得到少于lpg, 5pg, IOpg, 20pg, 30pg, 40pg, 50pg, IOOpg,200pg,500pg,lng,5ng,IOng,20ng,30ng,40ng,50ng,IOOng,200ng,500ng,lug,5ug,IOug, 20ug, 30ug, 40ug, 50ug, IOOug, 200ug, 500ug 或 Img 核酸以用于進一步遺傳分析。一些病例中，從樣品中得到大約 l~5pg, 5-10pg, 10-100pg, lOOpg-lng, l_5ng, 5-lOng, lO-lOOng,IOOng-Iug核酸以用于進一步遺傳分析。
—些實施方式中，本文所述方法用于檢測和/或定量祀核酸分子。一些實施方式中，本文所述方法用于檢測和/或定量多個靶核酸分子。本文所述方法能分析至少I ;2 ；3 ；4 ；5 ;10，20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，000 ;2，000 ;5，000 ;10，000，20，000 ;50，000 ;100，000 ；200，000 ;300，000 ;400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ;900，000 ;1，000，000 ；2，000, 000或3，000, 000種不同靶核酸。
—些實施方式中，本文所述方法用于區(qū)分與另一種核酸差異Int的祀核酸。一些實施方式中，本文所述方法用于區(qū)分與另一種核酸差異Int或多于1,2,3,5,10,15,20,21,22，24，25，30nt 的靶核酸。
一些實施方式中，本文所述方法用于檢測和/或定量基因組DNA區(qū)。一些實施方式中，本文所述方法能區(qū)分和定量基因組DNA區(qū)。本文所述方法能區(qū)分和定量至少I ;2 ；3 ；4 ；5 ;10，20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，000 ;2，000 ;5，000 ;10，000，20，000 ;50，000 ;100，000 ；200，000 ;300，000 ;400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ;900，000 ;1，000，000 ；2，000, 000或3，000, 000種不同基因組DNA區(qū)。本文所述方法能區(qū)分和定量變化Int或多于 1,2,3,5,10，15, 20, 21, 22, 24, 25, 30nt 的基因組 DNA 區(qū)。
一些實施方式中，本文所述方法用于檢測和/或定量基因組DNA區(qū)，例如包含DNA多態(tài)性的區(qū)域。多態(tài)性指群體中出現(xiàn)兩個或多個遺傳決定的其他序列或等位基因。多態(tài)標記或位點是發(fā)生差異的基因座。優(yōu)選標記至少有兩個等位基因，每個優(yōu)選以大于1%的頻率發(fā)生，并更優(yōu)選大于10%或20%的選定群。多態(tài)性可以包括一個或多個堿基改變，插入，重復(fù)，或缺失。多態(tài)性基因座可以小至一個堿基對。多態(tài)標記包括單核苷酸多態(tài)性(SNP’S)，限制性片段長度多態(tài)性(RFLP’ S)，短串聯(lián)重復(fù)(STR)，可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(VNTR’ S)，超變區(qū)，小衛(wèi)星，二核苷酸重復(fù)，三核苷酸重復(fù)，四核苷酸重復(fù)，簡單重復(fù)序列，和插入元件例如Alu。兩個核酸之間的多態(tài)性能自然發(fā)生，或由暴露于或接觸化學(xué)物、酶或其他試劑，或暴露于能造成核酸損害的試劑例如紫外線輻射、誘變劑或致癌物所引起。一些實施方式中，本文所述方法能區(qū)分和定量包含DNA多態(tài)性的DNA區(qū)。本文所述方法能區(qū)分和定量至少I ;2 ；3；4 ；5 ;10，20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，OOO ;2，000 ;5，000 ;10，000，20，000 ;50，000 ;100，000 ；200，000 ;300，000 ;400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ;900，000 ;1，000，000 ；2，000，000 或 3，000，000 種 DNA 多態(tài)性。
一些實施方式中，本文所述方法能區(qū)分和定量至少I ;2 ；3 ；4 ；5 ；10,20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，000 ;2，000 ;5，000 ;10，000,20, 000 ;50，000 ;100，000 ;200，000 ;300，000 ；400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ;900，000 ;1，000，000 ;2，000，000 或3，000, 000種不同多態(tài)標記。
一些實施方式中，本文所述方法能區(qū)分和定量至少I ;2 ；3 ；4 ；5 ；10,20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，000 ;2，000 ;5，000 ;10，000,20, 000 ;50，000 ;100，000 ;200，000 ;300，000 ；400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ;900，000 ;1，000，000 ;2，000，000 或3，000，000 種不同 SNP。、
—些實施方式中,本文所述方法用于檢測和/或定量基因表達。一些實施方式中，本文所述方法提供多個基因的高度區(qū)分和定量分析。本文所述方法能區(qū)分和定量至少1，2，3，4，5，10，20，50，100，200，500，I, 000，2，000，5，000，10，000，20，000，50，000，100，000 種不
同革巴核酸的表達。
—些實施方式中，本文所述方法用于檢測和/或定量有相似序列的基因表達。本文所述方法能區(qū)分和定量變化Int或多于I, 2, 3,4, 5,10,12,15, 20, 21, 22, 24, 25, 30nt的
基因表達。
一些實施方式中，本文所述方法通過對物種基因組區(qū)作圖來檢測和/或定量基因組DNA區(qū)，其中移植供體和移植受體來自不同物種(即異種移植)。一些實施方式中，本文所述方法能區(qū)分和定量來自一個物種的DNA區(qū)。本文所述方法能區(qū)分和定量至少I ;2 ;3 ;
4；5 ;10，20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，000 ;2，000 ;5，000 ;10，000,20, 000 ;50，000 ;100，000 ；200，000 ;300，000 ;400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ;900，000 ;1，000，000 ；2，000，000或3，000，000種來自一個物種的DNA區(qū)。
一些實施方式中，本文所述方法能用來診斷或預(yù)測移植狀態(tài)或結(jié)果(例如移植排斥)。一些實施方式中，本文所述方法能用來檢測和/或定量目標核酸，以測定患者或?qū)ο笫欠耧@示移植耐受性。一些實施方式中，本文所述方法能用來檢測和/或定量靶核酸，以診斷或預(yù)測移植排斥。一些實施方式中，本文所述方法能用來檢測和/或定量靶核酸，以確定接受移植例如同種異體移植物的對象的免疫抑制治方案。一些實施方式中，本文所述方法能用來檢測和/或定量靶核酸，以預(yù)測接受移植對象的移植存活。發(fā)明提供診斷或預(yù)測移植患者或?qū)ο蟮囊浦参锸谴婊罨蚴菃适У姆椒āＤ承嵤┓绞街?，本文述方法能用來檢測和/或定量靶核酸，以診斷或預(yù)報長期移植存活的出現(xiàn)。一些實施方式中，本文所述方法能用來檢測和/或定量靶核酸，以診斷或預(yù)測基于非排斥的移植損傷。基于非排斥移植損傷的示例包括但不限于，缺血損傷，病毒感染，圍手術(shù)期缺血，再灌注損傷，高血壓，生理應(yīng)激，活性氧自由基造成的損傷和藥物試劑造成的損傷。
本文所用術(shù)語“診斷”移植狀態(tài)或結(jié)果的或“下診斷結(jié)論”包括預(yù)測或診斷移植狀態(tài)或結(jié)果，確定移植狀態(tài)或結(jié)果的傾向，監(jiān)控移植患者的治療，診斷移植患者的治療反應(yīng)，和預(yù)后移植狀態(tài)或結(jié)果、移植進展和對特定治療的反應(yīng)。
供體器官核酸檢測和分析[0080]一些實施方式中，所述方法，設(shè)備，組合物和試劑盒用于移植前建立供體和受體的基因型從而能在移植后從器官受體的體液(例如血液或尿液)檢測供體特異核酸，例如DNA或RNA。這種方法能對僅來自以獨立于供體和受體性別的方式完成器官移植的序列進行可
靠鑒定。
一些實施方式中，生成供體器 官的遺傳指紋。供體和受體在移植前都作基因型分析。移植供體和移植受體基因分型使用可區(qū)分標記建立分布以檢測供體核酸(例如循環(huán)游離核酸或來自循環(huán)供體細胞的核酸)。一些實施方式中，對于異種移植，供體核酸能對供體物種基因組作圖。
移植之后，能從患者得到上述樣品，并分析標記。供體核酸比例隨著用時間監(jiān)控，且此比例增加能用于確定移植狀態(tài)或結(jié)果(例如移植排斥)。
一些實施方式中，基因分型包括檢測和定量來自循環(huán)移植供體細胞的核酸或循環(huán)游離核酸。核酸示例包括但不限于，雙鏈DNA，單鏈DNA，單鏈DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，DNA/RNA雜交體，RNA (mRNA或miRNA)和RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。一些實施方式中，所述核酸是DNA。一些實施方式中，所述核酸是RNA。例如，游離RNA也在人血漿中出現(xiàn)(Tong，Y. K. Lo, Y. Μ.，Clin ChimActa，363，187-196 (2006))并且器官特異轉(zhuǎn)錄物的cDNA測序提供檢測源自移植器官細胞的供體特異核酸的另一選擇。一些實施方式中，使用從血液中循環(huán)細胞收集的核酸。
一些實施方式中，基因分型包括檢測和定量多態(tài)標記。多態(tài)標記的示例包括單核苷酸多態(tài)性(SNP’ S)，限制性片段長度多態(tài)性(RFLP’ S)，可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(VNTR’ S)，短串聯(lián)重復(fù)(STR)，超變區(qū)，小衛(wèi)星，二核苷酸重復(fù)，三核苷酸重復(fù)，四核苷酸重復(fù)，簡單重復(fù)序列，和插入元件例如Alu。一些實施方式中，基因分型包括檢測和定量STRs。一些實施方式中，基因型包括檢測和定量VNTR。
一些實施方式中，基因分型包括檢測和定量SNP。不希望限于任何理論，如果充分進行基因分型，任何供體和受體在約3百萬SNP位點不同?？墒褂玫腟NP對受體必須是純合子，并理想上對供體也是純合子。而大部分這些位點會包括對供體或受體雜合的SNP,超過10%(或成百上千)對供體和受體都是純合子，意味著SNP位點的直接讀取能區(qū)分受體DNA和供體DNA。例如，移植供體和移植受體基因分型后，使用本領(lǐng)域已知的包括本文所述在內(nèi)的現(xiàn)存基因型檢測平臺，能在移植供體和移植受體之間鑒定大約一百二十萬個總變化。可用SNP可以包括約500，000個雜合供體SNP和約160，000個純合供體SNP。公司(例如應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems, Inc.))目前提供用于SNP基因型的標準和定制TaqMan探針裝置，能原則上靶向任何基于PCR分析的所需SNP位置(Livak，K. L. ,Marmaro,J. , Todd, J. A. , Nature Genetics, 9, 341-342 (1995) ；De La Vefa, F. M. , Lazaruk, K. D.,Rhodes, M. D. , ffenz, M. H. , Mutation Research, 573,111-135 (2005))。有這種大潛在 SNP庫來從現(xiàn)存或定制探針的合適子集中選擇，能選定用作任何供體/受體對的探針組。一些實施方式中，從血漿或其他生物樣品中回收的核酸的數(shù)字PCR或?qū)崟rPCR可以直接定量樣品中可見的供體特異種類的百分比。一些實施方式中，從血漿或其他生物樣品中回收的核酸的測序可以直接定量樣品中可見的供體特異種類的百分比。一些實施方式中，陣列可用于從血漿或其他生物樣品中回收的核酸以直接定量樣品中可見的供體特異種類的百分比。
由于對患者樣品中任何個體核酸(例如SNP)的期望讀取數(shù)低，在分析前需要一些樣品物質(zhì)的預(yù)擴增以增加信號水平，但是使用預(yù)擴增，更多靶核酸位置取樣(例如SNP位置)，或兩者，會提供移植供體核酸部分的可靠讀取。預(yù)擴增能用本領(lǐng)域已知的任何合適方法進行，例如多重置換擴增(MDA)(Gonzalez 等 Envircon Microbiol ；7(7) ；1024-8(2005))或巢式PCR方法中用外引物擴增。這可以檢測和分析供體核酸，盡管樣品(例如移植患者的血液)中供體核酸總量只達到 I μ g, 500ng, 200ng, IOOng, 50ng, 40ng, 30ng, 20ng, IOng, 5ng,lng, 500pg, 200pg, IOOpg, 50pg, 40pg, 30pg, 20p, IOpg, 5pg,或 Ipg 或者在 15 μ g, 510 μ g,或1050 μ g 間。
a. PCR
供體和受體核酸的基因分型和/或檢測，鑒定和/或定量移植后供體特異核酸(例如多態(tài)標記如SNP)能用PCR完成。能用于檢測，鑒定和/或定量供體特異核酸的PCR技術(shù)示例包括但不限于定量PCR，熒光定量PCR (QF-PCR)，多重?zé)晒釶CR (MF-PCR)，實時PCR(RT-PCR)，單細胞 PCR，限制性片段長度多態(tài)性 PCR (PCR-RFLP)，PCR-RFLP/RT-PCR-RFLP，熱啟動PCR,巢式PCR,原位菌落(polonony)PCR,原位滾環(huán)擴增(RCA),橋式PCR, picotiterPCR和乳劑PCR。其他合適擴增方法包括連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，轉(zhuǎn)錄擴增，自我維持的序列復(fù)制， 靶多核苷酸序列選擇性擴增，共有序列引物聚合酶鏈反應(yīng)(CP-PCR)，隨機引物聚合酶鏈反應(yīng)(AP-PCR)，簡并寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR)和基于核酸序列的擴增(NABSA)。能用于擴增特定多態(tài)性基因座的其他擴增方法包括美國專利號5，242，794，5，494，810，4，988，617和6，582，938所述方法。一些實施方式中，檢測，鑒定和/或定量供體特異核酸(例如多態(tài)標記如SNP)用實時PCR完成。
一些實施方式中，數(shù)字PCR或?qū)崟rPCR定量已在移植前起始基因分型步驟中鑒定的特定多態(tài)性的出現(xiàn)。與一些早期引用工作使用的定量PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR是更加精確和可靠的方法，用于定量包括稀有核酸種類在內(nèi)的核酸種類，并且不需要供體和受體之間的特定性別關(guān)系。(Warren, L.，Bryder, D.，Weissman, I. L.，Quake, S. R.，Proc Natl AcadSci, 103，17807-17812 (2006))。一些實施方式中，可采用數(shù)字PCR或?qū)崟rPCR分析在移植患者中用靶向數(shù)個SNP探針來定量供體DNA部分。
b.測序
供體和受體核酸的基因分型和/或檢測，鑒定和/或定量移植后供體特異核酸(例如多態(tài)標記如SNP)能用測序例如全基因組測序或外顯子組測序完成。測序能用本領(lǐng)域熟知的經(jīng)典桑格(Sanger )測序法完成。測序也能使用高通量系統(tǒng)完成，其中一些可在測序核苷摻入延長鏈之后或摻入時立即加以檢測，例如紅色時間或基本實時的序列檢測。一些實施方式中，高通量測序每小時產(chǎn)生至少1，000，至少5，000，至少10，000，至少20，000，至少30，000，至少40，000，至少50，000，至少100，000或至少500，000序列讀取，每個讀取有至少50，至少60，至少70，至少80，至少90，至少100，至少120，或至少150堿基。測序能用本文所述核酸完成，例如基因組DNA，從RNA轉(zhuǎn)錄物或RNA作為樣板獲得的cDNA。
一些實施方式中，高通量測序包括使用螺旋生物科學(xué)公司(Helicos BioSciencesCorporation，馬薩諸塞州劍橋)的可用技術(shù)，例如合成方法的單分子測序(SMSS)。SMSS有獨特性，因為它可以測序整個人基因組，而不需要預(yù)擴增步驟。因此降低核酸檢測中的變形和非線性。這種測序方法也可在基本實時或?qū)崟r測序中檢測SNP核苷。最后，如上所述， SMSS強效，因為如MIP技術(shù)，它不需要雜交前的預(yù)擴增步驟。事實上，SMSS不需要任何擴增。SMSS 部分描述于美國公開申請?zhí)?20060024711 ；20060024678 ；20060012793 ；20060012784 ；和 20050100932。
一些實施方式中，高通量測序包括使用454生命科學(xué)公司(康涅狄格州布蘭福德)的可用技術(shù)，例如包括光纖板的Pico Titer板,其傳送由設(shè)備中CCD照相機記錄的測序反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號。光纖的使用可以在4. 5小時內(nèi)檢測最少2千萬堿基對。
珠擴增后光纖檢測的方法描述于Marguiles, M.等，“Genome sequencing inmicrofabricated high-density pricolitre reactors (微型高密度 pricolitre 反應(yīng)器的基因組測序)”，Nature, doi:10. 1038/nature03959 ;以及美國公開申請?zhí)?20020012930 ；20030058629 ；20030 1001 02 ；20030 148344 ；20040248 161 ；20050079510,20050124022 ;和 20060078909。
一些實施方式中，高通量測序使用克隆單分子芯片(Solexa公司)或使用可 逆中止化合化學(xué)物染料的邊合成邊測序(SBS)完成。這些技術(shù)部分描述于美國專利號6，969，488 ；6，897，023 ;6，833，246 ;6，787，308 和美國公開申請?zhí)?20040106130 ；20030064398 ；20030022207 ;和 Constans, A, The Scientist 2003，17 (13):36。
此方面的一些實施方式中，RNA或DNA的高通量測序能使用AnyDot芯片(德國Genovoxx)完成，它可以監(jiān)控生物過程(例如miRNA表達或等位基因變化性(SNP檢測))。特別的，AnyDot芯片使得核苷熒光信號檢測提高10x-50x。AnyDot芯片和其使用方法部分描述于國際公開申請?zhí)?WO 02088382, WO 03020968, WO 0303 1947, WO 2005044836, PCTEP05105657，PCMEP05105655 ;和德國專利申請?zhí)?DE 101 49 786，DE 102 14 395，DE 10356 837，DE 10 2004 009 704，DE 10 2004 025 696，DE 10 2004 025 746，DE 10 2004025694，DE 10 2004 025 695，DE 10 2004 025 744，DE 10 2004 025 745，和 DE 102005012 301。
其他高通量測序系統(tǒng)包括描述于Venter, J.等，Science 16 February 2001 ；Adams, Μ.等，Science 24March 2000 ;和 M. J, Levene 等 Science 299:682-686, January2003 ;和美國公開申請?zhí)朜o. 20030044781和2006/0078937的系統(tǒng)。全部這些系統(tǒng)包括靶核酸分子測序，所述分子有通過核酸分子上測量的聚合反應(yīng)短暫加入堿基的多種堿基，即，實時跟隨待測序核酸分子模板上的核酸聚合酶活性。然后通過鑒定哪個堿基經(jīng)每個堿基加入序列步驟的核酸聚合酶的催化活性來摻入靶核酸的延長互補鏈，可推斷序列。在適合沿著靶核酸分子移動和在活性位點延伸寡核苷酸引物的位置提供靶核酸分子復(fù)合物的聚合酶。在活性位點附近提供多種經(jīng)標記的核苷類似物類型，每一個可區(qū)分類型的核苷類似物與靶核酸序列中的不同核苷互補。通過使用聚合酶加入核苷類似物到活性位點的核酸鏈來延伸增長核酸鏈，其中加入的核苷類似物與活性位點的靶核酸的核苷互補。作為聚合步驟結(jié)果，鑒定聚合步驟產(chǎn)生的加入寡核苷酸引物的核苷類似物。重復(fù)提供經(jīng)標記核苷類似物、聚合增長核酸鏈并且鑒定加入核苷類似物的步驟，從而核酸鏈進一步延伸并鑒定靶核酸序列。
在一些實施方式中，進行鳥槍測序。鳥槍測序中，DNA隨機碎成大量小片段，使用鏈終止法測序來獲得讀取。靶DNA的多個重疊讀取通過幾輪分裂和測序完成。然后計算機程序使用不同讀取的重疊末端將其組裝成連續(xù)序列。
一些實施方式中，發(fā)明提供使用測序檢測和定量SNP的方法。這種情況可以估計檢測靈敏度。靈敏度有兩個組成(i)分析的分子數(shù)目(測序深度)和(ii)測序過程的錯誤率。關(guān)于測序深度，個體之間變化的頻率估計是約千分之一堿基差異。目前，測序儀如Illumina基因組分析儀(Illumina Genome Analyzer)已經(jīng)讀取超過36堿基對長度。不希望限于任何理論或具體實施方式
，這意味著30個分析分子中約一個有潛在SNP。而受體血液中的供體DNA部分目前不能很好確定且取決于器官類型，可以根據(jù)心臟移植患者的文獻和應(yīng)用研究取1%作為基線預(yù)測。作為此供體DNA部分，3，000個分析分子中約有I個來自供體并提供關(guān)于供體基因型的信息?；蚪M分析儀上，每個分析通道能得到約I千萬分子，并且每次設(shè)備運行有8個分析通道。因此，如果每個通道加載一個樣品，應(yīng)該能檢測鑒定來自供體來源的約3000個分子，使用上述參數(shù)足以精確測定供體DNA部分。如果通過要求檢測至少100個供體分子來確立此方法靈敏度下限，那么當供體部分小至O. 03%時，應(yīng)該有能夠檢測供體分子的靈敏度。更高靈敏度能簡單通過測序更多分子得到，即使用更多通道。
測序錯誤率也影響此技術(shù)的靈敏度。對于平均錯誤率ε，誤讀引起的偶然鑒定為供體來源的單SNP幾率約為ε/3。對每一個單獨讀取，這建立能確定讀取是由于供體或是受體的靈敏度下限。堿基替換的典型測序錯誤率在不同平臺上不同，但是為O. 5-1.5%。這 使得靈敏度潛在限度為O. 16-0. 50%。然而，通過多次重新測序樣品模板能系統(tǒng)性降低測序錯誤率，如螺旋生物科學(xué)(Harris，T. D等，Science，320，106-109 (2008))所證明。重新測序的單獨應(yīng)用會使供體SNP檢測的期望錯誤率降低到ε 2/9或少于.003%。
圖5顯示發(fā)明的一個實施方式，一種監(jiān)控所有患者的通用方法(即不只是接受男性器官的女性患者)用于測定移植狀態(tài)或結(jié)果。供體和受體的基因型能建立單核苷酸多態(tài)性(SNP)分布以檢測供體DNA。分析所觀察的獨特SNP，血漿中游離DNA的鳥槍測序可定量％供體DNA。而考慮到成百上千或更多信號，任何單獨SNP難以檢測血漿中如此少的DNA，高靈敏度應(yīng)可行。
c.陣列
供體和受體核酸的基因分型和/或檢測，鑒定定和/或定量移植后供體特異核酸(例如多態(tài)標記如SNP)能用陣列(例如SNP陣列)完成。使用能觀察收集數(shù)據(jù)強度的掃描儀以及檢測和定量核酸的軟件，可呈現(xiàn)結(jié)果。這些方法部分公開于美國專利號6，505，125。本發(fā)明設(shè)想的檢測和定量核酸的另一種方法涉及使用Illumina公司(圣地亞哥)市售可得珠并描述于美國專利號7，035, 740 ;7033，754 ;7，025, 935，6，998，274 ;6，942，968 ;6，913，884 ;6，890，764 ;6，890，741 ;6，858，394 ;6，812，005 ；6，770，441 ;6，620，584 ；G, 544，732 ;6，429，027 ;6，396，995 ;6，355，431 和美國公開專利號 20060019258 ；0050266432 ；20050244870 ；20050216207 ；20050181394 ；20050164246 ；20040224353 ；20040185482 ；20030198573 ；20030175773 ；20030003490 ；20020187515 ；和20020177141 ;和 B. E. Stranger 等，Public Library of Science-Genetics, I (6), 2005 年12 月；Jingli Cai 等，Stem Cells, 2005 年 11 月 17 日在線發(fā)表；C. M. Schwartz 等，StemCells and Development, f4,517-534, 2005 ；Barnes, M. , J.等，Nucleic Acids Research,33 (181，5914-5923，2005 年 10 月；和 Bibikova M 等，Clinical Chemistry，第 50 卷，12期，2384-2386，2004年12月。珠陣列RNA制備的其他描述見Kacharmina JE等，MethodsEnzymol,303:3-18,1999 ；Pabon C 等，Biotechniques 31 (4) :8769, 2001 ；Van Gelder RN等，Proc Natl Acad Sci USA87:1663-7 (1990);和 Murray，SS. BMC Genetics B (增刊
I):SX5 (2005)。
當根據(jù)本文所述方法分析SNP時，移植供體和/或受體核酸能進行標記并與DNA微陣列雜交(例如IOOK設(shè)置陣列或其他陣列)。可用能觀察收集數(shù)據(jù)強度的掃描儀和軟件“呼叫”每個分析位置存在的SNP來觀察結(jié)果。使用數(shù)據(jù)h m圖陣列檢測基因型的計算機執(zhí)行方法公開于，例如，Liu等，Bioinformaticsl9:2397-2403, 2003 JPDi等，Bioinformatics 21:1958-63, 2005。使用圖陣列數(shù)據(jù)連鎖分析的計算機執(zhí)行方法公開于，例如，Ruschendorf 和 Nusnberg, Bioinfonnatics 21:2123-5, 2005 ；和 Leykin 等，BMCGenet. 6:7,2005 ;和美國專利號 5，733，729。
此方面的在一些實施方式中，用于檢測SNP的基因型微陣列能與分子倒置探針(MIPS)聯(lián)用，如描述于 Hardenbol 等，Genome Res. 15 (2) : 269-275，2005，Hardenbol,P 等 Nature Biotechnology 21(6),673-8, 2003 ；Faham M 等，Hum Mol Genet. 8 月 I ;10 (16):1657-64, 2001:Maneesh Jain 博士 等，Genetic Engineering News V24:18號，2004 ；和 Fakhrai-Rad H 等，Genome Res. 7 月；14(7) : 1404-12，2004 ;和美國專利號5，858，412。使用定制MlP板操作這種基因座特定基因分型的通用標簽陣列和試劑 盒可獲自昂飛(Affymetrix)和ParAllele公司。MIP技術(shù)包括使用單個實驗中分數(shù)多至 10，000:20，000，50，000 ;100，000 ;200，000 ;500，000 ;1，000，000 ;2，000，000 或5，000，000SNP (靶核酸)的酶反應(yīng)。所述酶反應(yīng)對多個探針分子間的交叉反應(yīng)性不敏感，并且不需要基因組DNA和探針雜交前的預(yù)擴增。在任何實施方式中，靶核酸或SNP能從單個細胞獲得。
本發(fā)明設(shè)想的檢測靶核酸的另一種方法涉及珠陣列的使用(例如，如Illumina公司的市售可得芯片)，描述于美國專利號7, 040，959 ;7，035，740 ;7033，754 -J, 025，935，6，998，274 ;6，942，968 ;6，913，884 ;6，890，764 ;6，890，741 ;6，858，394 ;6，846，460 ；6，812，005 ;6，770，441 ;6，663，832 ;5，520，584 ;6，544，732 ;6，429，027 ;6，396，995 ；6，355，431 m d 美國公開申請?zhí)?20060019258 ；20050266432 ；20050244870 ；20050216207 ；20050181394 ；20050164246；20040224353 ；20040185482 ；20030198573 ；200301 75773 ；20030003490 ；20020187515 ；和 20020177141 ;和 Shen, R.等 Mutation Research 57370-82 (2005)。
d.其他技術(shù)
本文的一些實施方式中，定量核酸。定量核酸的方法為本領(lǐng)域已知，包括但不限于氣相色譜，超臨界流體色譜，液相色譜(包括分配色譜，吸附色譜，離子交換色譜，尺寸排阻色譜，薄層色譜和親和層析)，電泳(包括毛細管電泳，毛細管區(qū)帶電泳，毛細管等電聚焦，毛細管電色譜，膠束電動毛細管色譜法，毛細管等速電泳，瞬時等速電泳和毛細管凝膠電泳)，比較基因組雜交(CGH)，微陣列，珠陣列，和高通量基因分型，例如使用分子倒置探針(MIP)0
本發(fā)明設(shè)想的檢測和/或定量靶核酸的另一種方法涉及納米報告器(nanoreporter)的使用，描述于題為 “Methods for detection and quantification ofanalytes in complex mixtures (復(fù)雜混合物中分析物的檢測和定量方法)”的美國專利7，473，767,題為“Methods for detection and quantification of analytes in complexmixtures (復(fù)雜混合物中分析物的檢測和定量方法)”的美國專利公開號2007/0166708，題為 “Compositions comprising oriented, immobilized macromolecules and methodsfor their preparation (包括定向固定大分子的組合物和其制備方法)”的美國申請?zhí)?1/645，270,題為“Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof (納米報告器和其生成方法及應(yīng)用)”的PCT申請?zhí)朥S06/049274，
靶核酸定量能用于測定供體核酸例如DNA的百分比。
e.標記
靶核酸的檢測和/或定量能用本領(lǐng)域已知的熒光染料完成。通常熒光染料可以分成幾個家族，例如熒光素及其衍生物；羅丹明及其衍生物；菁藍及其衍生物；香豆素及其衍生物；Cascade Blue 及其衍生物；熒光素黃及其衍生物；氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川(BODIPY)及其衍生物等。熒光團的示例包括吲哚碳菁(C3)，吲哚二碳菁(C5)，Cy3，Cy3. 5，Cy5, Cy5. 5, Cy7,德克薩斯紅,太平洋藍，俄勒網(wǎng)綠 488, Alexa Fluor-355, Alexa Fluor488,Alexa Fluor532, Alexa Fluor546, Alexa Fluor555, Alexa Fluor568, Alexa Fluor594,Alexa Fluor647, Alexa Fluor660, Alexa Fluor680, JOE, _絲胺，羅丹明綠，B0DIPY,異硫氰酸熒光素(FITC)，羧基熒光素(FAM)，藻紅蛋白，羅丹明，二氯羅丹明(dichlororhodamine)(dRhodamine ),羧基四甲基羅丹明(TAMRA ),羧基-X-羅丹明(R0X. TM. )，LIZ , VIC ,NED , PET , SYBR, PicoGreen, RiboGreen 等。熒光團和其使用的描述可見 R. Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Products (《突光探針和研究產(chǎn)物手冊》)，第 9 增補版(2002), Molecular Probes (《分子探針》)，Eugene, Oreg. ;Μ· Schena,Microarray Analysis (《微陣列分析》)(2003),約翰威利出版公司John ffiley&Sons,Hoboken, N. J.;合成藥物化學(xué)公司(Synthetic Medicinal Chemistry) 2003/2004 產(chǎn)品目錄，Berry 和同事，Ann Arbor,Mich. ；G. Hermanson,Bioconjugate Techniques (《生物結(jié)合技術(shù)》)，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press) (1996);和弗吉尼亞州斯特靈的格倫研究公司(GlenResearch) 2002年產(chǎn)品目錄。近紅外染料顯然在術(shù)語熒光團和熒光報道基團的意義內(nèi)。
本發(fā)明的另一個方面，支鏈DNA (bDNA)方法用于增加檢測靈敏度。一些實施方式中，bDNA方法用于陣列檢測分析。陣列檢測分析可以是本領(lǐng)域已知的任何陣列分析，包括本文所述陣列分析。bDNA方法通過連接幾十乃至幾百堿性磷酸酶分子的支鏈DNA擴大信號。因此，當維持最初核酸目標豐度保真度時，信號明顯擴大。
方法
發(fā)明的一個方面提供診斷或預(yù)測接受移植物對象的移植狀態(tài)或結(jié)果的方法。移植狀態(tài)或結(jié)果可以包括排斥，耐受性，基于非排斥的移植損傷，移植功能，移植存活，慢性移植損傷，或免疫抑制藥理學(xué)效價?；诜桥懦獾耐N異體移植損傷示例包括但不限于，缺血損傷，病毒感染，圍手術(shù)期缺血，再灌注損傷，高血壓，生理應(yīng)激，活性氧自由基造成的損傷和藥物試劑造成的損傷。移植狀態(tài)或結(jié)果可包括移植器官的血管并發(fā)癥或腫瘤發(fā)生。
在一些實施方式中，發(fā)明提供診斷或預(yù)測移植狀態(tài)或結(jié)果的方法，所述方法包括以下步驟(i )提供接受供體移植物的對象的樣品；(ii )測定是否存在來自供體移植的一個或多個核酸，其中供體的一個或多個核酸根據(jù)預(yù)定標記分布鑒定jP(iii)根據(jù)是否存在來自所述供體的一個或多個核酸來診斷或預(yù)測移植狀態(tài)或結(jié)果。
在一些實施方式中，發(fā)明的方法用于移植前建立供體和受體兩者的基因型。在一些實施方式中，移植前建立供體和受體兩者的基因型可以如本文所述在移植后器官受體的體液(例如血液或尿液)中檢測供體特異核酸例如DNA或RNA。在一些實施方式中，供體標記分布根據(jù)移植供體的基因分型確定。在一些實施方式中，移植受體的標記分布根據(jù)移植受體基因分型確定。在一些實施方式中，標記分布通過選擇區(qū)分移植供體和接受移植對象的標記來建立。這種方法可對僅來自以獨立于供體和受體性別的方式完成器官移植的核酸進行可靠鑒定。
移植供體和/或移植受體的基因分型可以由本領(lǐng)域已知的任何合適方法進行，包括本文所述方法例如測序、核酸陣列或PCR。在一些實施方式中，移植供體和/或移植受體的基因分型用鳥槍測序完成。在一些實施方式中，移植供體和/或移植受體的基因分型用DNA陣列完成。在一些實施方式中，移植供體和/或移植受體的基因分型用多態(tài)性陣列例如SNP陣列完成。
一些實施方式中，標記分布是多態(tài)標記分布。多態(tài)標記分布包括一種或多種單核苷酸多態(tài)性(SNP’S)，一種或多種限制性片段長度多態(tài)性(RFLP’S)，一種或多種短串聯(lián)重復(fù)(STR)，一種或多種可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(VNTR’S)，一個或多個超變區(qū)，一個或多個小衛(wèi)星，一個或多個二核苷酸重復(fù)，一個或多個三核苷酸重復(fù)，一個或多個四核苷酸重復(fù)，一個 或多個簡單重復(fù)序列，或一個或多個插入元件。一些實施方式中，標記分布包括至少I ;2 ；
3；4 ；5 ;10，20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，000 ;2，000 ;5，000 ;10，000，20，000 ;50，000 ;100，000 ；200，000 ;300，000 ;400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ;900，000 ;1，000，000 ；2，000, 000或3，000, 000種不同多態(tài)標記。
—些實施方式中，多態(tài)標記分布包括一種或多種SNP。一些實施方式中，標記分布包括至少 I ；2 ；3 ；4 ；5 ;10，20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，000 ;2，000 ;5，000 ;10，000，20，000 ；50，000 ;100，000 ;200，000 ;300，000 ;400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ；900，000 ;1，000，000 ;2，000，000 或 3，000，000 種不同 SNP。
移植之后，可從患者獲取上述樣品并分析是否存在來自移植供體的一個或多個核酸。在一些實施方式中，所述樣品是血液，血漿，血清或尿液。供體核酸比例和/或數(shù)量能隨著時間監(jiān)控，且此比例增加能用于確定移植狀態(tài)或結(jié)果(例如移植排斥)。
移植受體是否存在來自移植供體的一個或多個核酸可以由本領(lǐng)域已知的任何合適方法測定，包括本文所述方法例如測序，核酸陣列或PCR。一些實施方式中，移植受體是否存在來自移植供體的一個或多個核酸由鳥槍測序確定。一些實施方式中，移植受體是否出存在來自移植供體的一個或多個核酸由DNA陣列測定。一些實施方式中，移植受體是否存在來自移植供體的一個或多個核酸用多態(tài)性陣列例如SNP陣列測定。
在所述移植是異種移植的一些實施方式中，供體特異標記的檢測、鑒定和/或定量能通過對物種基因組的一個或多個核酸(例如DNA)作圖來完成，以確定一個或多個核酸是否來自移植供體。上述多態(tài)標記也能用于移植是異種移植的情況。
一些實施方式中，移植受體是否存在來自移植供體的循環(huán)DNA或RNA可用于測定移植狀態(tài)或結(jié)果。DNA可以是雙鏈DNA，單鏈DNA，單鏈DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，或cDNA。RNA可以是單鏈RNA或RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。一些實施方式中，移植受體是否存在來自移植供體的循環(huán)DNA/RNA雜交體可用于測定移植狀態(tài)或結(jié)果。一些實施方式中，移植受體是否存在來自移植供體的循環(huán)mRNA可用于測定移植狀態(tài)或結(jié)果。一些實施方式中，移植受體是否存在來自移植供體的循環(huán)DNA可用于測定移植狀態(tài)或結(jié)果。一些實施方式中，cDNA用于測定移植狀態(tài)或結(jié)果。DNA或RNA能從循環(huán)供體細胞中獲得?；蛘?，DNA或RNA可以是循環(huán)游離DNA或循環(huán)游離 RNA。[0125]本文所述的任何一個實施方式中，移植可以是任何固體器官和皮膚移植。移植狀態(tài)或結(jié)果能用本文所述方法測定的移植示例包括但不限于，腎移植，心臟移植，肝移植，胰腺移植，肺移植，腸移植和皮膚移植。
一些實施方式中，發(fā)明提供測定患者或?qū)ο笫欠耧@示移植耐受性的方法。一些實施方式中，發(fā)明提供診斷或預(yù)測移植排斥的方法。術(shù)語“移植排斥”包括急性和慢性移植排斥。一些實施方式中，發(fā)明還包括確定接受移植物例如同種異體移植物的對象的免疫抑制方案的方法。一些實施方式中，發(fā)明還包括測定接受移植物對象的免疫抑制方案效果的方法。發(fā)明的某些實施方式提供預(yù)測接受移植物對象的移植存活的方法。發(fā)明提供診斷或預(yù)測移植患者或?qū)ο蟮囊浦参锸谴婊罨蚴菃适У姆椒āＤ承嵤┓绞街?，發(fā)明提供診斷或預(yù)測出現(xiàn)長期移植物存活的方法。一些實施方式中，發(fā)明提供診斷或預(yù)測基于非排斥移植損傷的方法?；诜桥懦庖浦矒p傷的示例包括但不限于，缺血損傷，病毒感染，圍手術(shù)期缺血，再灌注損傷，高血壓，生理應(yīng)激，活性氧自由基造成的損傷和藥物試劑造成的損傷。一些實施方式中，發(fā)明提供診斷或預(yù)測移植器官的血管并發(fā)癥或腫瘤發(fā)生的方法。、
—些實施方式中,移植受體樣品中來自移植供體的一個或多個核酸量用于測定移植狀態(tài)或結(jié)果。因此，一些實施方式中，發(fā)明方法還包括定量來自移植供體的一個或多個核酸。一些實施方式中，來自供體樣品的一個或多個核酸量測定為樣品中總核酸的百分比。一些實施方式中，來自供體樣品的一個或多個核酸量測定為樣品中總核酸的比例。一些實施方式中，來自供體樣品的一個或多個核酸量測定為相較樣品中一個或多個參比核酸的比例或百分比。例如，來自移植供體的一個或多個核酸量能測定為樣品中總體核酸的10%?；蛘?，來自移植供體的一個或多個核酸量相較樣品中總核酸的比例可以為1:10。此外，來自移植供體的一個或多個核酸量能測定為10%的參比基因例如β-球蛋白或與之比例為1:10。一些實施方式中，來自移植供體的一個或多個核酸量可測定為濃度。例如，供體樣品的一個或多個核酸量能測定為lug/mL。
一些實施方式中，高于預(yù)定閾值的一種或多種移植供體核酸量指示移植狀態(tài)或結(jié)果。例如，能測定移植后沒有移植物排斥或其他病變跡象的臨床穩(wěn)定患者的標準值。高于移植后臨床穩(wěn)定患者標準值的一種或多種移植供體核酸量增加能指示移植狀態(tài)或結(jié)果例如移植排斥或移植損傷的變化。另一方面，低于或處在移植后臨床穩(wěn)定患者標準值的一個或多個移植供體核酸量能指示移植耐受或移植存活。
一些實施方式中，不同的預(yù)定閾值指示不同的移植結(jié)果或狀態(tài)。例如，如上面所討論，高于移植后臨床穩(wěn)定患者標準值的一個或多個移植供體核酸量增加能指示移植狀態(tài)或結(jié)果例如移植排斥或移植損傷的變化。然而，高于移植后臨床穩(wěn)定患者標準值，但是低于預(yù)定閾值的一個或多個移植供體核酸量增加可以指示不太嚴重的病癥，例如病毒感染而不是移植排斥。大于更高閾值的一個或多個移植供體核酸量增加可以指示移植排斥。
一些實施方式中，來自移植供體的所述一個或多個核酸量的暫時差異指示移植狀態(tài)或結(jié)果。例如，移植患者能隨著時間監(jiān)控以測定移植供體的一個或多個核酸量。來自移植供體的一個或多個核酸量暫時增加，隨后恢復(fù)到正常值，可以指示不太嚴重的病癥而不是移植排斥。另一方面，來自移植供體的一個或多個核酸量持續(xù)增加可以指示嚴重病癥例如移植排斥。
一些實施方式中，來自移植供體的所述一個或多個核酸量的暫時差異能用于監(jiān)控免疫抑制治療的效果或選擇免疫抑制治療。例如，來自移植供體的一個或多個核酸量能在免疫抑制治療之前和之后測定。治療后移植供體的一個或多個核酸降低可以指示所述治療成功防止移植排斥。或者，來自移植供體的一個或多個核酸量能用于選擇免疫抑制治療，例如不同強度的免疫抑制治療。例如，來自移植供體的一個或多個核酸量更高可以指示需要非常強力的免疫抑制劑，而移植供體的一個或多個核酸量更低可以指示使用不太強力的免疫抑制劑。
發(fā)明提供敏感且特異的方法。一些實施方式中，本文所述診斷或預(yù)測移植狀態(tài)或結(jié)果的方法有至少56%，60%, 70%, 80%, 90%, 95%或100%靈敏度。一些實施方式中，本文所述方法有至少56%靈敏度。一些實施方式中,本文所述方法有至少78%靈敏度。一些實施方式中，本文所述方法有約70%-約100%特異性。一些實施方式中，本文所述方法有約80%-約100%特異性。一些實施方式中，本文所述方法有約90%-約100%特異性。一些實施方式中，本文所述方法有約100%特異性。
本文也提供方法篩選和鑒定識別能用于本文所述方法的供體核酸的標記，例如診斷或預(yù)測移植狀態(tài)或結(jié)果。一些實施方式中，供體核酸是游離DNA或從循環(huán)供體細胞中分離的DNA。
供體核酸能用本文所述方法鑒定，包括實施例中描述的方法。鑒定這些之后，可以觀察供體核酸和檢測其與移植狀態(tài)和結(jié)果的相關(guān)性，例如慢性移植損傷、排斥和耐受。一些實施方式中，研究供體核酸的縱向改變。如果臨床明顯，這些水平可以跟隨免疫抑制藥理學(xué)效價，或作為耗盡靶標加以研究。
試劑盒
也提供試劑和其試劑盒以使用一個或多個上述描述方法。對象試劑和其試劑盒可有很多變化。感興趣的試劑包括特定設(shè)計用于上述生成的試劑(i)移植供體和移植受體的基因型；(ii)標記分布的鑒定jP(ii)檢測和/或定量獲自移植受體樣品的一個或多個移植供體核酸。
一種這類試劑是一個或多個探針或探針陣列以用于基因分型和/或檢測和/或定量一個或多個核酸。各種不同陣列形式為本領(lǐng)域已知，有多種不同探針結(jié)構(gòu)、底物組合物和連接技術(shù)。
對象發(fā)明的試劑盒可以包括上述陣列。這些試劑盒可額外包括一種或多種治療齊U。試劑盒還包括數(shù)據(jù)分析軟件包，包括用于與檢測分布比較的參考分布。
試劑盒可以包括試劑例如緩沖液，和水。試劑盒可以包括使用本文所述方法例如PCR和測序進行核酸提取和/或核酸檢測所需的試劑。
這些試劑盒也可以包括信息，例如科學(xué)參考文獻，說明書材料，臨床試驗結(jié)果，和/或這些概述等，可以指示或建立組合物活性和/或優(yōu)點，和/或描述劑量，給藥，副作用，藥物相互作用，或其他對醫(yī)療服務(wù)人員有用的信息。試劑盒也可以包括數(shù)據(jù)庫訪問指令。這些信息可根據(jù)不同研究結(jié)果，例如使用涉及體內(nèi)模型的實驗動物的研究和根據(jù)人臨床試驗的研究?？商峁┍疚乃鲈噭┖?，銷售和/或推銷給衛(wèi)生工作者，包括醫(yī)師、護士、藥劑師、處方人員等。一些實施方式中，試劑盒也可直接銷售給消費者。
計算機程序上述任何方法能用包括計算機可讀介質(zhì)記錄的計算機可執(zhí)行邏輯的計算機程序產(chǎn)品完成。例如，計算機程序能執(zhí)行以下功能的一些或全部(i)控制從樣品中分離核酸，
(ii)從樣品中預(yù)擴增核酸，(iii)擴增，測序或排列樣品中的特定多態(tài)性區(qū)域，(iv)鑒定和定量樣品中的標記分布，(V)比較樣品中檢測的標記分布數(shù)據(jù)和預(yù)定的閾值，(Vi)測定移植狀態(tài)或結(jié)果，(Vi)宣布正?；虿徽Ｒ浦矤顟B(tài)或結(jié)果。特別的，計算機可執(zhí)行邏輯能分析多態(tài)性(例如SNP)檢測和定量的數(shù)據(jù)。
計算機可執(zhí)行邏輯能在任何計算機上工作，所述計算機可以是多種通用計算機類型中的任一種，例如個人計算機、網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器、工作站、或其他現(xiàn)在或稍后開發(fā)的計算機平臺。一些實施方式中，計算機程序產(chǎn)品描述包括其中存儲有計算機可執(zhí)行邏輯(計算機軟件程序，包括程序代碼)的計算機使用介質(zhì)。計算機可執(zhí)行邏輯能通過處理器執(zhí)行，使得處理器執(zhí)行本文所述功能。另一些實施方式中，一些功能主要在硬件上完成，例如使用硬件狀態(tài)機。啟用硬件狀態(tài)機以行使本文所述功能對相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。
通過訪問反映移植供體和移植患者基因型的數(shù)據(jù)，和/或移植后移植患者循環(huán)中 是否出現(xiàn)來自移植供體的一個或多個核酸，程序能提供評價移植受體中移植狀態(tài)或結(jié)果的方法。
一個實施方式中，計算機執(zhí)行本發(fā)明的計算機邏輯也可包括數(shù)字輸入設(shè)備，例如掃描儀。數(shù)字輸入設(shè)備能提供核酸信息，例如多態(tài)性水平/數(shù)量。例如，本發(fā)明掃描儀能根據(jù)本文方法提供多態(tài)性圖像(例如SNP)。例如，掃描儀能通過檢測熒光，放射性物質(zhì)，或其他發(fā)射；通過檢測傳輸，反射，或散射輻射；通過檢測電磁屬性或其他特性；或通過其他技術(shù)來提供圖像。檢測數(shù)據(jù)通常以數(shù)據(jù)文件形式存儲在存儲設(shè)備上。一個實施方式中，掃描儀可鑒定一個或多個標記靶標。例如，第一 DNA多態(tài)性可標記有在特定特征頻率發(fā)熒光的第一染料，或響應(yīng)特定頻率激發(fā)源的窄帶頻率。第二 DNA多態(tài)性可標記有在不同特征頻率發(fā)熒光的第二染料。第二個染料的激發(fā)源可以但不必須具有與激發(fā)第一染料不同的特征頻率，例如激發(fā)源可以是相同的或不同的激光。
—些實施方式中，發(fā)明提供計算機可讀介質(zhì),包括記錄其上的一組指令以使計算機執(zhí)行以下步驟(i )從接受供體移植的對象樣品中檢測的一個或多個核酸接收數(shù)據(jù)，其中所述一個或多個核酸是來自所述供體移植的核酸，且其中來自所述供體的所述一個或多個核酸根據(jù)預(yù)定標記分布來鑒定jP(ii)根據(jù)是否存在一個或多個核酸來診斷或預(yù)測移植狀態(tài)或結(jié)果。
實施例
實施例I :檢測器官移植受體中的供體DNA
使用前述數(shù)字PCR (Warren, L.，Bryder, D.，Weissman, I. L.，Quake, S. R.，ProcNatl Acad Sci,103,17807-17812 (2006)；Fan,H. C. Quake,S. R. ,Anal Chem,79，7576-7579(2007))，就女性患者接受男性或女性心臟而言，與心內(nèi)膜心肌活檢測定3A或3B級排斥反應(yīng)同時獲取的血漿樣品中定量染色體Y和染色體I標記量。
盡管血液灌注/男性小孩出生是女性患者中有可檢測CY信號的已知機制，圖2顯示接受男性供體心臟的患者的總cY水平普遍更高。4例對照女性-女性移植患者中沒有檢測到顯著染色體Y信號。另一方面，染色體Y信號的I. 5-8%總體基因組部分在針對3例男性-女性移植患者跨越4個排斥反應(yīng)的排斥時間點觀察到。[0150]血漿中染色體Y水平在一些這類患者移植后的數(shù)個時間點監(jiān)控，并且與器官排斥的活檢時間點作比較。對于患者6，在移植后21個月活檢測得3A級排斥。血漿中檢測的染色體Y水平在排斥前3個月血漿中可以忽略，但在活檢確定排斥時增加>10倍到2%總基因組部分。此時觀察到血漿DNA中的最高cY水平(圖3)。圖3的結(jié)果表明血漿中游離DNA的整體水平不診斷器官衰竭，并且不追蹤“供體特異” DNA信號。
另一個患者觀察到相似的趨勢，當活檢測定3A級排斥時，移植后5個月cY水平增力口(圖4)。cY的百分比(或％ “供體”)DNA在排斥時間前增加并且在該時間最高。與上面相同，總游離DNA量看起來不診斷心臟排斥。
這些結(jié)果共同建立，對于心臟移植患者，血漿中出現(xiàn)源自供體的DNA可以作為器官衰竭開始的潛在標記。
實施例2 :移植供體和移植受體的基因分型
圖5顯示監(jiān)控所有移植患者的通用方法。供體和受體的基因分型能建立單核苷酸多態(tài)性(SNP)分布來檢測供體DNA。分析觀察到的獨特SNP，血漿中游離DNA的鳥槍測序可定量樣品中的％供體DNA。而考慮到成百上千或更多信號，任何單獨SNP難以檢測血漿中如此少的DNA，高靈敏度應(yīng)可行。
混合的基因型庫能用兩個CEU (猶他州摩門)HapMap圖線創(chuàng)立。使用現(xiàn)存基因型檢測平臺(例如Illumina Golden Gate)已經(jīng)建立這兩者之間約一百二十萬種總變化?？墒褂玫腟NP對受體必須是純合子，并理想上對供體也是純合子?？捎玫腟NP包括(i)約500，000種雜合供體SNP (計數(shù)是總供體部分的1/2)，(ii)約160，000種純合供體SNP。
測序結(jié)果Illumina測序的4條泳道用于比較4種不同水平的供體DNA取代受體DNA (見圖6)。對于堿基替換，測序的錯誤率目前是約3-0. 5%。使用提高過濾SNP讀取的質(zhì)量分，或使用重新測序，應(yīng)降低錯誤率和增加靈敏度。使用更多SNP定位(來自全部基因型)也應(yīng)提高信號產(chǎn)率，方案不改變。
雖然本文顯示和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然了解這些實施方式僅以舉例方式提供。本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的情況下可以作出多種改變、變化和取代。應(yīng)理解，本文所述的本發(fā)明實施方式的各種替代形式可用于實施本發(fā)明。所附權(quán)利要求
書確定了本發(fā)明范圍，這些權(quán)利要求
范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)以及其等同物均為本發(fā)明所覆蓋。
權(quán)利要求
1.一種診斷或預(yù)測移植狀態(tài)或結(jié)果的方法，所述方法包括 提供接受了供體移植的對象的樣品； 確定是否存在一個或多個來自所述供體移植的核酸，其中，來自所述供體的所述一個或多個核酸是根據(jù)預(yù)定的標記分布鑒定；和 根據(jù)是否存在所述一個或多個核酸來診斷或預(yù)測移植狀態(tài)或結(jié)果。
2.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述移植狀態(tài)或結(jié)果包括排斥，耐受性，非排斥的同種異體移植物損傷，移植功能，移植存活，慢性移植損傷，或免疫抑制藥理學(xué)效價。
3.如權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于，所述基于非排斥的同種異體移植物損傷選自下組缺血損傷，病毒感染，圍手術(shù)期缺血，再灌注損傷，高血壓，生理應(yīng)激，活性氧自由基造成的損傷和藥物試劑造成的損傷。
4.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述樣品選自血液，血清，尿液，和糞便。
5.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述標記分布是多態(tài)標記分布。
6.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述多態(tài)標記分布包括一種或多種單核苷酸多態(tài)性(SNP’S)，一種或多種限制性片段長度多態(tài)性(RFLP’S)，一種或多種短串聯(lián)重復(fù)(STR)，一種或多種可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(VNTR' S)，一個或多個超變區(qū)，一個或多個小衛(wèi)星，一個或多個二核苷酸重復(fù)，一個或多個三核苷酸重復(fù)，一個或多個四核苷酸重復(fù)，一個或多個簡單重復(fù)序列，或一個或多個插入元件。
7.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述多態(tài)標記分布包括一種或多種SNP。
8.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述移植選自腎移植，心臟移植，肝移植，胰腺移植，肺移植，腸移植和皮膚移植。
9.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述核酸選自雙鏈DNA，單鏈DNA，單鏈DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，DNA/RNA雜交體，RNA和RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
10.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述核酸選自雙鏈DNA，單鏈DNA和cDNA。
11.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述核酸是mRNA。
12.如權(quán)利要求
9-11中任一項所述的方法，其特征在于，所述核酸得自循環(huán)供體細胞。
13.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述核酸是循環(huán)游離DNA。
14.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述一個或多個核酸是否存在由選自測序、核酸陣列和PCR的方法確定。
15.如權(quán)利要求
14所述的方法，其特征在于，所述測序是鳥槍測序。
16.如權(quán)利要求
14所述的方法，其特征在于，所述陣列是DNA陣列。
17.如權(quán)利要求
16所述的方法，其特征在于，所述DNA陣列是多態(tài)性陣列。
18.如權(quán)利要求
17所述的方法，其特征在于，所述多態(tài)性陣列是SNP陣列。
19.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法還包括定量所述一個或多個核酸。
20.如權(quán)利要求
19所述的方法，其特征在于，所述一個或多個核酸的量可指示移植狀態(tài)或結(jié)果。
21.如權(quán)利要求
20所述的方法，其特征在于，所述一個或多個核酸的量高于預(yù)定閾值可指示移植狀態(tài)或結(jié)果。
22.如權(quán)利要求
21所述的方法，其特征在于，所述閾值是沒有移植排斥或其他病變跡象的移植后臨床穩(wěn)定患者的標準值。
23.如權(quán)利要求
21所述的方法，其特征在于，所述不同的移植結(jié)果或狀態(tài)有不同的預(yù)定閾值。
24.如權(quán)利要求
20所述的方法，其特征在于，所述一個或多個核酸量的短暫差異可指示移植狀態(tài)或結(jié)果。
25.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述標記分布由所述移植供體的基因型確定。
26.如權(quán)利要求
25所述的方法，其特征在于，所述方法還包括接受所述移植的所述對象的基因分型。
27.如權(quán)利要求
26所述的方法，其特征在于，所述方法還包括建立標記式樣分布，其中所述標記在所述移植供體和接受所述移植的所述對象之間可區(qū)分。
28.如權(quán)利要求
25-27中任一項所述的方法，其特征在于，所述基因分型用選自測序、核酸陣列和PCR的方法完成。
29.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法有至少56%靈敏度。
30.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法有至少78%靈敏度。
31.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法有約70%-約100%特異性。
32.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法有約80%-約100%特異性。
33.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法有約90%-約100%特異性。
34.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法有約100%特異性。
35.一種計算機可讀介質(zhì)，所述介質(zhì)包括 在其上記錄的一組指令，使計算機執(zhí)行以下步驟 (i)接收來自接受了供體移植的對象樣品中測得的一個或多個核酸的數(shù)據(jù)，其中，所述一個或多個核酸是來自所述供體移植的核酸，且其中來自所述供體的所述一個或多個核酸根據(jù)預(yù)定的標記分布來鑒定；和 (ii)根據(jù)是否存在所述一個或多個核酸來診斷或預(yù)測移植狀態(tài)或結(jié)果。
專利摘要
本發(fā)明提供用于診斷或預(yù)測接受移植的對象的移植狀態(tài)或結(jié)果的方法、設(shè)備、組合物和試劑盒。所述方法包括確定是否存在一個或多個來自所述供體移植的核酸，其中，來自所述供體的所述一個或多個核酸是根據(jù)預(yù)定的標記分布鑒定，和根據(jù)是否存在所述一個或多個核酸來診斷或預(yù)測移植狀態(tài)或結(jié)果。
文檔編號C12Q1/68GKCN102712954SQ201080060469
公開日2012年10月3日 申請日期2010年11月5日
發(fā)明者H·瓦朗坦, S·R·奎克, T·M·斯尼德 申請人:小利蘭·斯坦福大學(xué)托管委員會導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan