專利名稱：移植器官保護(hù)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型的移植器官保護(hù)用組合物，特別是涉及具有移植 器官的生長促進(jìn)效果的組合物。
背景技術(shù)：
紅細(xì)胞生成素(下面有時也用EP0表示)，是促進(jìn)紅血球類母細(xì) 胞分化、增殖的酸性糖蛋白質(zhì)荷爾蒙，主要由腎臟產(chǎn)生。在生物體的 紅血球日常性保持中，EPO擔(dān)負(fù)著中心作用，臨床上EPO用于貧血的 治療及手術(shù)前后的管理。
己知EP0除作為造血因子的作用外，在神經(jīng)類細(xì)胞、心肌細(xì)胞、 腎尿細(xì)管上皮細(xì)胞等中具有抑制細(xì)胞凋亡及組織保護(hù)的作用(PNAS 100: 4802 - 4806， 2003等)。EP0具有的這2個作用，可以認(rèn)為是 EPO通過2個不同的信號傳送路線來產(chǎn)生作用的。當(dāng)EPO作用于EP0 受體的同型二聚體時，通過細(xì)胞內(nèi)的JAK2信號傳送路線引起造血作 用。另一方面，當(dāng)EP0作用于EP0受體與common p受體(P cR)的雜 聚體時，通過細(xì)胞內(nèi)ERK1/2信號傳送路線，引起抗細(xì)胞凋亡作用(PNAS 1 01: 14907 - 14912, 2004 )。
近幾年來，進(jìn)行器官移植手術(shù)，但在器官移植手術(shù)時，從器官提 供者(供體)摘取的移植用器官，在血流中斷、不能通過血流供氧的 狀態(tài)下(缺血狀態(tài))，于移植前保存數(shù)分鐘~數(shù)十小時。因此，當(dāng)沒 有適當(dāng)選擇保存溫度及保存液等保存條件，或至移植需要長時間時， 在通過移植使移植器官內(nèi)的血流恢復(fù)(再灌流時)，移植器官內(nèi)往往 產(chǎn)生基質(zhì)的或功能性的障礙。
此前作為移植器官保護(hù)劑，己知有氨基苯磺酸衍生物(W0 2004/022545 )、 4 -三氟甲基嘧啶衍生物(特開2005 - 350363 )、嘌呤衍生物(特開2005 - 350364 )。
但是，并不知道EPO對移植器官的保護(hù)效果。另外，也不知道具 有生長促進(jìn)效果的移植器官保護(hù)劑。
非專利文獻(xiàn)l: PNAS 100: 4802 - 4806， 2003
非專利文獻(xiàn)2: PNAS 101: 14907 - 14912， 2004
專利文獻(xiàn)1: WO 2004/022545
專利文獻(xiàn)2:特開2005 - 350363
專利文獻(xiàn)3:特開2005 - 35036
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題
本發(fā)明的目的在于提供一種新型的移植器官保護(hù)用組合物，特別 是提供一種具有移植器官的生長促進(jìn)效果的組合物。 用于解決課題的手段
本發(fā)明人等為了達(dá)到上述目的進(jìn)行悉心研究的結(jié)果可見，紅細(xì)胞 生成素具有移植器官保護(hù)作用，特別是具有移植器官的生長促進(jìn)效果， 完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供下列內(nèi)容。
(1 )移植器官保護(hù)用組合物，所述組合物含有紅細(xì)胞生成素作為 有效成分。
(2 )移植器官生長促進(jìn)用組合物，所述組合物含有紅細(xì)胞生成素 作為有效成分。
(3) 移植器官保存用組合物，所述組合物含有紅細(xì)胞生成素作為 有效成分。
(4) 上述(1) ~ ( 3)任何一項所述的組合物，其中，上述紅細(xì) 胞生成素是脫唾液酸(asialo)的紅細(xì)胞生成素。
(5) 從移植時再灌流障礙保護(hù)移植器官的方法，其中包括把含 有紅細(xì)胞生成素作為有效成分的組合物，直接供給移植器官的工序。
(6) 促進(jìn)移植器官在被移植對象上生長的方法，其中包括把含有紅細(xì)胞生成素作為有效成分的組合物，直接供給移植器官的工序。
(7 )紅細(xì)胞生成素的用途，其用于制造從移植時再灌流障礙保護(hù) 移植器官的醫(yī)療用組合物。
(8 )紅細(xì)胞生成素的用途，其用于制造促進(jìn)移植器官在被移植對 象上生長的醫(yī)療用組合物。 發(fā)明效果
如下列實施例所示，本發(fā)明的組合物從通過移植時的血液再灌流 所產(chǎn)生的障礙保護(hù)移植器官，顯示在被移植對象上的生長促進(jìn)效果。 本發(fā)明的組合物向移植的器官直接供給EPO,能夠得到上述效果。特 別是供給脫唾液酸EPO，能夠確認(rèn)優(yōu)良的效果。
另外，可以認(rèn)為通過作為移植器官的保存用組合物使用，能夠在 移植后保護(hù)移植器官、促進(jìn)生長。


圖1為表示移植后卵巢中每0. 64rai^的平均卵胞數(shù)以及對移植前 卵巢的卵胞數(shù)的殘留率曲線。結(jié)果用平均土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。星號表示 試驗組之間的有顯著差異(*: p<0. 05)。
具體實施方式
紅細(xì)力包生成素
本發(fā)明4吏用的紅細(xì)胞生成素，可以采用任何一種紅細(xì)胞生成素， 但優(yōu)選的是高度純化過的紅細(xì)胞生成素，更具體的說，有哺乳動物 EP0，特別是與人EP0實質(zhì)上具有同樣生物活性的EP0。
本發(fā)明使用的紅細(xì)胞生成素，也可采用任何一種方法制造，例如， 可以采用從來自人的提取物精制得到的天然的人EP0 (特公平l-38800號公報等)，或通過遺傳基因工學(xué)的方法，從大腸菌、酵母菌、 中國田鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)、C127細(xì)胞、COS細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、 BHK細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等產(chǎn)生的，采用各種方法提取、分離精制的人EPO 等。本發(fā)明使用的紅細(xì)胞生成素，通過遺傳基因工學(xué)的方法制造的EP0是優(yōu)選的，采用哺乳動物細(xì)胞(特別是CH0細(xì)胞)制造的EPO是優(yōu)選 的(例如，特公平1 - 44317號公報，Ke腸th Jacobs et al. ， Nature, 313 806 - 810 ( 1985 )等)。
通過遺傳基因組轉(zhuǎn)換方法得到的紅細(xì)胞生成素，與來自天然的 EP0的氨基酸排列相同的紅細(xì)胞生成素，或通過該氨基酸排列中的1 個或多個氨基酸缺失、置換、加成等的紅細(xì)胞生成素，也可具有與來
自天然的EP0同樣的生物學(xué)活性等的紅細(xì)胞生成素。氨基酸的缺失、 置換、加成等，可采用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員公知的方法來進(jìn)行。例如，本 領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以采用部位特異的變異誘發(fā)法(Gotoh， T.et al.
(1995 ) Gene 152， 271 — 275; Zoller， M. J. and Smith, M. ( 1983 ) Methods Enzymol, 100， 468 - 500; Kra隨，W. etal. ( 1984 ) Nucleic Acids Res. 12， 9441 - 9456; Kra隨，W .and Fritz, H丄(1987 ) Methods Enzymol ， 154 ， 350 _ 367; Kunkel , T丄 (1985 ) Proc, Natl. Acad. Sci. USA. 82， 488 - 492; Kunkel ( 1988 ) Methods Enzymol, 85， 2763 - 2766 )等，在EP0的氨基酸中導(dǎo)入適當(dāng)變異，可 以制造與EP0功能同等的多肽。另外，氨基酸的變異，在自然界也可 產(chǎn)生。 一般在取代的氨基酸殘基中，在氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)被保存的另外 氨基酸上取代是優(yōu)選的。例如，作為氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)，可以舉出疏 水性氨基酸(A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水性氨基酸(R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(G、 A、 V、 L、 I、 P)、具有含羥基側(cè)鏈的氨基酸(S、 T、 Y)、具有含硫原子側(cè) 鏈的氨基酸(C、 M)、具有含羧酸及酰胺側(cè)鏈的氨基酸(D、 N、 E、 Q)、 具有含堿基側(cè)鏈的氨基酸(R、 K、 H)、具有含芳香族側(cè)鏈的氨基酸(H、 F、 Y、 W)(括號內(nèi)表示任何一種氨基酸的一文字標(biāo)記)。已知對某種 氨基酸排列，通過1個或多個氨基酸殘基的缺失、加成及/或其他氨基 酸的取代，具有被修飾的氨基酸排列的多肽，其生物學(xué)活性被保持， 對此已為人們熟知(Mark, D . F . et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1984 ) 81， 5662 - 5666; Zoller， M.J.&Sraith， M . Nucleic Acids Research ( 1982 ) 10， 6487 — 6500; Wang, A.etal.， Science 224，
61431 - 1433 ;Dalbadie - McFarland ，G .et al.， Proc. Natl.Acad. Sci. USA ( 1982 ) 79， 6409 - 6413 )。
還有，作為本發(fā)明的紅細(xì)胞生成素，也可以采用EPO與其他蛋白 質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。在制造融合多肽時，例如，編碼EPO的DNA與編碼 其他蛋白質(zhì)的DNA，構(gòu)架一致地進(jìn)行連結(jié)，將其導(dǎo)入呈現(xiàn)載體中，也 可由宿主呈現(xiàn)。與本發(fā)明的紅細(xì)胞生成素融合加成的其他蛋白質(zhì)，未 作特別限定。
還有，作為本發(fā)明的紅細(xì)胞生成素，也可采用經(jīng)過化學(xué)修飾的 EP0。作為經(jīng)過化學(xué)修飾的EPO的例子，例如，可以舉出通過聚乙二醇 等進(jìn)行化學(xué)修飾EPO (W090/12874等)、不帶糖鏈的EPO通過聚乙二 醇等的化學(xué)修飾的，另外，結(jié)合了維生素B12等無機(jī)或有機(jī)化合物等 的EPO等。
另外，作為本發(fā)明的紅細(xì)胞生成素，也可釆用EPO衍生物。所謂 EPO衍生物，意指EPO分子中的氨基酸被修飾的EPO或EPO分子中的
糖鏈#:修飾的epo。
作為EPO分子中的糖鏈的修飾，包括糖鏈的加成、取代、缺失等。 作為本發(fā)明中優(yōu)選的糖鏈的修飾，可以舉出EPO分子中的唾液酸 (sialic acid )的缺失。
通常，通過重組動物細(xì)月包生產(chǎn)的EPO,來自尿的EPO的任何一種， 可作為含與糖鏈結(jié)構(gòu)不同的多樣EPO的EPO組合物得到。在EPO組合 物中的EPO分子上加成的唾液酸數(shù)目，因各個EPO分子而異，通常，1 個EPO分子加成11個~ 15個唾液酸。通過除去這些唾液酸，可以制 成脫唾液酸EPO (Asialo EPO)。脫唾液酸時^皮除去的唾液酸數(shù)，未 作特別限定，既可除去全部唾液酸，也可除去l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、或14個唾液酸。本發(fā)明中優(yōu)選的脫唾液酸 EPO，在EPO分子上加成的唾液酸數(shù)在IO個以下，更優(yōu)選5個以下， 特優(yōu)選2個以下。還有，本發(fā)明中使用的唾液酸數(shù)目，采用EPO組合 物中含有的EPO分子平均數(shù)。每個EPO分子的唾液酸平均數(shù)，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可采用公知的方法測定(EP 0428267公報等)。除去了唾液酸的EP0(脫唾液酸EP0)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用公 知的方法制造，例如，可采用唾液酸酶(Sialidase)等酶，處理EP0 等進(jìn)行制造。唾液酸酶可從市場購買使用(特表2005 - 507426號、 Nobuo Imai et al. ， Eur.J.Biochem， 194， 457 - 462 ( 1990 )等)。
另外，本發(fā)明的紅細(xì)胞生成素，可以是糖鏈改變體EP0，可以舉 出EP0的N末端上加成唾液酸的糖鏈改變體EPO,即NESP (新型紅細(xì) 胞生成素刺激蛋白質(zhì)WO85/02610、 WO91/05867、 WO95/05465等中有 記栽)等的糖鏈改變EPO類似體。
EPO分子中的氨基酸修飾，可以舉出氨基曱?；?、生物素化、 脒化、乙?；?、胍化等。
被修飾過的氨基殘基，未作特別限定，例如，可以舉出賴氨酸、 精氨酸、谷氨酸、色氨酸等。
組合物
本發(fā)明的組合物中可根據(jù)需要適當(dāng)添加懸浮劑、溶解輔助劑、穩(wěn) 定劑、等滲劑、保存劑、防吸附劑、表面活性劑、稀釋劑、賦形劑、 pH調(diào)節(jié)劑、無痛化劑、緩沖劑、含疏還原劑、抗氧劑等。
作為懸浮劑的例子，可以舉出甲基纖維素、聚山梨酸酯80、羥乙 基纖維素、阿拉伯膠、西黃蓍膠粉末、羧甲基纖維素鈉、聚氧化乙烯 山梨糖醇單月桂酸酯等。
作為溶解輔助劑，可以舉出聚氧化乙烯固化蓖麻籽油、聚山梨酸 酯80、煙酸酰胺、聚氧化乙烯山梨糖醇單月桂酸酯、檜醇、蓖麻籽油 脂肪酸乙酯等。
作為穩(wěn)定劑，可以舉出葡聚糖40、甲基纖維素、明膠、亞疏酸鈉、 偏亞硫酸鈉等。
另外，作為穩(wěn)定劑，也可添加某種氨基酸(例如，特開平IO-182481號公報等)。作為穩(wěn)定劑添加的氨基酸，包括游離的氨基酸、 其鈉鹽、鉀鹽、鹽酸鹽等的鹽等。氨基酸可1種或2種以上組合添加。 作為穩(wěn)定劑添加的氨基酸，未作特別限定，但作為優(yōu)選的氨基酸，可以舉出亮氨酸、色氨酸、絲氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸、賴氨酸。
作為等滲劑，例如，可以舉出D-甘露糖醇、山梨糖醇等。
作為保存劑，例如，可以舉出對羥基安息香酸甲酯、對羥基安息 香酸乙酯、山梨糖酸、苯酚、甲酚、氯甲酚等。
作為防吸附劑，例如，可以舉出人血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、 環(huán)氧乙烷 環(huán)氧丙烷共聚物、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚氧化乙 烯固化蓖麻籽油、聚乙二醇等。
作為表面活性劑，非離子表面活性劑，例如，可以舉出山梨糖醇 酐一辛酸酯、山梨糖醇酐一月桂酸酯、山梨糖醇酐一棕櫚酸酯等山梨 糖醇酐脂肪酸酯；丙三醇一辛酸酯、丙三醇一肉豆蔻酸酯、丙三醇一 硬脂酸酯等丙三醇脂肪酸酯；十甘油基一硬脂酸酯、十甘油基二硬脂 酸酯、十甘油基一亞油酸酯等聚丙三酵脂肪酸酯；聚氧化乙烯山梨糖 醇肝一月桂酸酯、聚氧化乙烯山梨糖醇酐一油酸酯、聚氧化乙烯山梨 糖醇酐一硬脂酸酯、聚氧化乙烯山梨糖醇酐一棕櫚酸酯、聚氧化乙烯 山梨糖醇酐三油酸酯、聚氧化乙烯山梨糖醇酐三硬脂酸酯等氧化乙烯 山梨糖醇酐脂肪酸酯；聚氧化乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧化乙烯 山梨糖醇四油酸酯等聚氧化乙烯山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧化乙烯甘油 基一硬脂酸酯等聚氧化乙烯甘油硬脂酸酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚 乙二醇硬脂酸酯；聚氧化乙烯月桂醚等聚氧化乙烯烷基醚；聚氧化乙 烯聚氧化丙二醇、聚氧化乙烯聚氧化丙烯丙醚、聚氧化乙烯聚氧化丙 烯十六基醚等聚氧化乙烯聚氧化丙烯烷基醚；聚氧化乙烯壬基苯基醚 等聚氧化乙烯烷基苯基醚；聚氧化乙烯蓖麻子油、聚氧化乙烯固化蓖 麻子油(聚氧化乙烯氫化蓖麻子油)等聚氧化乙烯固化蓖麻子油；聚 氧化乙烯山梨糖醇蜂蠟等聚氧化乙烯山梨糖醇蜂蠟衍生物；聚氧化乙 烯亞油酸等聚氧化乙烯亞油酸衍生物；聚氧化乙烯硬脂酰胺等聚氧化 乙烯脂肪酸酰胺等具有HLB6 ~ 18的化合物；陰離子表面活性劑，例如， 典型的可以舉出十六基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、油基硫酸鈉等具有碳 原子數(shù)10 ~ 18烷基的烷基硫酸鹽；聚氧化乙烯月桂基硫酸鈉等的環(huán)氧 乙烷平均加成摩爾數(shù)2~4的烷基碳原子數(shù)10~ 18的聚氧化乙烯烷基醚硫酸鹽；月桂基硫代琥珀酸酯鈉等烷基碳原子數(shù)8 ~ 18的烷基硫代 琥珀酸酯鹽；天然類表面活性劑，例如，卵磷脂、甘油磷脂質(zhì)；鞘髓 磷脂等鞘髓磷脂質(zhì)；碳原子數(shù)12 ~ 18脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。在本 發(fā)明的制劑中，這些表面活性劑可1種或2種以上組合添加。優(yōu)選的 表面活性劑為聚山梨糖酸酯20、 40、 60或80等聚氧化乙烯山梨糖醇 酐脂肪酸酯，特優(yōu)選聚山梨糖酸酯20及80。另外，Poloxaraer( Pluronic F- 68(注冊商標(biāo))等)為代表的聚氧化乙烯聚氧化丙二醇也是優(yōu)選的。
作為含硫還原劑，例如，可以舉出N-乙酰基半胱氨酸、N-乙酰 基均半胱氨酸、疏辛酸、疏代二乙二醇、硫代乙醇胺、硫代丙三醇、 硫代山梨糖醇、硫代乙二醇酸及其鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽、碳原 子數(shù)1 ~ 7個的硫代鏈烷酸等具有氫硫基的含硫還原劑等。
作為抗氧劑，例如，可以舉出刺桐酸、二丁基羥基甲苯、丁基羥 基茴香醚、a-生育酚、醋酸生育酚、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞 血酸椋櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食 子酸三戊酯、沒食子酸丙酯或乙二胺四醋酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉、 偏磷酸鈉等螯合劑。
另外，也可以含有氯化鈉、氯化鉀、氯化釣、磷酸鈉、磷酸鉀、 碳酸氫鈉等無機(jī)鹽；檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、醋酸鈉等有機(jī)酸鹽等通常 添加的成分。
在本發(fā)明的含紅細(xì)胞生成素的組合物中，有效成分的含量，考慮 移植器官的狀態(tài)及大小、患者(移植者、被移植者)的癥狀、體重、 年齡及性別等來決定各有效成分。通常，10~ 10G0U/kg體重，優(yōu)選 100~ 600U/kg體重左右。
本發(fā)明的含紅細(xì)胞生成素的組合物，對被移植者(受主)，在移 植手術(shù)中及/或手術(shù)前后供給被移植者，優(yōu)選的是通過直接供給器官， 可以得到本發(fā)明的效果。關(guān)于供給，從移植者(宿主)摘出的器官， 也可在移植前直接與該組合物接觸進(jìn)行供給，如下列實施例所述，也 可吸入海綿等后供給。另外，移植前也可作為保存液使用。作為保存 液添加物，例如，可以采用生理鹽水、磷酸緩沖生理鹽水、檸檬酸緩
10沖液等生理允許的緩沖液及等滲化液。此前，作為移植用器官保存液，
可以并用臨床使用的Euro-Collins液及UW液等。 實施例
實施例l:冷凍融解的狗卵巢在異種移植時的EP0及脫唾液酸EP0 的給予效果
(1) 目的
當(dāng)冷凍融解的狗卵巢，異種移植至N0D-SCID鼠卵巢嚢內(nèi)時，狗 卵巢的生長確認(rèn)為高頻率，但有報告說，移植后在血管再生前，原始 卵胞的70%已死亡，而在狗同種移植試驗中，觀察到狗卵巢的原始卵 胞及其他卵胞，比移植前的卵巢有減少的傾向。
在這里，對EP0及脫唾液酸EP0的局部供給、移植后的狗卯巢的 原始卵胞減少的抑制效果進(jìn)行探討。
(2) 材料及方法
把4月齡的狗卵巢進(jìn)行冷凍融解，移植至N0D-SCID鼠卵巢嚢內(nèi)。 冷凍融解操作，按照Migishima等的方法(Migishima F et al. ，Biol Reprod 2003 Mar; 68 ( 3 ): 881 - 7 )進(jìn)行，卵巢移才直按照Ishi j ima 等的方法(Ishijima T et al. ， J Reprod Dev. 2006 Apr; 52 ( 2 ): 293 - 9 )進(jìn)行。
(2. 1)冷凍操作
把狗卵巢組織切成1.0mm-1.5mra的方形，浸漬在室溫下的1M DMS0中約60秒后，與5 ji 1的1M DMS0 —起放入深冷試管內(nèi)，在冰上 冷卻5分鐘。添加預(yù)先于水上冷卻過的95 y 1的DAP 213后，于冰上 冷卻5分鐘，浸漬在液氮中。 (2.2)融解操作
從液氮中取管試管，棄去試管內(nèi)液氮，于室溫放置60秒。添加加 溫至37匸的900 n 1的0. 25M的蔗糖，快速地輕輕地進(jìn)行移液，用PBI 洗滌5次。
另外，把摘取的狗卵巢的一部分作為移植前卵巢，用10°/。福爾馬林固定。
(2. 3)移植方法
鼠(n-9),向腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后，切開背面，取 出卵巢。從卵巢側(cè)部的脂肪進(jìn)刀，把卵巢嚢內(nèi)的鼠卵巢，為了確保移 植后的向狗卵巢的血流，切除以使殘留的一部分，向其中(卵巢嚢內(nèi)) 放入冷凍融解的狗卵巢。此時，把止血用的海綿(下面為體組織吸收 性明膠)吸入了 EPO (n-3)及脫唾液酸EPO (n-3 ) 400U/kg的材料放 入卵巢嚢內(nèi)。另外，用生理鹽水作為對照，浸漬同等量的體組織吸收 性明膠，放入卵巢嚢內(nèi)。
4周后，取出卵巢，用10°/。福爾馬林固定，與移植前卵巢一起進(jìn)行 HE染色。
(2. 4)制作切片及卵胞檢索
卵胞的分類，按照Oktay等(Oktay K et al.，Biol Reprod. 1995 Aug; 53 ( 2 ) : 295 - 301 )的分類，對卵子(卵母細(xì)月包)的實質(zhì)進(jìn)行 確{人，要點如下。
原始卵胞(Primordial )，是卵母細(xì)胞部分地或完全地;波覆扁平 的前顆粒膜細(xì)胞；初始1次細(xì)胞(Early primary)是前顆粒膜細(xì)胞的 至少一部分形成圓柱狀(巨大)；1次細(xì)胞(Primary),全部顆粒膜 細(xì)胞變大，由l層顆粒膜細(xì)胞構(gòu)成；初始2次細(xì)胞(Transitional ) 由1層~ 2層圓柱狀顆粒膜細(xì)胞被覆；2次卵胞(Preantral )，由2 層以上顆粒膜細(xì)胞被覆，無卵胞腔的狀態(tài)；胞狀卵胞(Antral follicle)，由2層以上顆粒膜細(xì)胞被覆，伴隨著卵胞腔的狀態(tài)。
(2.4.1) 移植前的卵巢組織
隨機(jī)選擇10個組織，對該10個組織進(jìn)行卵胞計數(shù)。選擇的各組 織的最初卵胞多的直徑900nm的圓中每0. 64mm2視野的卵胞(共計10 個視野)。以此作為移植前卵胞數(shù)。
(2.4.2) 移植卵巢組織
對1組織(1塊)分步驟制成5張切片。此時，切片與切片的間 隔為40pm~ 50|ira。該1切片中，計數(shù)最初卵胞多的直徑900 p m的圓中每0. 64mm'視野的卵胞(共計5個視野)。 (3)結(jié)果
所得到的結(jié)果示于表l及圖1。 [表l]
使用的狗卵巢miniaturedachshund 4月齡未發(fā)情 使用的鼠N0D-SCID鼠11周齡n=9
實驗區(qū)鼠編號尿始豕一次豕 厲二次胞狀i合計
移植前 平均印胞數(shù)3.01X80.01 1 ，26.6
Ml0.6 4.，g o0.4 9.80.0 () 00.0 0l0ao j1.8
未處理M20.0 0.0O <D。
C}0.0 0.00.0 0.00.0 tN CO
M3o 0ao o力0.0 0.00.01 一J0.4 ,.5
M40.0 0.0g g0.0 0.00.00.0 0.00.0 j0.0 0.0
EPOM50.8 5.4O.d W. o力 0.00 00.0 i2>4 9.0
M6--h 1
M7，.2 8.11,4 42,40.2 4.9 N ID0.0 i3.0 11.3
脫唾液酸epoM84.6 31.15,6 1的70.0 0.00.0 0.00.0 !10.2 38.3
M96.0 40.5邁" b OK1.0 2"0.0 0.00.0 i15.6 幼.6
實驗區(qū)Kn合計
未處理0.30,3 ，0.1」0.0 0.00.0 0.00.0 !0.8 3.0
EPO0 00.0 0.00.0115 4.5
脫唾液酸ep(3.9 26. to0頃0.10.0 0.00.0 i9.6 38.1
☆上段0. 64mm^見野中的平均卵胞數(shù)
下段相對移植前卵巢的卵胞數(shù)的殘留率(％)
移植前卵巢中每0. 64mi^的原始卵胞數(shù)平均14. 8個，而移植后4 周的未處理組為0. 3個，EPO組為0. 4個，以及脫唾液酸EP0組為3. 9 個，特別是脫唾液酸EPO組的殘留率(27% )與未處理組(2. 3% )相比， 是有顯著差異地高值。
另外，對初期一次卵胞來說，未處理組的殘留率為10.1%，而EPO 組的殘留率為15. 2%,脫唾液酸EPO組為157. 6%。特別是脫唾液酸EPO 組，明確表明在原始卵胞的一部分向初期一次卵胞成長。另外， 一次 卵胞、初期二次卵胞的殘留率，特別是脫唾液酸EPO組與未處理組相
13比確認(rèn)有高的傾向。
從以上的結(jié)果可以判斷，供給EPO,特別是供給脫唾液酸EPO，對 移植器官組織的生長是有效的。
權(quán)利要求
1.移植器官保護(hù)用組合物，所述組合物含有紅細(xì)胞生成素作為有效成分。
2. 移植器官的生長促進(jìn)用組合物，所述組合物含有紅細(xì)胞生成 素作為有效成分。
3. 移植器官保存用組合物，所述組合物含有紅細(xì)胞生成素作為 有效成分。
4. 按照權(quán)利要求1 ~ 3的任何一項所述的組合物，其中，上述紅 細(xì)胞生成素為脫唾液酸的紅細(xì)胞生成素。
5. 從移植時再灌流障礙保護(hù)移植器官的方法，其中包括把含 有紅細(xì)胞生成素作為有效成分的組合物直接供給移植器官的工序。
6. 促進(jìn)移植器官在被移植對象上生長的方法，其中包括把含 有紅細(xì)胞生成素作為有效成分的組合物直接供給移植器官的工序。
7. 紅細(xì)胞生成素的用途，其用于從移植時再灌流障礙保護(hù)移植 器官的醫(yī)療用組合物。
8. 紅細(xì)胞生成素的用途，其用于制造促進(jìn)移植器官在被移植對 象上生長的醫(yī)療用組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及以紅細(xì)胞生成素(EPO)作為有效成分的移植器官保護(hù)用組合物、移植器官的生長促進(jìn)用組合物或移植器官保存用組合物。
文檔編號A61K38/22GK101631561SQ20088000775
公開日2010年1月20日 申請日期2008年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月9日
發(fā)明者鈴木宏志, 齊藤英樹 申請人:國立大學(xué)法人帶廣畜產(chǎn)大學(xué);中外制藥株式會社