專利名稱：：用于低溫保存和隨后移植的器官的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及器官的灌流。更具體的是它涉及用來(lái)灌流離體的動(dòng)物(包括人)的器官的計(jì)算機(jī)控制裝置和方法。更為具體的是，本發(fā)明涉及在低溫保存制備中，向離體的器官或組織引入可玻璃化濃度的低溫保護(hù)劑，并在其低溫保存后，在準(zhǔn)備移植入動(dòng)物體，包括人體時(shí)從器官和組織上除去這些低溫保護(hù)劑的裝置和方法。
背景技術(shù)：
：低溫保存(即在極低溫度下保存)器官可以建立用于移植使外科的器官庫(kù)，類似于當(dāng)今醫(yī)學(xué)界使用的血庫(kù)。目前，低溫保存可通過(guò)器官的冷凍或器官的玻璃化來(lái)達(dá)到。若器官被冷凍，器官內(nèi)形成的冰晶會(huì)機(jī)械地破壞它的結(jié)構(gòu)，因此在移植進(jìn)接受者體內(nèi)時(shí)，損傷其正確發(fā)揮功能的能力。相反，玻璃化意味著固化成玻璃態(tài)，沒(méi)有形成冰晶。低溫保存的主要困難在于它需要用高濃度的低溫保護(hù)劑(在冷卻到極低溫度時(shí)水溶性的有機(jī)分子最少或防止凍傷)灌流器官。當(dāng)今沒(méi)有開(kāi)發(fā)出完全合適的設(shè)備或方法來(lái)執(zhí)行該灌流過(guò)程。這阻滯了可能拯救生命的活器官庫(kù)的建立。1970年早期以來(lái)文獻(xiàn)中已有人描述了用低溫保護(hù)劑灌流器官的裝置和方法。參見(jiàn)Pegg，D.E，低溫生物學(xué)的現(xiàn)況(CurrentTrendsinCryobiology)(A.U.Smith編輯)Plenmu出版，紐約，1970，153-180頁(yè)，特別是175-177頁(yè)；和Pegg，D.E.，低溫生物學(xué)(Cryobiology)9411-419(1972)。Pegg最初描述的裝置中兩個(gè)灌流回路同時(shí)運(yùn)行，一個(gè)具有低溫保護(hù)劑，另一個(gè)沒(méi)有。通過(guò)從沒(méi)有低溫保護(hù)劑的回路突然轉(zhuǎn)換到含低溫保護(hù)劑的回路，然后再返回的辦法來(lái)引入和除去低溫保護(hù)劑。通過(guò)未揭示的技術(shù)控制壓力，將數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)記錄儀，該記錄儀輸出由程序化的Wang臺(tái)式計(jì)算器處理的紙帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果不良。所述的設(shè)備和技術(shù)被Pegg和他的同事們認(rèn)為是不合適的。后來(lái)他們作了很大改進(jìn)。1973年，Sherwood等(器官保存，D.E.Pegg編輯，倫敦(1973)，152-174頁(yè))揭示了四種可能的灌流系統(tǒng)，沒(méi)有一種現(xiàn)已得以建立。第一種系統(tǒng)由直接通過(guò)多路徑閥與器官相連的一組貯液器構(gòu)成，通過(guò)從一個(gè)貯液器簡(jiǎn)單地轉(zhuǎn)換到另一個(gè)貯液器就可逐步做出改變。第二種系統(tǒng)通過(guò)計(jì)量來(lái)自稀釋貯液器和來(lái)自低溫保護(hù)劑濃縮物貯液器并流入混合室、然后流入腎的液流量來(lái)改變濃度。沒(méi)有獨(dú)立的泵來(lái)控制流入腎的流量。總流量通過(guò)用于混合的計(jì)量泵的輸出來(lái)控制。在過(guò)濾器前而不是過(guò)濾器后使用熱交換器(這樣限制了熱交換器效率)，大多沒(méi)有動(dòng)脈樣感覺(jué)。正如在下面的說(shuō)明中會(huì)揭示的，該系統(tǒng)和本發(fā)明的唯一相似之處是使用兩個(gè)濃度傳感器，一個(gè)處于腎臟的動(dòng)脈管上，另一個(gè)處于靜脈上。為了使動(dòng)脈靜脈(A-V)濃度差最小，器官的流速被強(qiáng)制地改變。對(duì)腎臟前和后的回路中濃度的感知類似于，但明顯比本發(fā)明中使用的折射計(jì)和差示折射計(jì)差。本發(fā)明者的經(jīng)驗(yàn)表明使用差示折射計(jì)對(duì)于較大的靈敏度是必不可少的。通過(guò)控制器官流量控制A-V梯度的概念比本發(fā)明的系統(tǒng)明顯要差。Sherwood等揭示的第三個(gè)系統(tǒng)也缺少腎臟灌流泵，依靠“背壓控制閥”使來(lái)自濾器的灌流液再循環(huán)，這樣可維持所需的對(duì)腎臟的灌流壓。和第二種Sherwood系統(tǒng)一樣，熱交換器接近于過(guò)濾器，沒(méi)有防泡閥。和第二種Sherwood系統(tǒng)中一樣通過(guò)計(jì)量加入的低溫保護(hù)劑或稀釋劑來(lái)控制灌流液貯器的濃度，若來(lái)自器官的液流不再循環(huán)，維持和控制灌流注體積和濃度就產(chǎn)生了大問(wèn)題。這些都是不希望的特征。Pegg在主要論文的附錄里提出了第四種系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，灌流液靠重力直接從混合器通過(guò)熱交換器到達(dá)腎臟，在通過(guò)腎臟后再進(jìn)入貯器。也通過(guò)直接和獨(dú)立的泵將液體從貯器泵到折射計(jì)并返回來(lái)監(jiān)測(cè)濃度。Pegg等(低溫生物學(xué)(Cryobiology)14168-178(1977))報(bào)道了修改和補(bǔ)充的細(xì)節(jié)。該裝置使用了一個(gè)混合器，和一個(gè)用來(lái)向混合器中加入濃甘油或無(wú)甘油灌流液以控制濃度的貯器。混合器的體積在灌流時(shí)保持恒定，在洗去低溫保護(hù)劑時(shí)稀釋液的加入必須呈指數(shù)增長(zhǎng)以保持濃度改變的線性速率。恒定的混合器體積和只有一個(gè)輸送貯器存在也使灌流液濃度不可能突然改變。除了腎和腎臟前的熱交換器外，所有回路里的組成部分都位于室溫下的實(shí)驗(yàn)室工作臺(tái)上，貯器是30℃恒溫的。腎臟和熱交換器處于苯乙烯泡沫塑料盒內(nèi)，沒(méi)有控制其內(nèi)部溫度。盡管對(duì)腎臟周圍的空氣沒(méi)有控制，只對(duì)動(dòng)脈溫度測(cè)量而對(duì)靜脈溫度或甚至對(duì)腎臟的表面溫度不作測(cè)量。使用苯乙烯泡沫塑料盒也不允許在無(wú)菌的條件下灌流。測(cè)量器官流速的唯一可能的方式是關(guān)掉流出的再循環(huán)泵，人工記錄給定體積的液體在流出貯器中積聚所需的時(shí)間，因?yàn)闆](méi)有特定用于器官的灌流泵，這與本發(fā)明不同。壓力不是基于腎臟的阻力，而是基于腎臟和用來(lái)讓灌流液通過(guò)熱交換器并返回混合貯器快速循環(huán)的可用于調(diào)節(jié)的旁路閥的綜合阻力來(lái)控制的。壓力傳感器處于動(dòng)脈套管處，這產(chǎn)生了需要人工清除液體的死角，這有可能使未混合的死角液體加入動(dòng)脈套管中。通過(guò)在早期文獻(xiàn)中述及(Pegg等，低溫生物學(xué)，1056-66(1973))的電路特定制作的壓力控制單位來(lái)控制壓力。測(cè)量動(dòng)脈濃度而不是靜脈濃度。沒(méi)有使用計(jì)算機(jī)控制或監(jiān)測(cè)。通過(guò)將折射記錄輸入“工藝控制器”與線性電壓斜面生成器(linearvoltagerampgenerator)的輸出比較來(lái)控制濃度，并對(duì)濃度或稀釋液流速作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。以5分鐘的間隔在混合貯器的兩端和動(dòng)脈樣品出口處人工測(cè)量甘油的濃度，顯然，沒(méi)有用折射計(jì)將可測(cè)量的信號(hào)發(fā)送到記錄裝置內(nèi)。以5分鐘的間隔人工測(cè)量溫度和流量。在條幅式的圖表記錄器上以筆痕記錄動(dòng)脈壓和腎重。這些特征都是不需要的。Jacobsen等(低溫生物學(xué)1518-26(1978))報(bào)道了進(jìn)一步的改進(jìn)。加上防泡閥，取消腎臟通道的樣品出口(在通道的遠(yuǎn)端測(cè)量濃度)，在條幅式的圖表記錄器上記錄溫度而不是人工每5分鐘記錄。另外，這些作者報(bào)道，通道濃度比貯器濃度延遲5分鐘(而在本發(fā)明中對(duì)于動(dòng)脈濃度為3分鐘或更少時(shí)間)，在向混合貯器內(nèi)加入5升稀釋液后最終的低溫保護(hù)劑濃度不低于70mM(而本發(fā)明中接近0終點(diǎn)濃度是使用少于3升的稀釋液，低溫保護(hù)劑的最大值是Jacobsen等人所述的兩倍)。同年I.A.Jacobsen(低溫生物學(xué)15302-311(1978))也報(bào)道了對(duì)系統(tǒng)的改進(jìn)。Jacobsen測(cè)量了但沒(méi)有報(bào)道灌流時(shí)腎臟周圍的空氣溫度。他將混合貯器的體積減少到70毫升，這是400毫升回路總體積中極小的部分。沒(méi)有使用電輸出折射計(jì)來(lái)直接測(cè)量甘油的濃度，并控制加入和洗脫過(guò)程。取而代之的是濃度或稀釋液流速的計(jì)算值用India墨汁畫在紙上，由控制濃度/稀釋液泵的Leeds和NorthrupTrendtrak程序器讀數(shù)。盡管回路體積很低，低溫保護(hù)劑的最小濃度可達(dá)約100mM。Armitage等(低溫生物學(xué)18370-377(1981))報(bào)道了相似系統(tǒng)的另外的變化。必不可少的是，將預(yù)先使用的整個(gè)灌流回路放入冰柜內(nèi)。用凸輪隨動(dòng)件代替電壓斜面控制器。但是，為了正確地分割凸輪，需要用熱平衡計(jì)算出加入甘油或稀釋液所需的速度，在實(shí)際所需的濃度-時(shí)間關(guān)系曲線中會(huì)引入誤差。最后，將另外的貯器加入回路中進(jìn)行改進(jìn)。該庫(kù)用人工活塞進(jìn)入(沒(méi)有清除地解釋進(jìn)入貯器和出貯器的轉(zhuǎn)換方式)，新貯器的使用可以濾去灌流液或讓它通過(guò)防泡閥。不用新貯器來(lái)改變低溫保護(hù)劑的濃度；它用于改變加入低溫保護(hù)劑后介質(zhì)中的離子組合物的濃度?；旌腺A器的體積為500毫升，最終低溫保護(hù)劑的濃度為40mM。根據(jù)發(fā)明人的理解，上述的裝置和方法代表了低溫保護(hù)劑灌流領(lǐng)域中其他人實(shí)施的現(xiàn)狀。由申請(qǐng)人所述的一種低溫下器官保存的方法是冷卻時(shí)的器官玻璃化而不是冷凍(參見(jiàn)，例如Fahy等，低溫生物學(xué)21407-426(1984)；和美國(guó)專利4,559,298)?！安ＡЩ笔菬o(wú)冷凍的固化，為低溫保存形式。當(dāng)系統(tǒng)或器官冷凍時(shí)，可通過(guò)用抑制水結(jié)晶(如形成冰)的低溫保護(hù)劑置換活系統(tǒng)內(nèi)大量水，玻璃化就可在如離體的人或其它動(dòng)物體器官內(nèi)完成。典型過(guò)程玻璃化需要大于6摩爾(M)低溫保護(hù)劑。但是，用已有技術(shù)，可以用足夠高濃度的低溫保護(hù)劑濃度使器官玻璃化而不殺傷器官。對(duì)器官存活來(lái)說(shuō)，限定濃度典型地為4M以上。低溫保護(hù)劑引起的一類損傷是滲透損傷。低溫生物學(xué)家在1950年就了解了低溫保護(hù)劑的滲透作用，和控制這些作用以便在向離體的細(xì)胞和組織中加入和除去低溫保護(hù)劑時(shí)能防止不必要的損傷。當(dāng)?shù)蜏厣飳W(xué)家著眼于研究用低溫保護(hù)劑灌流整個(gè)器官時(shí)也有相似的結(jié)論。注意滲透原理，必須誘導(dǎo)器官對(duì)加入的低溫保護(hù)劑的耐受能力。盡管努力控制低溫保護(hù)劑的有害滲透作用，仍可觀察到對(duì)低溫保護(hù)劑耐受力的限度。這似乎是低溫保護(hù)劑真正的、內(nèi)在的毒害影響，它不依賴于這些化學(xué)劑短暫的滲透作用。本發(fā)明者和另一些人已檢查了對(duì)低溫保護(hù)劑非滲透、內(nèi)在毒性的控制方法。結(jié)果顯示一些技術(shù)單獨(dú)或結(jié)合使用是很有效的。這些技術(shù)包括(a)在較低溫度下暴露于最高濃度；(b)使用能相互排除毒性的低溫保護(hù)劑的特定組合；(c)將低溫保護(hù)劑暴露于對(duì)于這些特定低溫保護(hù)劑最佳的載體溶液中；(d)使用非滲透劑代替部分必需的滲透劑，這樣可使細(xì)胞內(nèi)部不暴露于更多的細(xì)胞內(nèi)試劑；和(e)使依賴于時(shí)間的快速毒性的濃度范圍里所化的時(shí)間最少。但是，對(duì)整個(gè)器官使用這些原理，使之能被可玻璃化的溶液處理而沒(méi)有損傷的手段是不清楚的或不可得的。這些技術(shù)中的一些技術(shù)與控制滲透力的需要有潛在的抵觸性。例如，降低溫度也降低了低溫保護(hù)劑的流入率和流出率，從而延長(zhǎng)和加強(qiáng)了它們的滲透作用。相似的是，使暴露于低溫保護(hù)劑的時(shí)間減至最短則使它們潛在的滲透作用增至最大。這樣，在控制滲透損傷和控制毒性之間必需尋求一個(gè)平衡。獲得該平衡的合適手段是這些文獻(xiàn)中所未述及的。有時(shí)，通過(guò)減小暴露于這些藥劑中的時(shí)間而加強(qiáng)低溫保護(hù)劑的滲透作用是有益的，可以降低造成的毒性，但沒(méi)有述及用來(lái)在整個(gè)器官中得到該結(jié)果的安全措施。在低溫下保存器官可以減少寶貴的人體器官的浪費(fèi)，并使供者和接受者更好地相配，盡管近來(lái)在控制排斥上有了許多進(jìn)展[參見(jiàn)，Takiff等，移植(Transplantation)47102-105(1989)；Gilks等，移植(Transplantation)43699-674(1987)]，但這一點(diǎn)仍是很重要的因素。此外，目前正在開(kāi)發(fā)的用以激發(fā)接受者對(duì)特定供體器官的免疫耐受性的大多數(shù)技術(shù)可能由于接受體的制備有了更多的時(shí)間而受到促進(jìn)。器官低溫保存研究的一個(gè)主要局限是缺少用來(lái)控制灌流參數(shù)(如低溫保護(hù)劑濃度-時(shí)間關(guān)系曲線、壓力和溫度)的合適的裝置。前述標(biāo)準(zhǔn)的灌流機(jī)器不是為本申請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)的，不能滿足本申請(qǐng)的需求。至今已知的專利技術(shù)如下美國(guó)專利3,753,865授予Belzer等；美國(guó)專利3,772,153授予DeRoissart等；美國(guó)專利3,843,455授予Bier，M；美國(guó)專利3,892,628授予Thorne等；美國(guó)專利3,914,954授予Doerig，R.K.；美國(guó)專利3,995,444授予Clark等；美國(guó)專利3,629,686授予Gruenberg，M.L.；和美國(guó)專利3,837,390授予Reneau，R.P.。過(guò)去用于低溫保存的裝置只允許實(shí)施相當(dāng)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)方案，常常在實(shí)用中力不從心。只有Adem等報(bào)道了使用計(jì)算機(jī)用低溫保護(hù)劑對(duì)器官進(jìn)行灌流(參見(jiàn)，例如生物醫(yī)學(xué)工程(J.Biomed.Engineering)3134-139(1981))。但是，他們特定的設(shè)計(jì)有一些重大的缺陷限制了它的應(yīng)用。本發(fā)明明顯克服了已知裝置和方法中所有的缺陷。發(fā)明綜述在一個(gè)技術(shù)方案中，本發(fā)明涉及用灌流液灌流入體或其它動(dòng)物器官，如腎臟、肝臟、心等的計(jì)算機(jī)控制裝置和方法，并包括為進(jìn)行這類灌流而對(duì)器官進(jìn)行制備。器官的灌流由于下列許多理由中(不僅僅局限于這些理由)的任何一個(gè)而得以進(jìn)行例如制備用于低溫保存的器官；制備低溫保存后用于移植的器官；用常規(guī)的手段在0℃以上保存；在高溫下暫時(shí)的保持活力以研究其生理學(xué)；試驗(yàn)器官的活力；嘗試使器官?gòu)?fù)活；和固定器官進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究。裝置和方法也可用來(lái)使器官或組織薄切片過(guò)冷。在另一個(gè)技術(shù)方案中，本發(fā)明涉及用伊洛前列腺和/或其它藥物來(lái)制備的灌流液對(duì)供體動(dòng)物和/或準(zhǔn)供體器官進(jìn)行的處理。在另一個(gè)技術(shù)方案中，本發(fā)明涉及用來(lái)制備低溫保存器官的裝置和方法，如玻璃化方法。在另一個(gè)技術(shù)方案中，本發(fā)明涉及在低溫保存后用于移植進(jìn)合適宿主的器官的制備裝置和方法。在一個(gè)技術(shù)方案中，本發(fā)明涉及低溫保存的生物器官的制備方法，包括下列步驟(a)用逐步增加到第一預(yù)定濃度的低溫保護(hù)劑溶液灌流器官，同時(shí)降低器官的溫度；(b)將低溫保護(hù)劑的濃度維持足夠時(shí)間以允許器官產(chǎn)生近似的滲透平衡；和(c)將溶液的低溫保護(hù)劑濃度增加到更高的第二預(yù)定濃度，并維持該濃度足夠的時(shí)間以允許器官產(chǎn)生近似的滲透平衡。然后將器官?gòu)墓嗔餮b置中取出，用合適的方法進(jìn)行低溫保存，或?yàn)檫M(jìn)一步的低溫保存準(zhǔn)備。在低溫保存后，讓器官在并非是本發(fā)明的裝置中溫?zé)?。在?zhǔn)備將器官移植入接受體內(nèi)時(shí)，將器官再連接到本發(fā)明的灌流裝置內(nèi)。在另一個(gè)技術(shù)方案中，本發(fā)明涉及在低溫保存和隨后的溫?zé)岷笥糜谝浦驳钠鞴俚闹苽浞椒?，包?a)將器官溫?zé)岬娇蛇M(jìn)行再灌流的溫度，使器官的損傷最?。?b)用非玻璃化濃度的低溫保護(hù)劑對(duì)器官灌流足夠時(shí)間，以允許器官達(dá)到近似的滲透平衡；和(c)將所用的低溫保護(hù)劑基本上灌出來(lái)，同時(shí)將器官的溫度升高到適合移植的溫度。在另一個(gè)技術(shù)方案中，本發(fā)明涉及用于移植的器官的制備方法，進(jìn)一步包括用濃度降低的低溫保護(hù)劑與低分子量(LMW)“非滲透性”滲透緩沖劑(OBA)；或高分子量(HMW)“非滲透性”O(jiān)BA；或LMW和HMW的OBA混合物的灌流器官，HMW的OBA或LMW的OBA的加入和除去是以和諧的方式進(jìn)行的，用器官的不同而不同。對(duì)于肝臟，根本不用滲透緩沖液。對(duì)于大多數(shù)其它器官，用含第一OBA濃度適當(dāng)?shù)牡蜏乇Ｗo(hù)劑溶液對(duì)器官灌流足夠時(shí)間以允許器官達(dá)到滲透平衡。然后基本上洗去所有的低溫保護(hù)劑(最終的低溫保護(hù)劑濃度低于200毫摩爾)同時(shí)將OBA濃度降到非0水平但明顯低于第一緩沖劑濃度水平的第二水平，同時(shí)提高器官的溫度。最后，灌流器官以除去OBA而使器官適合于移植。器官的例子包括兔腎、鼠肝和人腎。本發(fā)明的裝置包括操縱含多個(gè)液體貯器的灌流回路的計(jì)算機(jī)、升高和降低濃度的裝置和器官容器。第一液體流程途徑被定義為從多個(gè)貯器必不可少的傳感器和溫度調(diào)節(jié)裝置再到多個(gè)貯器的回路。貯器可選擇性地與第一流程途徑相連。泵裝置介入第二液體流程途徑以將第一液體流程途徑中的液體泵到第二液體流程途徑中。器官容器處于第二液體流程途徑中。泵裝置也可包括于第二液體流程途徑以便將來(lái)自器官容器的液體泵到一個(gè)或多個(gè)貯器或泵到廢液池。一個(gè)或多個(gè)傳感器被插入液體流程途徑以監(jiān)測(cè)在第一和/或第二液體流程途徑中液體的至少一個(gè)濃度、濃度差、溫度、壓力和pH。測(cè)量裝置被插入第一和第二液體流程途徑以測(cè)量器官容器中液體流向的上游和下游之間的濃度差和溫度差。傳感器和測(cè)量裝置與程序化的計(jì)算機(jī)相連以提供從傳感器到計(jì)算機(jī)連續(xù)的信息流。最后計(jì)算機(jī)與選擇裝置和泵裝置偶聯(lián)以連續(xù)地選擇性地控制(a)來(lái)自每個(gè)貯器進(jìn)入液體流程途徑的液體流量，(b)來(lái)自每個(gè)液體流程途徑進(jìn)入每個(gè)貯器的液體流量，和(c)根據(jù)預(yù)定的計(jì)算機(jī)程序，在基本沒(méi)有操作者介入下測(cè)出的在第一和/或第二液體流程途徑中液體的至少一個(gè)濃度、溫度、壓力和pH。本發(fā)明裝置的附加特征可包括插入第一液體流程途徑、用來(lái)調(diào)節(jié)該液體流程途徑中液流溫度的熱交換器。第二熱交換器可插入第二液體流程途徑用來(lái)調(diào)節(jié)第二液體流程途徑中液流的溫度。在本發(fā)明裝置和方法的闡述中，各個(gè)相同的許多方面已經(jīng)作了編號(hào)。該編號(hào)使本申請(qǐng)產(chǎn)生了一個(gè)概念性的組織和結(jié)構(gòu)。該編號(hào)不是表示必不可少的裝置或意味著本發(fā)明中必須按它們所指的順序進(jìn)行的特定的步驟。本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明具有多個(gè)特征和優(yōu)點(diǎn)，最重要的為1.在灌流器官時(shí)根據(jù)各種廣為不同的預(yù)定濃度-時(shí)間關(guān)系曲線圖可控制灌流液中低溫保護(hù)劑或任何其它液體或藥物的濃度，在同時(shí)改變其它藥物或滲透劑濃度時(shí)，它或多或少與經(jīng)過(guò)器官的灌流液的流速無(wú)關(guān)。逐步改變濃度是可行的，也可將濃度有效地降為0。2.它提供了在線路中感知濃度、pH、灌流溫度和其它參數(shù)的方法，這樣避免在灌流貯器中裝傳感器和人工測(cè)量的必要。3.通過(guò)使灌流液從貯器到灌流傳感器再返回貯器的運(yùn)行所需時(shí)間縮短使被監(jiān)測(cè)引起的低溫保護(hù)劑濃度和灌流貯器里的低溫保護(hù)劑濃度之間的差最小。4.通過(guò)使灌流液從主液體回路到被灌流器官(或過(guò)冷組織)所需的時(shí)間最少?gòu)亩贡槐O(jiān)測(cè)的低溫保護(hù)劑濃度和真正灌流到器官的低溫保護(hù)劑濃度之間的差最小。5.可以測(cè)量穿越器官的低溫保護(hù)劑濃度的動(dòng)脈-靜脈差作為器官與低溫保護(hù)劑平衡的程度指標(biāo)。6.可以控制器官的溫度而與通過(guò)器官的灌注液流基本無(wú)關(guān)，并可隨意地改變?cè)摐囟取?.可以控制灌流壓，同時(shí)可固定灌流壓或按需改變它，需要時(shí)可使壓力波動(dòng)最小。8.防止未混合溶液、空氣泡、顆粒或病原體灌流入器官，并避免液體接近死角。9.它用計(jì)算機(jī)控制灌流，這樣提供了對(duì)數(shù)據(jù)的實(shí)際時(shí)間監(jiān)測(cè)、顯示、處理和記錄，并對(duì)傳到傳感器和泵標(biāo)字刻度和指導(dǎo)灌流回路的清掃、消毒和整理，并在需要時(shí)指導(dǎo)和警告操作者。10.能容易地灌流和低溫保護(hù)各種大小的器官，如從大鼠心到人肝臟，也能使組織或細(xì)胞培養(yǎng)物過(guò)冷。附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明圖1(包括圖1A和1B)。圖1A顯示本發(fā)明總的液體回路。圖1B顯示流出液分布部件(EDB)的結(jié)構(gòu)和流出液被分流以便從圖1A中的ΔR.I.泵126取樣的裝置。圖2A-C依次顯示本發(fā)明用作貯器R1的兩室的梯度形成器的側(cè)視圖、頂視圖和底視圖。圖3A-C依次顯示本發(fā)明用作貯器R3的三室梯度形成器的側(cè)視圖、頂視圖和底視圖。圖4A-C依次顯示用于本發(fā)明的熱交換器/防泡閥/混合器(HBM)的左視圖、前視圖和右視圖；圖4D顯示了HBM基部的混合單位區(qū)域；圖4E顯示了HBM基部的頂視圖。圖5顯示了引入和除去相當(dāng)稀釋的玻璃化溶液的典型方案。用于圖5和后面附圖中縮寫的含義如下pH5表示相5；epH6和7分別表示相6和7的末端；pH5250表示在相5時(shí)LMWOBA的濃度為250毫摩爾；epH650和epH70表示在相6和7末端分別為50和O毫摩爾LMWOBA濃度；Veh．表示載體；EC表示Eurocollins溶液；CPA表示低溫保護(hù)劑；回路中的圓卷中的1-7數(shù)字是指后面述及的7個(gè)相；P/10表示壓力除以10；M表示目標(biāo)的摩爾濃度；表示測(cè)量的摩爾濃度；和F表示流量ml/分鐘。圖6顯示了兩步引入充分濃縮玻璃化溶液的部分方案，這是在標(biāo)準(zhǔn)灌流機(jī)中進(jìn)行的。圖7A-7D包括用于器官低溫保護(hù)劑灌流的流程圖。圖8是用于引入高濃度低溫保護(hù)劑的兩步冷卻技術(shù)的細(xì)節(jié)圖解。圖9顯示用玻璃化溶液在標(biāo)準(zhǔn)填注機(jī)器外和-20到-30℃下灌流腎臟的裝置。圖l0(包括圖10A-l0D)顯示大鼠肝臟的典型灌流方案，其中既沒(méi)有使用HES，也沒(méi)有使用LMWOBA。圖1lA和11B包括非低溫保護(hù)劑灌流過(guò)程的流程圖。圖12顯示用已知為V49的玻璃化溶液灌流后被移植的兔子腎臟發(fā)揮功能的能力，以它們對(duì)血清肌酸酐的控制來(lái)度量。圖13顯示在預(yù)先用7.5M或8M低溫保護(hù)劑灌流后冷卻到-30℃對(duì)兔腎臟的影響，并與暴露于-3℃未冷卻的腎臟結(jié)果作比較。圖14顯示在冷卻到-23℃后兔腎臟薄切片暴露于高濃度低溫保護(hù)劑的結(jié)果，它顯示通過(guò)開(kāi)始在低濃度(6.1M)下冷卻可防止凍傷和與高濃度引起的毒害。圖15顯示在6.1M低溫保護(hù)劑中也可成功地避免腎臟的凍傷(100％存活，優(yōu)秀的極好的最終肌酸酐水平)，證明凍傷可被低濃度消除的學(xué)說(shuō)。圖l6顯示在-22℃下引入8M低溫保護(hù)劑的兩步方法的可行性；兩周后存活率為7/8，肌酸酐水平是極好的，與只暴露于6.1M低溫保護(hù)劑腎臟的結(jié)果相同。圖17顯示用8M低溫保護(hù)劑并降溫至-32℃可避免凍傷的兩步方法的可行性(存活率＝100％，最終的肌酸酐水平與只暴露于6.1M低溫保護(hù)劑腎臟的結(jié)果相同)。圖18顯示用V55處理并冷卻到-46℃經(jīng)歷最大凍傷的腎臟切片，在薄片冷卻到玻璃化溫度時(shí)沒(méi)有進(jìn)一步的損傷出現(xiàn)。圖19顯示用V55處理并冷卻到-46℃完整腎臟中的手術(shù)后的血清肌酸酐水平及其后的生命支持功能(存活率1/1這樣處理的腎臟；最終的肌酸酐水平可接受)。圖20(包括圖20A和20B)顯示用本發(fā)明的方法以V55的玻璃化溶液灌流人體腎臟的數(shù)據(jù)。特別是，圖20A顯示對(duì)低溫保護(hù)劑濃度成功的控制。圖20B顯示阻力和流量數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)來(lái)自同一個(gè)232克人體的腎臟。在圖20A中，P表示壓力(毫米Hg柱)。在圖20B中，阻力由重量乘壓力除以流速表示。圖21顯示來(lái)自與圖20相同腎臟的冷凍數(shù)據(jù)。腎臟浸漬在60％w/v二甲基亞砜和乙酰胺混合物后再冷凍。這些數(shù)據(jù)是冷凍約15分鐘后器官核心溫度為0℃再到玻璃化溫度時(shí)連續(xù)記錄的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)揭示腎臟內(nèi)沒(méi)有形成冰。圖22顯示了用本發(fā)明的方法將V55對(duì)小兒腎臟進(jìn)行灌流(上升部分)和洗去(下降部分)。實(shí)線表示V55的預(yù)定濃度，虛線表示實(shí)際測(cè)得的V55在回路中的濃度。由于低溫保護(hù)劑從該腎臟去除，故沒(méi)有產(chǎn)生冷卻曲線。圖23(包括圖23A-23C)顯示了兔子腎臟薄切片(圖23A)、人腎臟薄切片的存活數(shù)據(jù)(圖23B)和兔子-人體對(duì)比的數(shù)據(jù)(圖23C)。人腎臟薄切片對(duì)V49的反應(yīng)與兔子薄切片相同，但冷凍到-30℃后恢復(fù)力較低。定義為了弄清和理解本說(shuō)明書和權(quán)利要求書，包括其中給出的這類術(shù)語(yǔ)的范圍，現(xiàn)提供下列定義。這里或本申請(qǐng)其它部分沒(méi)有定義的任何術(shù)語(yǔ)在用于本發(fā)明時(shí)具有該
技術(shù)領(lǐng)域：
人員公知的普通含義。這里所用的“低溫保存”表示離體的組織或器官儲(chǔ)存在很低溫度下能保持活力。低溫保存包括冷凍和玻璃化。這里所用的“玻璃化”表示一個(gè)器官或組織的沒(méi)有結(jié)冰的固化。這里所用的“低溫保護(hù)劑”表示一類與沒(méi)有低溫保護(hù)劑的冷凍作用相比，器官冷到零下溫度時(shí)它們能抑制冰晶體形成，升溫后因而能提高存活率化學(xué)制劑。除非特別指出，這里所用的溫度單位都是℃。這里所用的“非滲透”表示絕大多數(shù)化學(xué)制劑分子不滲入組織或器官的細(xì)胞，而只留在組織或器官的細(xì)胞外體液中。這里所用的“滲透緩沖劑(OBA)”表示低分子量(LMB)或高分子量(HMB)的非滲透性細(xì)胞外溶質(zhì)，在低溫保護(hù)劑流出過(guò)程中它們能抵銷細(xì)胞內(nèi)比細(xì)胞外低溫保護(hù)劑濃度大所產(chǎn)生的滲透作用。這里所用的LMWOBA的相對(duì)分子量(Mr)為1,000道爾頓或更低。LMWOBA包括，但不限于，麥芽糖、果糖1，6-二磷酸鉀和鈉、乳糖酸鉀和鈉、甘油磷酸鉀和鈉、麥芽戊糖、水蘇糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、麥芽三糖、葡糖酸鉀和鈉、葡萄糖6-磷酸鉀和鈉和棉子糖。在更好的技術(shù)方案中，LMWOBA選用甘露醇、蔗糖和棉子糖。這里所用的HMWOBA的Mr為1,000到500,000道爾頓。HMWOBA包括，但不限于，羥乙基淀粉(HES)(450,000道爾頓及其較低的Mr水解片段，特別是1,000到100,000道爾頓片段)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，棉子糖十一烷乙酸鉀(＞1,000道爾頓)和Ficoll(1,000-100,000道爾頓)。在最好的技術(shù)方案中，MWOBA是HES，450,000分子量。這里所用的“近似的滲透平衡”表示動(dòng)脈和靜脈的濃度差約低于50-200mM(4M動(dòng)脈濃度處差值為200mM表示靜脈濃度是動(dòng)脈濃度的95％。對(duì)于下面所述的低溫保護(hù)劑公式而言，153mM的差別相當(dāng)于1％w/v濃度差)。這里所用的“動(dòng)物”表示哺乳動(dòng)物，包括，但不限于人。對(duì)較好技術(shù)方案和最好模式的詳細(xì)闡述1.對(duì)灌流裝置的說(shuō)明在較好的技術(shù)方案中，結(jié)合了本發(fā)明原理和特征的裝置位于冰柜100中(圖1A中以雙虛線顯示)。冰柜含有兩面，貯器/電池閥面和器官/折射計(jì)面。冰柜正面是雙層鑲嵌透明的玻璃的門，每個(gè)在玻璃板之間有約1英寸絕緣空氣(這可在需要時(shí)降低壓力和/或濕度)以避免潮氣在門上冷凝并使熱向冰柜內(nèi)泄漏最少。器官面的門被分割開(kāi)以形成“上下可分別開(kāi)關(guān)的門”。這讓器官面的門的上部可被打開(kāi)和關(guān)閉，以便將器官放入系統(tǒng)并取出器官而不改變門上部以下部分(具有器官容器和大多數(shù)其它裝置)的溫度。在冰柜的貯器面處也可用“上下兩部分可各自分別開(kāi)關(guān)的門”，使操作者可進(jìn)行任何所需的調(diào)整(如向貯器內(nèi)加入液體、上部液體管的轉(zhuǎn)移等)而不會(huì)干擾冰柜的溫度到不需要的程度。本發(fā)明的最初特征和其操作模式如圖1A的方塊流程圖所示。根據(jù)三通電磁閥S1、S2和S3的計(jì)算機(jī)控制行動(dòng)模式，通過(guò)系統(tǒng)循環(huán)的所有液體用回路泵102將液體通過(guò)管道U1、U2、U3或U4攝入主回路。攝入管道U1-U4或與來(lái)自貯器R1-R4的液體輸送管道D1-D4分別連接，或與清洗口C1-C4連接，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)管快速斷開(kāi)。如彎曲的箭頭所示，夾住D1-D4并從攝入管道U1-U4中拔出，管道U1-U4可插入清除口C1-C4。雖然目前由人工完成該項(xiàng)工作，但可加上相關(guān)領(lǐng)域中認(rèn)可的合適的閥、管和控制器來(lái)自動(dòng)地處理大多數(shù)這些事務(wù)。在本發(fā)明技術(shù)方案如現(xiàn)有的構(gòu)造所示，貯器R1-R4由一厚的透明塑料擱板支撐，懸掛了四個(gè)用來(lái)攪拌四個(gè)貯器的磁性攪拌臺(tái)(圖1未顯示)。徹底攪拌貯器R1、R3和R4是正確地產(chǎn)生所需濃度-時(shí)間關(guān)系曲線所必不可少的。開(kāi)/關(guān)狀態(tài)和攪拌臺(tái)的攪拌速度獨(dú)立地由位于冰柜外的裝置控制?？贑1-C4通向無(wú)菌(蒸餾)水、空氣和消毒劑源。電磁閥S0和S00插入用來(lái)輸送這些原料的輸送管中，并保證痕量的消毒劑也不會(huì)偶然進(jìn)入灌流系統(tǒng)。電磁閥S0控制空氣或液體進(jìn)入灌流回路進(jìn)行清洗，而電磁閥S00決定所選擇的液體是水或是消毒劑。主要清洗管道在冰柜外而不是在到達(dá)C1-C4之前分成四個(gè)獨(dú)立的通道(圖1沒(méi)有顯示)，這確保了每個(gè)通道彼此獨(dú)立，即來(lái)自攝入管道U1-U4進(jìn)入清洗管道再到清洗口C1-C4的液體不會(huì)因未清洗溶液的擴(kuò)散而產(chǎn)生交叉污染。通過(guò)除菌過(guò)濾器F4將蒸餾水和消毒劑攝入系統(tǒng)，通過(guò)空氣過(guò)濾器F5將空氣攝入系統(tǒng)。目前選用的消毒劑是臨床上可接受的透滲機(jī)的冷消毒劑，如ActrilTM(美國(guó)明尼蘇達(dá)州明尼阿波力斯Minntech公司)。清洗的過(guò)程是用水然后用消毒劑洗去系統(tǒng)中的灌流液。在下一次灌流前，用水洗去系統(tǒng)中的消毒劑，然后用空氣洗去系統(tǒng)中的水。用合適的灌流液代替空氣灌流系統(tǒng)。用空氣沖洗以避免溶于淋洗水中滯留的痕量消毒劑的長(zhǎng)留下去，并避免灌流液體被水稀釋的可能性(即，減少了對(duì)代替來(lái)自系統(tǒng)中水的灌流液體的需求量)，可對(duì)灌流的完成情況作肉眼觀察，當(dāng)貯器、過(guò)濾器和器官容器清洗后但在灌流前被放進(jìn)系統(tǒng)中時(shí)減少了冰柜中水的溢出。但是需要時(shí)可省略空氣沖洗。需要時(shí)用空氣過(guò)濾器以防止來(lái)自空氣的病原體的污染。電磁閥S9-S12一般讓液體流入貯器R1-R4或流入廢液管道(LW)。也可通過(guò)除去來(lái)自貯器R1-R4的再循環(huán)管道RL5-RL8使貯器R1-R4與系統(tǒng)脫開(kāi)，貯器R1-R4(按照彎曲的箭頭)分別與廢物出口W1-W4接通，讓貯器R1-R4從系統(tǒng)中除下進(jìn)行清洗、消毒和重新填充。當(dāng)貯器R1-R4被除去后，閥門S9-S12讓液體進(jìn)入廢物出口W1-W4。相應(yīng)于廢物出口W1-W4的四個(gè)廢物管道合并成單個(gè)共同的廢物管道LW。兩通電磁閥門S16位于共同的廢物管道上。沒(méi)有使用廢物出口時(shí)，共同的廢物排出管由關(guān)閉閥S16阻斷以防止廢物或病原體回流進(jìn)無(wú)菌的冰柜內(nèi)。接通貯器輸送管道D1-D4或清洗口C1-C4使用本系統(tǒng)的攝入管道U1-U4并聯(lián)合使用接通貯器內(nèi)部回流管道(圖中沒(méi)有顯示)或進(jìn)入廢物出口W1-W4的再循環(huán)管道RL5-RL8可使灌流回路完全無(wú)菌。在管從一個(gè)位置轉(zhuǎn)換到另一個(gè)位置時(shí)用消毒劑擦試攝入管道U1-U4、輸送管道D1-D4、清洗口C1-C4和廢物出口W1-W4的鈍端來(lái)進(jìn)行消毒。在轉(zhuǎn)換管時(shí)同時(shí)加手指壓力以住塞管子，防止液體滲漏并進(jìn)一步減少污染的危險(xiǎn)。從貯器R1-R4或口C1-C4抽出的液體根據(jù)電磁閥S4-S7的活動(dòng)狀態(tài)，通過(guò)數(shù)個(gè)過(guò)濾器F1、F2和F3中的一個(gè)輸走。這些活動(dòng)樣式在下面將作更具體的揭示。但是，經(jīng)驗(yàn)表明單個(gè)過(guò)濾器F1或平行的兩個(gè)過(guò)濾器F1、F1’適合大多數(shù)的研究(如斷線所示使閥門S4-S7處于任選狀態(tài))，因?yàn)樵诨芈分屑词怪挥幸粋€(gè)或兩個(gè)平行的過(guò)濾器也可有效地逐步改變濃度。需要使回路泵102的頭和電磁閥S1-S7間的距離最短，從而使回路的無(wú)效區(qū)、無(wú)效時(shí)間最小，并使灌流液粘度的影響最小。短距離和合適的管內(nèi)徑對(duì)于S1-S3尤為關(guān)鍵，這可保證從R1-R4中抽出合適的液體。標(biāo)準(zhǔn)的微孔過(guò)濾器(美國(guó)馬里蘭州Bcdford)與我們的低溫保護(hù)劑相匹配。過(guò)濾器能將灌流液除菌，并可被壓熱消毒。通過(guò)如圖1A所示的快速斷開(kāi)可將所有的過(guò)濾器架子從系統(tǒng)中取出進(jìn)行清洗和消毒。通風(fēng)管V1-V3位于冰柜100的冰凍部分外，通向電磁閥門S13-S15。在灌流和清洗系統(tǒng)時(shí)，這些通風(fēng)管在計(jì)算機(jī)的控制下開(kāi)啟和關(guān)閉，讓空氣逸出，從而防止過(guò)濾器被空氣阻塞或損傷。給V1-V3提供了的手動(dòng)旁路(只顯示S13的傍路)用作緊急情況下清除來(lái)自回路的空氣。顯然，若回路中存在過(guò)濾器F1-F3，則在過(guò)濾器F1-F3之外的用空氣清洗系統(tǒng)是不可能的；因此若該方法包括空氣清洗，則在開(kāi)始洗出消毒劑前必須拿開(kāi)過(guò)濾器F1-F3。在目前較好的技術(shù)方案中，在每個(gè)過(guò)濾器架上有一個(gè)0.22微米孔徑的90mm直徑的濾膜。這樣大小的濾膜足可通過(guò)-6℃下玻璃化的溶液(上鋪1.2微米濾膜一張粗的前置濾膜以防止阻塞)使之能成功地灌流兔腎臟。著眼于可操作性的標(biāo)準(zhǔn)離心是使用兩個(gè)平行的相同的過(guò)濾器。這可滿足人體器官對(duì)液流的需要，防止空氣不當(dāng)心地進(jìn)入動(dòng)脈液體是個(gè)安全的因子，和使靠近過(guò)濾器的壓力構(gòu)成最小。在灌流時(shí)這種連續(xù)的灌流液過(guò)濾器消毒和再消毒可作為后備措施在灌流時(shí)由于任何原因發(fā)生污染時(shí)可用預(yù)消毒溶液。(數(shù)百次灌流后腎臟的感染發(fā)生機(jī)會(huì)科直為0％。)一旦來(lái)自選擇貯器的液體流過(guò)合適的過(guò)濾器后，它經(jīng)過(guò)在熱交換器104中的某種初步溫度調(diào)節(jié)，然后到達(dá)盡可能接近器官的位置，在該點(diǎn)遇到了“T”型管連接器T1。液流被動(dòng)地經(jīng)過(guò)途徑L1(“折射計(jì)環(huán)”)，一后者將液流導(dǎo)向測(cè)量液體折射指數(shù)的流通過(guò)程控制折射計(jì)106，因此測(cè)得了低溫保護(hù)劑的濃度。借助于器官泵108使剩余的流體經(jīng)過(guò)器官環(huán)L2。用計(jì)算機(jī)控制器官泵速度盡管器官的血管阻力變化很大的保持所需的器官灌流壓。通過(guò)改變器官泵頭和流經(jīng)的管直徑，可產(chǎn)生寬范圍的流體足供成功地灌流各種大小的器官小到鼠心，大到人腎臟?；芈繁?02供給折射計(jì)環(huán)L1和器官環(huán)L2，它輸出的流速必須足夠大以超過(guò)所有時(shí)間通過(guò)器官的流體速度并保證足夠的流體到達(dá)折射計(jì)106和其它管線中用來(lái)測(cè)量灌流液的溫度、pH和其它所需參數(shù)的傳感器(一般標(biāo)為110)，保證準(zhǔn)確地測(cè)量。流體也應(yīng)當(dāng)足夠多使貯器濃度的改變和折射計(jì)環(huán)中傳感器測(cè)得的濃度和其它參數(shù)的變化之間的“無(wú)效時(shí)間”最小，也使貯器和器官之間的“無(wú)效時(shí)間”最小。由于需要防止液體以超過(guò)過(guò)濾的速度到達(dá)過(guò)濾器或管使液體未經(jīng)過(guò)濾而通過(guò)，以及由于對(duì)熱輸出的抑制和對(duì)回路泵管的磨損，回路泵的流體受到了限制。在實(shí)驗(yàn)中回路泵的速度一般不改變，因此不需要計(jì)算機(jī)控制，但計(jì)算機(jī)控制是可以任選的。灌流液流經(jīng)器官泵108后，再經(jīng)過(guò)第二熱交換器112以完成對(duì)灌流液溫度的調(diào)節(jié)。這通過(guò)用在熱交換器112和浴114、116之間的計(jì)算機(jī)控制的泵(未顯示)分別調(diào)節(jié)來(lái)自冷浴和溫浴114、116的流體來(lái)達(dá)到。計(jì)算機(jī)能改變通過(guò)冷途徑和溫途徑的流體以調(diào)節(jié)動(dòng)脈管中的灌流液溫度，因此也控制了器官流出液的溫度。動(dòng)脈和流出液溫度指示了真正器官溫度。通過(guò)控制冷浴和溫浴液體的流動(dòng)速度可不依賴于器官流量來(lái)獨(dú)立地調(diào)節(jié)器官溫度，倘若流量不接近于0。經(jīng)驗(yàn)顯示，用本發(fā)明的方法可使動(dòng)脈和靜脈的溫度至少冷到-6℃，可高到25℃。一般的冰柜冷卻不可替代用作零下溫度灌流的熱交換系統(tǒng)，因?yàn)楸窭鋮s到零下溫度時(shí)會(huì)使管線中較稀溶液結(jié)冰。器官容器裝上特定的夾套和芯加以冷卻特別有理論價(jià)值，可任選地包括于其中。經(jīng)溫度調(diào)節(jié)的灌流液然后除去氣泡，在防泡閥/混合器120中混合，再馬上進(jìn)入器官容器122。動(dòng)脈和靜脈溫度探頭在圖1A中一般標(biāo)為“T”，通過(guò)簡(jiǎn)單的孔穿入器官容器122的壁。壓力和任選地溫度在防泡閥中測(cè)量。雖然為了便于理解附圖中分開(kāi)畫出防泡閥和混合器120，但事實(shí)上防泡閥和混合器120是熱交換器112的組成部分，這樣在連續(xù)控制熱交換的同時(shí)完成了脫泡和混合。經(jīng)驗(yàn)顯示由于稀溶液和較濃、稠的溶液趨于分層，故混合很重要。下面揭示了熱交換器/防泡閥/混合器(HBM)的特定結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)。在正常情況下，從第二熱交換器112流出的冷卻液體用來(lái)冷卻經(jīng)過(guò)初級(jí)熱交換器104的灌流液。該經(jīng)冷卻的液體然后到達(dá)有電磁閥S1-S12的電磁閥支持組件118，這樣在回歸冷浴前從這些電磁閥中抽去廢熱。支持部件118現(xiàn)在由大塊鋁板構(gòu)成(但也可為金屬或塑料)，它帶有其直徑足以與被支持的電磁閥外徑相配的圓筒形孔。插入電磁閥使含液體的入口和出口的基部面對(duì)操作者，和電磁閥頭，電導(dǎo)線從頭進(jìn)入或通過(guò)了支持部件。電磁閥支持部件裝有內(nèi)部液體途徑以排除來(lái)自電磁閥的廢熱。支持部件上裝腳使位置固定以防止移動(dòng)，在支持部件從冰柜里取出時(shí)可保護(hù)液體的入口和出口。部件裝在冰柜中貯器的后方和上方，這樣電磁閥入口和出口以及它們與貯器的連接總是易見(jiàn)的。電磁閥較好的為3-7瓦特(或更少)活塞型3-通電磁閥，其最小的內(nèi)部液體容積，具有0.156英寸或更大的孔，Cv值≥0.16(如648T033型電磁閥，NeptuneResearch生產(chǎn)，Maplewood美國(guó)新澤西)，耐壓力直至500mmHg左右。本發(fā)明者目前優(yōu)選NeptuneResearch(上述)3瓦特電磁閥，用RC下落回路固定以減少操作后產(chǎn)生的熱量。因?yàn)橛糜诘蜏乇４娴娜芤河懈哒扯?經(jīng)過(guò)吸出S1-S3粘稠液體發(fā)生困難)，控制無(wú)效時(shí)間和灌流較大器官需要高流量，堵塞的可能性以及回路泵和S8-S12之間形成的壓力，所以有1/16英寸孔，和Cv值為0.01-0.03的電磁閥(如Valcor的20-2-3型電磁閥)不能完全令人滿意。下面詳細(xì)揭示了電磁閥操作的方式。下面更詳細(xì)地闡述了冰柜內(nèi)沒(méi)有夾在電磁閥支持部件上的電磁閥SR1、SR31和SR32。流出液分布部件(EDB)124(圖1A)與器官容器122的輸出面相連。EDB被設(shè)計(jì)成使少量流出液總是存在于部件的底部。該殘留的液體被兩通道“ΔR.I.泵”126抽出并送到差示折射計(jì)(“ΔR.I.計(jì)”)130，在此處其折射指數(shù)(用來(lái)測(cè)量濃度)與來(lái)自折射計(jì)環(huán)L1(以張靜脈流出樣品相同的速度泵出)的灌流液相比較，產(chǎn)生一個(gè)差示信號(hào)送達(dá)計(jì)算機(jī)。由于在折射計(jì)環(huán)L1中的液體接近于進(jìn)入器官動(dòng)脈的液體的濃度，ΔR.I.輸出是對(duì)穿越器官的動(dòng)脈-靜脈濃度梯度的估算。當(dāng)此梯度很大時(shí)(正方向或反方向)，器官遠(yuǎn)沒(méi)有平衡。當(dāng)梯度為0時(shí)，器官至少大半處于和灌流液的滲透平衡之中。對(duì)差示折射計(jì)非正統(tǒng)使用所得的非線性基線被儲(chǔ)存于軟件以運(yùn)行灌流程序。所有來(lái)自器官的流出液(和由ΔR.I.泵取樣的動(dòng)脈液體)最后由再循環(huán)泵128收集，并送達(dá)電磁閥S8，此閥控制流出液是否再循環(huán)到貯器中或棄置?；貧w貯器的流出液與流經(jīng)折射計(jì)環(huán)L1的液體在T連接T2處合并。如上所述，通過(guò)電磁閥S9-S12的啟閉來(lái)控制其回歸到正確的貯器內(nèi)。再循環(huán)泵128與回路泵102一樣不需要流量調(diào)節(jié)。它正常設(shè)置的速度足以超過(guò)經(jīng)過(guò)器官泵108的最大流量。由于再循環(huán)泵的輸出超過(guò)器官泵的輸出，空氣被連續(xù)引入通向電磁閥S8，并通常進(jìn)入貯器R1-R4。下面闡述防止由此引起的管道過(guò)量發(fā)泡的設(shè)備。雖然可改變?chǔ).I.泵速度，但它一般在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中保持恒定。在目前的操作方式中沒(méi)有計(jì)算機(jī)控制，但計(jì)算機(jī)控制可在某些情況下按需選擇。ΔR.I.泵使用極小直徑的聚乙烯管以減少液體運(yùn)行時(shí)間上的延遲。由于經(jīng)過(guò)ΔR.I.回路的流速被通過(guò)器官的最低流速(可能很小)限制，也被市售的差示折射計(jì)液流途徑的大小所限制，所以小的管子特別重要。差示折射計(jì)輸出后回到器官流出管接近于流出液的再循環(huán)泵。這樣的位置而不是遠(yuǎn)離泵的位置保證了流體穩(wěn)定地流過(guò)差示折射計(jì)，而遠(yuǎn)端的位置可由于較高的出口壓力阻止或改變差示折射計(jì)的流量。液體回路一個(gè)重要的部件是通過(guò)管道P1與回路相連的梯度泵132(圖1A)。梯度泵的功能是讓冰柜內(nèi)合適貯器中的濃度作梯度改變。達(dá)到這一點(diǎn)的方法如下述。管道P1放置在梯度泵的T3A位置，這正好在折射計(jì)環(huán)L1和器官環(huán)L2連接點(diǎn)的之后，這提供了一種選擇可保證除去器官流出再循環(huán)泵128引入的空氣，從而幫助減少了貯器液體中的泡沫。但是，較好的選擇也是目前使用的是在管道P1中不引入空氣。這可在點(diǎn)T3B處連接P1來(lái)作到，結(jié)果完全控制了濃度-時(shí)間關(guān)系曲線。通過(guò)將再循環(huán)泵128的速度持續(xù)調(diào)節(jié)到剛好稍超過(guò)器官泵108和ΔR.I.泵126合并流體的速度以便少量引入空氣，這樣可克服發(fā)泡的問(wèn)題。S8的再循環(huán)輸出與P1直接相連但不調(diào)節(jié)泵128的速度會(huì)使?jié)舛瓤刂撇涣迹恢档猛扑]。本發(fā)明的操作技術(shù)方案是在整個(gè)系統(tǒng)中使用1/8英寸直徑硅橡膠管，它足以接納所需的流體，為優(yōu)選的方案。硅橡膠與ActrilTM冷消毒劑(美國(guó)明尼蘇達(dá)州明尼阿波力斯Minntech公司)相配，為半透明的(這對(duì)看到流體以觀察問(wèn)題并觀察微生物生長(zhǎng)的任何跡象是重要的)，對(duì)于普通的諸如二甲亞砜的低溫保護(hù)劑是不可滲透的，并足夠軟到易于操作。但是，在與聚硅氧烷冷凍液接觸的回路中不可使用硅橡膠管，因?yàn)榫酃柩跬闀?huì)使硅橡膠管腫脹和變?nèi)?。另外，C-Flex管(ColePalmerInstrumentCo.生產(chǎn)，美國(guó)伊利諾斯，芝加哥)由于其冷卻時(shí)較大的強(qiáng)度(硅橡膠管會(huì)崩壞)和較大的彈性可用于泵頭部。貯器R1是梯度形成器(圖2)。梯度形成器由兩個(gè)同心圓筒構(gòu)成，外圓筒200和內(nèi)圓筒201。液體途徑205是讓液體在重力的影響下由于對(duì)內(nèi)圓筒體積下降的反應(yīng)而從外圓筒200流到內(nèi)圓筒201。液體室的同心室向很節(jié)省空間。液體輸送管道204相應(yīng)于圖1A中的管道D1。所顯示的單元是市售梯度形成器的改進(jìn)。用于本發(fā)明需作如下必不可少的改進(jìn)。1)夾持型兩通(開(kāi)/關(guān))電磁閥202(目前由Bio-ChemValveCorp.生產(chǎn)100P2WNC型，EastHanover美國(guó)新澤西)代替通常用來(lái)控制市售裝置中從外圓筒到內(nèi)圓筒流動(dòng)的旋塞閥(圖2C)。由于驅(qū)動(dòng)液流的壓力差很小，接著需要大的工作直徑的液流途徑202b，故夾持型閥比活塞型閥好。也由于當(dāng)貯器從冰柜中取出貯器進(jìn)行清洗時(shí)，可將電磁閥留下，它可便于從其管202b取下地顯得較為優(yōu)選。梯度形成器的基部在203處已作改進(jìn)以給電磁閥騰出空間，并由平臺(tái)對(duì)它進(jìn)行支撐。平臺(tái)203裝有一個(gè)垂直的金屬柱203b，電磁閥202與該柱用橡皮帶捆綁以保持電磁閥方向正確。電磁閥位于離貯器足夠的距離以避免貯器液體被過(guò)度加熱。2)來(lái)自外圓筒200到內(nèi)圓筒201的液體管道205的直徑已被擴(kuò)大使器官低溫保存所需的粘稠溶液以合適的速度流動(dòng)。內(nèi)徑為1/8-3/16英寸是合適的。3)帶有蓋子206(圖2B)。該蓋子有伸出物207，這可防止蓋子放在圓筒上以及井200和201固定其中的同心槽后從一面移向另一面。蓋子有內(nèi)置的具可除去蓋子的外部和內(nèi)部的填充漏斗208a和208b和再循環(huán)口209。4)漏斗208a和208b各自延伸形成內(nèi)部填充管210a和210b。內(nèi)部填充管較好的是剛性空心桿，位于內(nèi)和外圓筒的壁上，具有1-2厘米間隔的孔211a和211b，其孔徑約為3毫米。填充管的作用是減少再循環(huán)液體沖擊貯器中液體表面時(shí)產(chǎn)生的泡沫。孔的目的是保證來(lái)自管中的空氣從孔中逃逸，從而不會(huì)迫使空氣到達(dá)貯器的底部形成泡沫。這些功能對(duì)含蛋白質(zhì)的灌流液尤為重要，因?yàn)樗鼈冓呌诜€(wěn)定氣泡。5)已提供了填充標(biāo)記以保證貯器可重復(fù)地被填充到同樣的預(yù)定的體積。操作者可根據(jù)使用細(xì)節(jié)建立自己的填充標(biāo)記。梯度形成器可以有大致的刻度(在內(nèi)部和外部圓筒上都有并排的水平線，以避免在任何一個(gè)圓筒上讀出液體水平會(huì)產(chǎn)一視差錯(cuò)誤)，對(duì)于2升梯度形成器有約0.5厘米的間隔。對(duì)于存心使內(nèi)部和外部圓筒內(nèi)液體水平稍不相配的情況這些刻度也是重要的，這可防止密度方為不同的溶液，如沒(méi)有低溫保護(hù)劑的灌流液和玻璃化溶液的預(yù)先混合。這些刻度也可讓操作者在計(jì)算機(jī)屏幕上對(duì)梯度進(jìn)程作出粗略的定量檢查。6)市售的梯度形成器的塑料組成分對(duì)于某些推測(cè)會(huì)侵蝕塑料的低溫保護(hù)劑會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題。因此較好的是使用與低溫保護(hù)化學(xué)品相容的透明材料(如玻璃、有機(jī)玻璃等)制成貯器，或使用表面已聚硅氧烷化的貯器或處理過(guò)的貯器以防止侵蝕。根據(jù)本發(fā)明者的經(jīng)驗(yàn)，丙烯酸型是可接受的材料。7)貯器R1含有攪拌棒212。攪拌棒處于夾套213中，213與自由旋轉(zhuǎn)的垂直桿214連接，214從貯器的蓋子延伸到攪拌棒處來(lái)防止夾套和攪拌棒橫向運(yùn)動(dòng)。這樣的改變是必要的。這是為了使沒(méi)有灌流機(jī)時(shí)不會(huì)發(fā)生攪拌棒震顫，從而使混合不良。來(lái)自上部而不是下部的支撐可防止灌流液不必要地摩擦發(fā)熱并磨損貯器的底板。貯器R3也是梯度形成器構(gòu)造。貯器R3的細(xì)節(jié)如圖3所示。貯器R3含有外室315(R33)、內(nèi)室318(R31)和第三中間室316(R32)。中間室316與內(nèi)室318通過(guò)由電磁閥317(SR31)控制的液體通道320相連。中間室316也通過(guò)由電磁閥319(SR32)控制的液體通道321與外室319相連。當(dāng)濃度減少到0或接近0時(shí)，由于下面討論中提到的的梯度泵的功能和梯度形成器的作用，必須使用外室。與有較大體積液體的中間室(沒(méi)有外室)的情況相比，使用外室更為優(yōu)選，因?yàn)閱渭冊(cè)黾又虚g室的液體體積使因梯度泵132的恒定流速引起液體濃度圖形變?yōu)榉蔷€性。控制濃度-時(shí)間關(guān)系曲線會(huì)變得更復(fù)雜。更重要的是，在實(shí)際上排空內(nèi)室和中間室后，與外室所需的液體量相比，會(huì)要求中間室內(nèi)有過(guò)量的液體才能使回路中的濃度接近0。貯器R3的自動(dòng)化使用中的一些問(wèn)題部分通過(guò)軟件、部分通過(guò)R3特殊的結(jié)構(gòu)得以解決。特別是，電磁閥SR32讓外室(R33)液體首先流入中間室(R32)，然后從該室進(jìn)入內(nèi)部圓筒(R31)。這是因?yàn)楫?dāng)SR32作用時(shí)，R31和R32接近排空，此時(shí)存在于R33和R32之間的壓力頭很大。在該點(diǎn)，R33仍是滿的。若R33直接與R31相連，而不是在R33和R31之間用R32作為緩沖，這個(gè)大的壓力頭會(huì)使液體太迅速地流入R31。通過(guò)調(diào)節(jié)R33的水平，也可部分地控制流量。但盡管有這兩個(gè)小心措施，流量的進(jìn)一步控制也需要使用SR32的適當(dāng)?shù)墓ぷ鳡顟B(tài)循環(huán)。到達(dá)R31的流體首先磨碎慢，隨著濃度越來(lái)越接近于0而變得越來(lái)越快，而被動(dòng)的流體在重力的影響下總是開(kāi)始最快，到末端最慢，除非流體由某種特制的當(dāng)前正施加給SR32的循環(huán)度量。對(duì)R3的其它改進(jìn)類似于R1。貯器R4是以與R1相同的方式構(gòu)成的梯度形成器。梯度泵132的目的是從回路中取出一些再循環(huán)液體。這樣的取出液體導(dǎo)致流回原貯器的流本速度比從該貯器到回路中的流體速度小。這使貯器(R1、R3或R4)的內(nèi)部圓筒中的水平下降。內(nèi)部圓筒液體水平的下降接著導(dǎo)致外室或中間室的圓筒中的液體流向內(nèi)部圓筒以保持兩個(gè)水平相似。這樣兩個(gè)圓筒中的兩個(gè)不相同濃度的液體在內(nèi)部圓筒中混合，產(chǎn)生了濃度梯度，然后送到回路中的其余部分。這就是梯度泵造成到達(dá)器官和折射計(jì)的濃度的所需梯度改變的方式。計(jì)算機(jī)可對(duì)梯度泵速度作任何必須的調(diào)節(jié)。所涉及的原理是，普通線性梯度形成器的原理，其中回路外部到達(dá)梯度形成器的部分可粗略地看作內(nèi)部圓筒的額外體積。盡管存在著回路回路其余部分和液體再循環(huán)回到貯器，但以恒定速度從內(nèi)部圓筒中取出并棄掉液體引起了摩爾濃度隨時(shí)間的線性改變。但是，不象普通的梯度形成器，在梯度形成器中體積變?yōu)?的瞬間離開(kāi)梯度形成器的液體濃度不等于梯度形成器外部(或中間)圓筒中的液體濃度。因此，為了在用普通的兩室梯度形成器洗去低溫保護(hù)劑時(shí)使?jié)舛冉咏?，必須向外部圓筒加入附加的液體，同時(shí)從內(nèi)部圓筒內(nèi)連續(xù)棄掉液體。這是R3修改成有第三室的原因。需要持續(xù)洗去的額外液體通過(guò)計(jì)算機(jī)比操作人用手能更精確地從第三室中加入。另一方面，在加入低溫保護(hù)劑時(shí)，通過(guò)在外室使用明顯超過(guò)梯度末端回路中的所需的最終濃度，總能達(dá)到到所需的最終濃度。由于目前的方法涉及濃度逐步向上改變(參見(jiàn)下面)，方便的是用與R2中所用的相同液體填充R1的外室。圖4A-E顯示了HBM熱交換系統(tǒng)的細(xì)節(jié)。灌流液通過(guò)入口403進(jìn)入HBM，經(jīng)過(guò)中央通道400，并通過(guò)出口406離開(kāi)HBM。中央灌流途徑的兩面是用來(lái)調(diào)節(jié)溫度的獨(dú)立的室。兩個(gè)最里面的溫度控制室401(在灌流途徑的每個(gè)面上)用于冷卻劑的循環(huán)，而外室402是抵銷冷卻劑的室溫流液的通道。(對(duì)于特定的實(shí)施，例如，常溫(normothermic)灌流，這些途徑可被翻轉(zhuǎn)。)冷液體流的方向是任意的。當(dāng)所有的液體(灌流液、冷卻劑和溫?zé)嵋后w)以相同的方向(向上)流動(dòng)時(shí)，盡管缺少逆流的熱交換，卻發(fā)現(xiàn)了合適的溫度控制。該模式可避免在外室中有空氣或二氧化碳的積聚。灌流液通過(guò)入口403進(jìn)入HBM單元的底部，并以鋸齒方式上升。它并入在上方有空氣空間的小上部貯器這是防泡閥區(qū)域404。然后灌流液在防泡閥下運(yùn)行，并經(jīng)過(guò)灌流液混合區(qū)域405最終到達(dá)動(dòng)脈出口處。用作冷液體和熱液體的入口407和408在單元的基部各分成兩個(gè)通道。熱液體和冷液體的出口410和411各自接受來(lái)自有相同種類液體通道(即各冷通道或各熱通道)的液體，通道的長(zhǎng)度相同，從開(kāi)始到結(jié)束經(jīng)受的壓力差相同，這樣通過(guò)每個(gè)相同的通道的流速應(yīng)該大致相等。所有的冷和熱液體途徑包括在單元的后部的長(zhǎng)彈性管412。這些管段有兩個(gè)作用。第一通過(guò)在四個(gè)通道之間引入空氣間隙使彼此的熱交換最小，這在當(dāng)所有冷和熱液體以與灌流液流向反方向(即以垂直的方向)流動(dòng)，且與灌流液沒(méi)有進(jìn)行熱交換時(shí)尤為需要。第二，每個(gè)管可被夾住。用該方法若偶然一個(gè)冷通道或一個(gè)熱通道應(yīng)當(dāng)接受所有輸送的冷液體或熱液體，而其它通道處于“空氣鎖定”，這種狀態(tài)可這樣改正夾住收集所有流體的通道并擠出不工作通道中的空氣使每個(gè)通道處于完全工作和相等流量的狀態(tài)。由于溫度調(diào)節(jié)的液體以垂直的方式由頂部灌注單元的熱交換部分，在底部出去，安裝時(shí)必須開(kāi)動(dòng)冷和熱泵使之以回退的方式運(yùn)行以除去冷通道和熱通道中的空氣。若通向和來(lái)自浴的冷管和熱管的內(nèi)徑不大于1/8英寸時(shí)這一點(diǎn)能最好地做到，因?yàn)檫@樣的直徑能使液流體代替來(lái)自管中的空氣而不是讓它以與液體流動(dòng)方向相反的方向向上流動(dòng)，或殘留在管的各部分未除清。這樣，當(dāng)泵方向再?gòu)幕赝耸阶優(yōu)楣P直式時(shí)，管中沒(méi)有空氣，在單的的熱交換室內(nèi)也沒(méi)有。為了實(shí)施熱交換功能，也設(shè)計(jì)了鋸齒方式迫使前述灌流的濃灌流液進(jìn)行混合，或當(dāng)灌流液密度上升而不是下降時(shí)，清洗來(lái)自灌流途徑的較稀的灌流液。當(dāng)灌流液從鋸齒型熱交換區(qū)域出現(xiàn)后，它在閥進(jìn)入?yún)^(qū)418進(jìn)入防泡閥404。灌流液通過(guò)出口區(qū)419從防泡閥出去。事實(shí)上，鋸齒方式也可讓任何空氣泡從熱交換區(qū)域中出來(lái)并進(jìn)入防泡區(qū)。防泡閥有下列特征。1.它的體積足夠大，可通過(guò)在相對(duì)大的空氣體積上分散每次沖程的震蕩將灌流泵的跳動(dòng)作用減少到最小。這簡(jiǎn)化了壓力控制和測(cè)量，并可減少對(duì)器官的損傷。2.它的體積足夠低以使閥中存在的液體體積最小，從而使器官泵和器官本身之間的無(wú)效時(shí)間和無(wú)效體積最小。也需要最小體積使較稀的灌流液在濃灌流液上的分層最少。3.提供了壓力傳感口413。口413沒(méi)有與灌流液相連的液體，這樣消除了“死胡同”，其中液體不能正確地混合，或其中消毒劑不能滲透或被截留。使用電子壓力變頻器(給計(jì)算機(jī)提供信號(hào))和血壓計(jì)(進(jìn)行校正和肉眼檢查)。4.閥的蓋子414可除去以供清洗。5.通風(fēng)口416用來(lái)調(diào)節(jié)閥中的液體水平，從而使防泡閥發(fā)揮作用所需的水平最低，壓力被動(dòng)阻尼最大。來(lái)自該開(kāi)口的管通到冰柜外，這樣可以不打開(kāi)冰柜的門進(jìn)行調(diào)節(jié)。6.第三口417穿透防泡閥的蓋子以便可注入藥品、血管的標(biāo)記物質(zhì)、固定劑等。7.防泡閥的壁與閥靠近進(jìn)口和出口點(diǎn)418、419分別成一定的角度以便在灌流液進(jìn)入和離開(kāi)閥時(shí)進(jìn)行一定量的混合，并打破分層，使較稀的灌流液在濃灌流液上的分層最少。8.有引入探頭的選擇，如通過(guò)閥蓋子中的一個(gè)口引入的溫度探頭可測(cè)量灌流液而無(wú)需傳感器的永久性埋入所述的口由附于塑料螺紋接口的彈性管構(gòu)成。探頭可自由地進(jìn)入或抽出，用止血夾或相當(dāng)?shù)膴A子夾住管以壓緊封閉。這在HBM需要清潔時(shí)可簡(jiǎn)單地取出并再安裝，也可靈活地選擇探頭并能使用探頭在其它地方進(jìn)行測(cè)量。灌流液離開(kāi)防泡閥后，下降到混合區(qū)域405(參見(jiàn)圖4D)。3-單位混合途徑的基本單位是狹窄的水平進(jìn)入?yún)^(qū)HE，合并進(jìn)“寬的”基部區(qū)BA，它再上升到流量限制區(qū)FR，結(jié)束在下降的D處結(jié)束，到達(dá)下一個(gè)水平進(jìn)入?yún)^(qū)。進(jìn)入HE的液體被驅(qū)動(dòng)通過(guò)開(kāi)口，該開(kāi)口太小不能支撐太多的高密度液體上的低密度液體的分層，特別是考慮在HE前有直角轉(zhuǎn)彎。進(jìn)入BA的液體若較稀，可馬上上升向FR，若較濃，則進(jìn)入壁中并沿壁上升。但是遇到FR時(shí)，較濃的液體會(huì)向著直接從HE上升的較稀液體被加速，產(chǎn)生攪動(dòng)和混合。若BA填充了濃灌流液，F(xiàn)R處直接向上流動(dòng)的液體的速度會(huì)再使?jié)獾囊后w與FR上方任何分層的低密度液體混合。此外，狹窄的下降途徑D將分層液體和較濃液體一道拉向轉(zhuǎn)角，再度防止了長(zhǎng)時(shí)間存在的停滯的分層。實(shí)際上，圖4B所顯示的排成一行的三個(gè)這樣的混合單位足以混合最初混合很差的灌流液，這在低溫保護(hù)劑濃度突然上升或突然下降時(shí)常常遇到?；旌蠁挝坏淖詈笞饔檬亲鳛槟撤N原因沒(méi)有在防泡閥區(qū)除去的任何小泡的防止閥，(但是，混合區(qū)域的泡在器官灌流前可由操作者很容易地除去。)灌流液離開(kāi)混合區(qū)后，下降到直接通往器官的出口406。來(lái)自最終混合單位到口406的途徑與水平成一角度以提供防止任何氣泡進(jìn)入器官的最后一個(gè)機(jī)會(huì)，因?yàn)樵谠撏緩街械竭_(dá)器官的氣泡必須向下流動(dòng)和它的向上流動(dòng)趨勢(shì)相反。通過(guò)堵塞固定于帶有通風(fēng)開(kāi)口406的出口管直至在防泡閥中有約1/2英寸液體積聚，可排凈混合區(qū)和接下來(lái)區(qū)域的空氣。然后關(guān)閉通風(fēng)使壓力升達(dá)60-120mmHg。最后，讓液體再依次自由通過(guò)口406。液體噴發(fā)經(jīng)混合區(qū)和出口406清除了從防泡閥到口406液體途徑中。若一些空氣殘留著，可重復(fù)該過(guò)程來(lái)除去所述的空氣。在空氣已排除后打開(kāi)通風(fēng)口，在重力的作用下讓防泡閥中不必要的液體從閥出去，達(dá)到了最終約1/8英寸的深度。在排除了管道中的空氣以前不可使最終的深度達(dá)1/8英寸，因?yàn)樵谂懦^(guò)程中不充足的體積會(huì)避免混合區(qū)被來(lái)自防泡閥的空氣再填充。需要拆下HBM以供非頻繁的清掃。消毒和從防泡閥區(qū)除去消毒劑可自動(dòng)地進(jìn)行，但目前要求操作者小心以保證所有最上部的暴露表面被消毒，并最終洗去消毒劑而不污染出口管。413、416和417處出口管的排列使與之連接的專門的電磁閥可個(gè)別地用水、消毒劑和空氣自動(dòng)控制地清洗，這樣使操作者無(wú)需費(fèi)力地清洗防泡閥。灌流液通過(guò)口406從HBM出去后進(jìn)入了器官容器122中的器官(圖1)。在較好的技術(shù)方案中，器官容器包括一矩形盒子，它帶有鉸鏈蓋子、蓋子門閂、蓋子拉手、斜面底(特別是斜面底座)、動(dòng)脈和靜脈熱電偶入口、灌流液入口和入口對(duì)面的底座上的流出口。底部斜度是右到左、后向前都向下方向，以保證所有流經(jīng)底座的液體都除去，幾乎沒(méi)有液體積聚于容器中任何地方。一個(gè)針狀探頭直接插入動(dòng)脈管道的壁。第二個(gè)探頭放在直接從器官流出的液體中。在典型的結(jié)果中，動(dòng)脈和靜脈溫度差只有十分之一度，但兩者都用于質(zhì)量控制。器官容器可使用相似于MOX-100DCMTM器官盒子(WatersInstrumentsInc.生產(chǎn)，Rochester美國(guó)明尼蘇打州)使用的軟篩網(wǎng)進(jìn)行支持，或器官可直接放在器官容器的底部，或放在特別設(shè)計(jì)的可除去的支持物上。后者較好，為目前所用。器官容器122和器官泵108被盡可能近地放置以減少兩者之間的無(wú)效時(shí)間和無(wú)效體積，為了同樣的原因選擇從器官泵通向器官容器的管內(nèi)徑盡可能地小。如上所述大多數(shù)灌流液不經(jīng)過(guò)器官環(huán)L2，而是從過(guò)濾器到達(dá)管線中的折射計(jì)106。本發(fā)明較好的技術(shù)方案使用了改進(jìn)的市售折射計(jì)(AnaconInc.生產(chǎn)BurlingtonMars)。特別是，使用小直徑管的入口和出口而不是很大的標(biāo)準(zhǔn)Anacon管接口。適用于本發(fā)明的折射計(jì)自動(dòng)監(jiān)測(cè)頭的改進(jìn)也可包括對(duì)一般買到的Anacon單位的下列另外的改變1.液體途徑的內(nèi)部體積可被進(jìn)一步變得最小。2.目前，需要用慢流速的氮?dú)庀礈靻挝坏目諝饪臻g以防止由于冰柜里的低溫和高濕度而冷凝的潮氣。在改進(jìn)情況下，自動(dòng)監(jiān)測(cè)裝置的電子區(qū)域可密封起來(lái)里面加有干燥劑以取消對(duì)氮?dú)庀礈斓男枨蟆?.本單位必須用垂直向上的液流方向定向。但是，該單位沒(méi)有取這類定向，可對(duì)體形作出改變以使單位形狀適合該定向。本發(fā)明允許操作者以任何順序接近貯器和按規(guī)格規(guī)劃此過(guò)程，這可能有意義。操作者甚至可自由地根據(jù)他的愿望來(lái)開(kāi)關(guān)電磁形狀。不論怎樣，下列舉例說(shuō)明的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用來(lái)揭示輸送來(lái)自和到達(dá)每個(gè)貯器和過(guò)濾器的液體需要的操縱方式。也演示了系統(tǒng)設(shè)計(jì)來(lái)主要進(jìn)行的器官低溫保護(hù)劑灌流和清掃系統(tǒng)的“標(biāo)準(zhǔn)方案”。電磁閥S1關(guān)閉時(shí)接納來(lái)自R1的液體，作用時(shí)接納來(lái)自R2的液體。電磁閥不通電時(shí)對(duì)R3開(kāi)啟，通電時(shí)對(duì)R4開(kāi)啟。S1和S2向S3輸出，當(dāng)S3處于休息的狀態(tài)，它接受來(lái)自S1(即來(lái)自R1或R2)的液體，作用時(shí)接受來(lái)自S2(即來(lái)自R3或R4)的液體。S3(總是開(kāi)著)的共同出口通向回路泵102，然后從電磁代的貯器中抽出液體。若包括了差示過(guò)濾器，則回路泵102貯器中是到S4’的共同出口(總是開(kāi)著)。當(dāng)S4不通電時(shí)其出口沖著過(guò)濾器F1。從過(guò)濾器F1回歸到S5正常的開(kāi)口并通過(guò)S5共同的出口到達(dá)折射計(jì)環(huán)L1和器官回路L2。另一方面，S4通電時(shí)，其輸出對(duì)著S6普通入口。當(dāng)S6處于休息狀態(tài)，其輸出對(duì)著過(guò)濾器F2，并從過(guò)濾器F2通過(guò)其正常的開(kāi)口進(jìn)入S7。來(lái)自S7的輸出液到達(dá)S5正常關(guān)閉的口，S5必須在通電時(shí)才開(kāi)始接受該輸出環(huán)。一旦液體進(jìn)入S5，它流出S5普通的出口，到達(dá)折射計(jì)環(huán)和器官環(huán)。最后，若S4電磁閥，S6也電磁閥，液體將通過(guò)這二個(gè)閥到達(dá)過(guò)濾器F3。通過(guò)通電的S7和通電的S5電磁閥使來(lái)自過(guò)濾器F3的液體回歸，并走向如上的兩個(gè)環(huán)L1和L2。如早先所述，當(dāng)需要自一種溶液向另一種溶液突然改變時(shí)，或當(dāng)必須除去重顆粒污染物時(shí)，可任意地選用過(guò)濾器F2和F3，因此也在S4、S5、S6和S7。來(lái)自器官的流出液再回歸S8。若S8開(kāi)啟，則棄去液體。若S8沒(méi)有開(kāi)啟，來(lái)自S8的液體與來(lái)自折射計(jì)環(huán)的液體合并，并回歸到所需的貯器。經(jīng)過(guò)折射計(jì)環(huán)的液體依次流經(jīng)電磁閥S9、S10、S11和S12，若這些電磁閥都沒(méi)有通電，則進(jìn)入廢物管道。S9的通電使流體分流到R1再循環(huán)管道。S10的開(kāi)啟(S9不開(kāi))使液體分流到R2。相似的是，S11或S12選擇性的開(kāi)啟分別使液體再循環(huán)到R3或R4。電磁閥操縱來(lái)控制液體有兩個(gè)基本過(guò)程，一個(gè)是用于真正的灌流，另一個(gè)用于清掃和充填系統(tǒng)。灌流方法典型的是從R1到R4，而充填必須以相反的順序讓液體充入貯器R2-R4的液體攝取和液體再循環(huán)管道，特別是若使用了過(guò)濾器F2和F3以及相關(guān)的管道，會(huì)在裝填(清潔)過(guò)程的末尾讓來(lái)自R1(典型地)(或C1)液體裝填了回路。裝填(或清潔)整個(gè)系統(tǒng)的開(kāi)啟的典型順序下面以表格形式列出。標(biāo)準(zhǔn)化的淋洗/裝填的電磁閥控制順序表1和2列出了電磁閥控制過(guò)程。這些控制電磁閥用于在過(guò)程的末尾用濾膜除菌H2O代替灌流液；在灌流之間用化學(xué)消毒劑代替清洗用的H2O；用濾膜除菌H2O除去消毒劑；用空氣除去水；用貯器液體除去空氣，即裝填系統(tǒng)。當(dāng)只存在F1(沒(méi)有F2或F3)時(shí)，裝填(和清洗)可在任何順序的貯器內(nèi)進(jìn)行，條件是裝填時(shí)，最后的貯器與用于后來(lái)灌流的第一貯器相當(dāng)。申請(qǐng)人現(xiàn)用暫時(shí)從R2，然后是從R3、然后R4然后R1吸出的方法，以足夠的時(shí)間分別裝填U2、U3、U4和U1，然后通過(guò)計(jì)算機(jī)/使用者出的方法S12、S11、S10和S9，用退回式注射器經(jīng)P1用于裝填RL8、RL7、RL6和RL5，因?yàn)榇朔椒晒?jié)約大量灌流液，且很快。用于從R1-R4抽出液體和讓正常灌流液產(chǎn)生梯度的電磁閥操縱的標(biāo)準(zhǔn)方法如下(假設(shè)(1)使用了任選的過(guò)濾器F2和F3，(2)直接或典型地使用控制梯度的電磁閥，和(3)有如R2的梯度形成器存在)。從一個(gè)貯器到另一個(gè)貯器的封閉回路的分階段的完成以可避免不需要的組分的再循環(huán)溶液，在其組份替代來(lái)自回路的前面溶液之前進(jìn)入新的貯器。若前面的溶液可再循環(huán)使用，這一延誤再循環(huán)的小心措施就可以放棄。表1*若對(duì)貯器液體進(jìn)行上述順序，S0和SS00將是關(guān)閉的。若對(duì)水進(jìn)行上述順序，S0和S00也是關(guān)閉的，清掃口C1-C4與攝取管道U1-U4連接。若對(duì)消毒劑進(jìn)行上述順序，S0是關(guān)閉的，S00是開(kāi)啟的。若對(duì)空氣進(jìn)行上述順序，S0是開(kāi)啟的，S00是關(guān)閉的。**S13(任選地還有S14和S15)、過(guò)濾器通風(fēng)電磁閥在該步驟是開(kāi)啟的，對(duì)于該步驟的其余部分是關(guān)閉的它只是開(kāi)啟讓來(lái)自管道的空氣足以清洗的時(shí)間(在步驟1通常為60秒，對(duì)于使用**記號(hào)的其余步驟為30秒)。若系統(tǒng)中沒(méi)有過(guò)濾器，則可以設(shè)計(jì)程序成不發(fā)生這些事件。***當(dāng)裝填系統(tǒng)時(shí)可省去該步驟。注對(duì)于步驟2、4、5、8和9，水控制電磁閥S16是開(kāi)啟的(水管打開(kāi)以便將液體棄置到廢物中)，但對(duì)于所有其它的步驟，它是關(guān)閉的。表2標(biāo)準(zhǔn)灌流的電磁閥控制順序*對(duì)于正常的灌流，電磁閥S0、S00和S13-S13總是不被操縱的。**該步驟防止來(lái)自前貯器的液體污染前面平衡的(新的)過(guò)濾器，所述的液體存在于新貯器和已經(jīng)用來(lái)自新貯器的液體平衡的過(guò)濾器之間的管道內(nèi)。***如討論中指出的，SR32操縱最初必須遵守循環(huán)的工作狀態(tài)，在SR32長(zhǎng)久的開(kāi)啟下直至R3使用結(jié)束。循環(huán)的工作狀態(tài)涉及在電磁閥方式12和3，之間按照循環(huán)的需要向后和向前撥動(dòng)?！俨襟E7是任選的。貯器的數(shù)量相應(yīng)于電磁閥數(shù)的改變，可少于或多于這里的具體數(shù)。此外，R1-R4的層數(shù)不必遵從上述說(shuō)明。限定是最少有一個(gè)貯器，最多或許有8個(gè)貯器，其中任何貯器可有1-4個(gè)室。其上限部分是基于體積和擁擠限制，部分是基于復(fù)雜到足以能使控制多于8個(gè)貯器成為不可能。另一個(gè)變動(dòng)是在不同的位置使用不同容量的貯器(如，與這里的較好技術(shù)方案不同，一個(gè)可有2升貯器，接著是一個(gè)1升的貯器，接著是一個(gè)3升的貯器，接著是一個(gè)1升的貯器，等等)。原則上，由于多個(gè)貯器可由4到20個(gè)同軸的圓筒構(gòu)成，每個(gè)由電磁閥或由溫度控制區(qū)域外的手動(dòng)桿來(lái)開(kāi)啟，由一個(gè)中央攪拌臺(tái)進(jìn)行所有的攪拌，故已放棄了對(duì)單個(gè)貯器的使用。若逐步改變不是通過(guò)被攪拌的中央?yún)^(qū)域輸送的，濃度突然或按步驟的改變?nèi)允潜惶峁┑摹Ｒ部筛淖冑A器的相對(duì)位置。最后，也可用液體計(jì)量系統(tǒng)而不是梯度形成器。在該系統(tǒng)中，泵向混合貯器輸送濃的低溫保護(hù)劑或稀釋液體而不是依賴于重力作用。這個(gè)泵可用計(jì)算機(jī)操作以調(diào)節(jié)背離程序規(guī)定的濃度。但是保留梯度泵以控制總的回路體積。動(dòng)脈濃度傳感器可鄰近于，而不是遠(yuǎn)離回路中的器官環(huán)的起端，但不應(yīng)當(dāng)鄰近于過(guò)濾器。壓力傳感器自動(dòng)監(jiān)測(cè)過(guò)濾器的回路泵面的壓力，可加入做為一個(gè)警告裝置。更一般的是，裝置可分成兩個(gè)裝置，第一個(gè)用來(lái)制備用作低溫保存的器官，第二用來(lái)制備先前低溫保存過(guò)的，供移植的器官。第一裝置可省去R3和R4(和有關(guān)的電磁形狀)而第二裝置可省去R1和R2(和有關(guān)的電磁形狀)，其它的可基本相同的成一體的裝置。若低溫保存和低溫保存的恢復(fù)可在不同地點(diǎn)和在不同入指導(dǎo)下進(jìn)行，實(shí)用時(shí)這種變動(dòng)可能有用處。必要的是除了使用不同的軟件和使用用于加入和除去低溫保護(hù)劑的不同的貯器外，這兩個(gè)裝置應(yīng)當(dāng)是相同的。另一個(gè)用途涉及只有兩個(gè)貯器進(jìn)行裝載和卸載的異常使用；例如，若只使用了R3的內(nèi)室(R3代替R2)，可用R1和R3進(jìn)行裝載，若R1代替R4，可用R1和R3進(jìn)行卸載。II.方法的說(shuō)明A.制備用于低溫保存的器官和接著移植入動(dòng)物體的方法用上述裝置進(jìn)行的整個(gè)低溫保存方法包括幾個(gè)部分。一個(gè)部分是在器官?gòu)膭?dòng)物體內(nèi)取出制備低溫保存的器官前對(duì)供體動(dòng)物和/或器官進(jìn)行預(yù)處理。另一個(gè)部分是選擇低溫保護(hù)劑。再一個(gè)部分是在低溫保存前制定給器官灌流低溫保護(hù)劑的實(shí)際方案。再一個(gè)部分是用非本發(fā)明部分的適當(dāng)技術(shù)對(duì)器官進(jìn)行低溫保存、儲(chǔ)存和溫?zé)帷１景l(fā)明再一個(gè)部分是在制備移植入接受體的器官時(shí)，器官溫?zé)岷髲闹谐サ蜏乇Ｗo(hù)劑的方案。另一個(gè)部分是在器官移植時(shí)對(duì)器官和接受體進(jìn)行處理。1.對(duì)供體和體內(nèi)的供給器官的預(yù)處理除了其它標(biāo)準(zhǔn)處理外，在獲得器官前10-20分鐘讓供體接受iloprost(BerlexLaboratories，Inc.，美國(guó)新澤西)輸液，它是一個(gè)較長(zhǎng)效的環(huán)前列腺素(PGI2)類似物或相似試劑。申請(qǐng)人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)靜脈輸液進(jìn)入全身循環(huán)或直接進(jìn)行腎動(dòng)脈給藥后可有效地減少接著使用的低溫保護(hù)劑的毒性。用任一途徑給藥，但的最好劑量約是25微克/kg，雖然目前直接的動(dòng)脈內(nèi)輸液是目前推薦的，使大多數(shù)器官接觸試劑，但同時(shí)使iloprost介導(dǎo)的系統(tǒng)性減到最低。15微克/kg也是有效的，但不如25微克/kg有效。，根據(jù)物種、器官、輸液速度、輸液持續(xù)時(shí)間等，本申請(qǐng)對(duì)iloprost濃度認(rèn)可的范圍是5-75微克/kg。典型地是在20分鐘內(nèi)進(jìn)行iloprost輸液；對(duì)尸體器官供體輸注，認(rèn)可的輸注持續(xù)時(shí)間是1-60分鐘。當(dāng)血壓過(guò)低是限制因素時(shí)，可用相對(duì)低濃度的iloprost在相對(duì)長(zhǎng)時(shí)間(20-60分鐘)內(nèi)進(jìn)行輸注。雖然不希望與任何特定的理論相聯(lián)系，iloprost的保護(hù)作用可能不是直接的低溫保護(hù)效應(yīng)。iloprost對(duì)低溫保護(hù)劑誘發(fā)損傷的腎臟切片無(wú)保護(hù)效應(yīng)表明iloprost可能只像高效的血管舒張劑起作用，促使低溫保護(hù)劑均勻分布。因此，其它的血管舒張劑，如乙酰膽堿、硝普鹽、氧化氮、高滲的和/或高膨脹壓的洗液等以足以使器官產(chǎn)生血管舒張的劑量可以代替iloprost。為了得到最佳的結(jié)果，一個(gè)重要的選擇是用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)對(duì)器官進(jìn)行預(yù)處理，在過(guò)冷前約24小時(shí)以10ng/ml濃度向培養(yǎng)基中加入TGFβ1時(shí)，可在用52％(w/v)低溫保護(hù)劑過(guò)冷時(shí)防止試管內(nèi)培養(yǎng)的上皮細(xì)胞從它們基底上分離下來(lái)。最好的應(yīng)用模式是在器官經(jīng)過(guò)或沒(méi)有經(jīng)過(guò)另外的注射前2-4小時(shí)進(jìn)行濃藥團(tuán)式注射0.1-10微克/kg的TGFβ1。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，在捐獻(xiàn)器官被保護(hù)的前3、6和20小時(shí)，按每kg人體重給予0.5微克量的TGFβ1，兔腎用8M低溫保護(hù)劑處理40-50分鐘，這樣可防止預(yù)期由于所述的處理導(dǎo)致的出血，可使動(dòng)物(處理50分鐘)存活到損獻(xiàn)時(shí)處理后15天時(shí)。在體內(nèi)預(yù)處理后，所需的器官用冷的EuroCollins溶液、修改的UW溶液或相對(duì)有效的溶液原位沖洗用避免在多個(gè)器官內(nèi)發(fā)生摩擦的方法。這些溶液的組分如表3所示(若對(duì)于心臟用常溫保存技術(shù)代替低溫保存，心臟是用溫?zé)岫皇抢淙芤簺_洗)。沖洗溶液最初含iloprost(在最好的模式中為1微克/毫升，認(rèn)可的iloprost的濃度范圍是0-10微克/毫升)、抗凝劑(如肝素，在本技術(shù)方案中為10,000單位/升，可接受的肝素濃度為500-20,000單位/升)、血管舒張劑(如罌粟堿，最好為40-90毫克/升，認(rèn)可的范圍為0-90毫克/升)和其它所需的試劑。第二種洗滌溶液用來(lái)洗去所有的如冷凍劑的試劑，并完全洗去血液。切下的器官(除了諸如心臟最好用常溫灌流保持外)應(yīng)當(dāng)被轉(zhuǎn)移到冰冷浴的洗滌溶液中，并轉(zhuǎn)運(yùn)到能以所述的方式引入和除去低溫保護(hù)劑的灌流機(jī)上。表3灌流液組成<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="696">Euro-Collins*化合物mMg/升右旋糖19434.96KH2PO4152.06K2HPO4427.40KCl151.12NaHCO3100.84</table></tables>*pH＝7.4**毫滲透性＝350-365毫滲克分子<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="764">RPS-2化合物mMg/升右旋糖18032.43KH2PO47.21.25KCl28.22.11NaHCO3100.84谷胱甘肽51.53腺嘌呤HCl10.17CaCl210.111MgCl220.407</table></tables>(注RPS-2*溶液是沒(méi)有CaCl2也沒(méi)有MgCl2的RPS-2溶液)表3(續(xù))</tables>(注改進(jìn)的UW溶液#2不含HES，但比改進(jìn)的UW溶液#1含更多的葡萄糖)2.低溫保護(hù)劑玻璃化溶液V49、V52、V55、V49B和V55B的配方所有的灌流實(shí)驗(yàn)用稱為V49、V52和V55的溶液進(jìn)行(V49有時(shí)被稱為VS4，V55稱為VS41A)。低的冷卻速度(5-10℃/分鐘)時(shí)，V49在水壓1,000大氣壓下玻璃化，但常壓下不玻璃化。V52在500大氣壓的壓力下玻璃化。V55在1大氣壓下玻璃化。V49由二甲亞砜(D)、甲酰胺(F)和1，2-丙二醇(P)構(gòu)成，其中D與F的摩爾比為1∶1，每升的D+F+P的總質(zhì)量為490克，每升P的總質(zhì)量為150克。這樣，每升D+F＝340克，F(xiàn)＝124.33克，D＝215.67克。根據(jù)下面的結(jié)果，這個(gè)低溫保護(hù)劑的混合物是優(yōu)選的。D、F和P比例的可認(rèn)可范圍為，DF重量比可低達(dá)1.4，高達(dá)3.5；對(duì)于前者，通過(guò)另外加入P，P∶(D+F)的比例應(yīng)升高到18∶34和/或總濃度升到50-51％w/v(克/分升)。通過(guò)使V49的低溫保護(hù)劑含量乘以52/49，同時(shí)保持載體溶液與V49相同而獲得V52的配方。通過(guò)使V49的低溫保護(hù)劑含量乘以55/49，含量載體溶液與V49相同可得到V55的配方。這樣，相對(duì)于V49中溶質(zhì)濃度為490克/升，V55中溶質(zhì)的總濃度是550克/升。V49B是V49的變化形式，其中1，2-丙二醇被同樣克數(shù)的2，3-丁二醇取代(左旋體形式或外消旋混合物，有低于5％w/w中間形式存在)，相似的是，V55B是V55的變化形式，其中2，3-丁二醇代替了同樣克數(shù)的1，2-丙二醇。V49、V52和V55的總低溫保護(hù)劑摩爾濃度分別為7.49，7.95和8.41M。由于丁二醇比丙二醇的分子量更大，V49B和V55B的摩爾濃度稍低于V49和V55。雖然不刻意地與理論相聯(lián)系，V49和V55尤為良好，由于甲酰胺能很好地滲透進(jìn)腎臟組織，以及二甲亞砜能減輕甲酰胺毒性，三種要素(最大的玻璃化，而同時(shí)毒性和總的溶質(zhì)濃度最小)之間的良好平衡，缺少膠體(約4-7％(w/v)典型的膠體濃度升高粘度)，在適當(dāng)壓力(分別為1,000大氣壓和1大氣壓)下這些溶液去玻璃化的速度極慢，以及在至少6個(gè)月儲(chǔ)存時(shí)于-135℃下V55有良好的穩(wěn)定性。用于器官灌流的低溫保護(hù)劑根據(jù)器官受到的壓力在V49和V55的范圍之間調(diào)節(jié)。器官對(duì)高壓的耐受力和對(duì)高濃度低溫保護(hù)劑的耐受力的平衡可使保持玻璃化所需的壓力和濃度間的協(xié)調(diào)最優(yōu)化。例如，不可耐受1,000大氣壓，但可耐受500大氣壓的一個(gè)器官可用V52灌流。當(dāng)冷凍時(shí)不均勻的晶核作用是一個(gè)顯著問(wèn)題時(shí)，可使用超過(guò)550克/升最高約600克/升的濃度，因?yàn)槌珊诉^(guò)程和任何有核的冰晶增長(zhǎng)在這些較高的濃度下受到抑制。一個(gè)發(fā)生問(wèn)題的例子是，在使如人體肝臟那樣玻璃化非常大的器官，冷凍必須特別慢地進(jìn)行。在升高的壓力下，隨著冷凍速度的降低，要求溶質(zhì)濃度作相似比例的增加。腎臟切片實(shí)驗(yàn)(參見(jiàn)下面的結(jié)果)表明，V49B保證的成活力與用V49的存活率相同。V49B的穩(wěn)定性比V49大?？筛鶕?jù)上述對(duì)V49和V55的揭示，V49B和V55B之間的變化是被采用的。所有的低溫保護(hù)劑溶液除了低溫保護(hù)劑本身外，必須含有慢滲透溶質(zhì)，后者組成低溫保護(hù)劑的“載體”溶液。典型的例子是修改的UW溶液、EuroCollins溶液或腎保存溶液2(RPS-2)(參見(jiàn)表3)。最好方法用EuroCollins作為腎臟的載體溶液，修改了的UW溶液(如表3所述)用作肝臟的載體溶液，市售的UW溶液(Viaspan)(E.I.DupontandNemours)作為心臟的載體溶液。3.用低溫保護(hù)劑灌流器官的方案引入和除去低溫保護(hù)劑的典型方案顯示，兔腎在洗去低溫保護(hù)劑、移植后得到的可靠的高質(zhì)量的存活率，長(zhǎng)期起作用以及組織學(xué)追蹤的結(jié)果表示在圖5和6內(nèi)，另外用圖7A-E表示流程。如圖5所示，方案被分成至少7個(gè)獨(dú)立的階段。第1階段是引入低溫保護(hù)劑前器官建立穩(wěn)定基線特征的平衡階段。第2階段是低溫保護(hù)劑濃度的梯度增加階段，在第3階段的濃度平穩(wěn)段處結(jié)束。在第3階段花去一段時(shí)間后，這時(shí)A-V低溫保護(hù)劑濃度梯度常常變?yōu)榻咏?，濃度到達(dá)一個(gè)新的平穩(wěn)段，該平穩(wěn)段階段為第4階段。下面將作的更詳細(xì)闡述，第4階段不需要達(dá)到最高的濃度。例如在圖6中，第4階段濃度為6.7M，但圖6實(shí)驗(yàn)中的最終濃度為8.4M。不管最終濃度，第一洗凈步驟在圖5中用第5階段表示，為另一個(gè)濃度平平穩(wěn)段。第6階段是低溫保護(hù)劑洗凈階段，第7階段是低溫保護(hù)劑后的平衡階段。a)灌流壓器官用足以克服器官臨界封閉壓，但要低到避免對(duì)血管支脈產(chǎn)生不必要損傷的壓力進(jìn)行灌流。例如，兔腎的最好灌流壓是沒(méi)有明顯波動(dòng)的40mmHg。對(duì)于除了肝臟以外的不同器官和物種，包括人，認(rèn)可壓力的理想的范圍是20-70mmHg。一般在低于10mmHg壓力下，通過(guò)靜脈肝臟正常地接收它們的流體在5mmHg下灌流的小鼠的肝臟在V49灌流20分鐘后能得到近似的滲透平衡，沒(méi)有膠體存在，這些肝臟移植后一半可繼續(xù)維持生命。結(jié)果，對(duì)腳肝臟來(lái)說(shuō)，通過(guò)門靜脈處的壓力界限為5-40mmHg，通過(guò)肝動(dòng)脈的壓力為5-70mmHg。b)最初的灌流(第1階段)在最好的模式方案中，首先灌流15分鐘讓血管和毛細(xì)管(壓力和折射指數(shù))建立基準(zhǔn)值；保證血液完全洗去；使器官熱平衡，這里是指兔腎或鼠肝。臨床上，最初的灌流時(shí)間是任選的，可進(jìn)行調(diào)節(jié)(從0分鐘到1-2天或更多)運(yùn)輸以滿足器官獲得和運(yùn)輸過(guò)程的需要。在申請(qǐng)人的實(shí)驗(yàn)室中，這一時(shí)期對(duì)腎臟的灌流液是EuroCollins溶液或RPS-2，對(duì)肝臟的灌流液是修改的UW溶液。但是，這種最初的灌流液也可根據(jù)醫(yī)院或獲取器官單位的需要，是臨床上建立的另一種穩(wěn)定的溶液。c)最初溫度為獲取和運(yùn)輸一種器官(如腎臟)所需的最初灌流溫度不需要與第1階段時(shí)建立的灌流溫度相同。例如，雖然大多數(shù)器官可埋在0℃的碎冰內(nèi)運(yùn)送，而其它器官可在正常溫度(37℃)下運(yùn)送灌注。但是，當(dāng)器官準(zhǔn)備進(jìn)行低溫使用時(shí)，需建立預(yù)選的、標(biāo)準(zhǔn)化的灌流溫度。在最好的方案中，最初的灌流溫度是3.5-4℃，認(rèn)可的范圍為0-15℃。發(fā)明者認(rèn)為，對(duì)于最佳長(zhǎng)期保存的常溫灌流的器官也可冷卻到這樣的相同溫度范圍，可以與低溫保存器官相似的方法處理，在該方法需要的相對(duì)短時(shí)間里不會(huì)損傷器官。d)第2階段在最初基準(zhǔn)灌流后，以恒定的速度升高低溫保護(hù)劑的濃度直到建立了第一個(gè)濃度的平穩(wěn)段。當(dāng)使用V49型低溫保護(hù)劑的混合物時(shí)，混合物中不同的低溫保護(hù)劑比例保持恒定，同時(shí)使總濃度改變。對(duì)于腎臟最好方法是，V49型溶液總濃度的增加速度為約51mM/分鐘(即3M/小時(shí))，認(rèn)可的變化為31-150mM/分鐘。這些速度明顯地超過(guò)甘油和丙二醇的已知技術(shù)使用的30mM/分鐘的速度，所述的已知技術(shù)被認(rèn)為對(duì)于使用該方法是不必要的和不希望的緩慢。濃度線性的增加促進(jìn)了平衡，而且不會(huì)產(chǎn)生不需要的大的滲透應(yīng)力。e)第2階段中的溫度下降在第2階段中降低溫度以防止腎臟受到低溫保護(hù)劑的化學(xué)毒性。在最好的模式中，在動(dòng)脈低溫保護(hù)劑濃度達(dá)到1.3M時(shí)開(kāi)始降低溫度；認(rèn)可的范圍是0.5-3.5M。在到達(dá)第3階段時(shí)結(jié)束溫度的降低。最好降溫時(shí)，濃度變化在2.5M左右，但是濃度變化是在1-4.4M范圍。正如上面指出的，最初的灌流溫度應(yīng)當(dāng)為0-15℃。冷卻后的溫度處于-13℃到+5℃范圍內(nèi)，冷卻時(shí)的溫度總落差應(yīng)當(dāng)在2和25℃之間。冷卻不應(yīng)持續(xù)低于器官的冰點(diǎn)。在最佳模式中，最終的動(dòng)脈溫度為-3℃，表示從最初的溫度下降6.5℃，其冷卻速度約為0.33℃/分鐘。為了使低溫保護(hù)劑擴(kuò)散有足夠的機(jī)會(huì)，以及為了避免熱沖擊器官的可能性，總的冷卻速度不應(yīng)超過(guò)3℃/分鐘。f)第3階段腎臟的最佳模式中的第3階段平穩(wěn)段是確立在低溫保護(hù)劑總量的25％(W/V)(250克/升，或約3.8M)，接著是40-49％低溫保護(hù)劑，或在接著使用更高濃度(如V55)低溫保護(hù)劑時(shí)為30％w/v，總濃度低溫保護(hù)劑對(duì)腎臟進(jìn)行低溫保存，低溫保護(hù)劑認(rèn)可的變化范圍為20-40％(w/v或w/w)。第3相當(dāng)平穩(wěn)段的水平接近于第4階段濃度的一半。降低的第3階段水平會(huì)增加移動(dòng)到第4階段的滲透脅通，而相當(dāng)高的第3階段水平會(huì)由于較長(zhǎng)時(shí)間的在濃低溫保護(hù)劑中暴露而增加了毒性。根據(jù)灌流壓(和其器官流速)、血管耐受力、器官對(duì)低溫保護(hù)劑的通透度和毒性反應(yīng)的快速性，第3階段的持續(xù)時(shí)間最好為10分鐘，其認(rèn)可范圍為5-30分鐘。持續(xù)時(shí)間應(yīng)當(dāng)足夠的長(zhǎng)，可讓器官與動(dòng)脈灌流液之間至少達(dá)到近似的滲透平衡，用動(dòng)靜脈濃度差不大于50-200M檢測(cè)，以便在接著猛增到更高濃度時(shí)將不必要的滲透脅通降到最小值。g)通過(guò)一步、兩步或三步方法用玻璃化溶液灌流從第3階段到第4階段在分步改變濃度是控制暴露于高濃度低溫保護(hù)劑時(shí)間是必須的。第4階段濃度可足以玻璃化(一步引入法)或不足以玻璃化(需要一個(gè)或兩個(gè)附加的步驟達(dá)到玻璃化)。兩步(和三步)的方法在圖8中作簡(jiǎn)要說(shuō)明。在“一步“方法中，所有的低溫保護(hù)劑在一個(gè)連續(xù)過(guò)程(C1)中加入，并冷卻到冷凍的溫度也出現(xiàn)在一步法(T1)中。在“兩步”法中，部分低溫保護(hù)劑在第一步(C1)中加入，剩余的低溫保護(hù)劑在接近第一步所用的溶液的冰點(diǎn)溫度下進(jìn)行的第二步(C2)中加入。在該方法中，冷凍也是分兩步驟發(fā)生，具有用于制備第二濃度增加量(C2)的第一步，和用于將器官冷卻到冷凍的溫度的第二步。實(shí)踐中，第一冷卻步驟較好的是將溫度稍高于冰點(diǎn)，保證了在引入較高濃度低溫保護(hù)劑前避免結(jié)晶。在最好的模式中，第4階段濃度為40％(6.1M)到44％(6.7M)(w/v)V49溶質(zhì)，一種不足以玻璃化的濃度(圖6)。亞玻璃化濃度可接受的變化范圍為30％w/v-48％w/vV49溶液或它們的等價(jià)物。對(duì)于一步加入，第4階段的V49-或V49B-型溶液的濃度范圍為480-600克/升(約7.4-9.2M)(參見(jiàn)圖5)。對(duì)于非V49/V49B型溶液，第4階段的方法限制35-60％w/v低溫保護(hù)劑。第4階段濃度在最佳模式中穩(wěn)定20分鐘，認(rèn)可的變化范圍是10-60分鐘。應(yīng)當(dāng)將濃度保持足夠長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定使器官與上述灌流液達(dá)成照上述標(biāo)準(zhǔn)的大致的平衡。對(duì)于兩步方法，在第4階段完成后從灌流機(jī)中取出器官，并在用玻璃化溶液灌流前放在預(yù)冰冷的玻璃化溶液中冰冷5-30分鐘(對(duì)于兔腎臟較好的模式是5分鐘，更大的器官則時(shí)間更長(zhǎng))。在最佳模式中，冷卻器官，并在-22±2℃溫度下灌流(若預(yù)先用6.1M低溫保護(hù)劑灌流過(guò))或在-25℃±2℃溫度下灌流(若預(yù)先用6.7M低溫保護(hù)劑灌流過(guò))。該步驟所選的溫度被稱為“低溫灌流溫度”。更一般的是，低溫灌流溫度的范圍為-5℃到-35℃。圖9顯示了在低灌流溫度下灌流器官(以完成圖8中的C2步驟)的設(shè)備的技術(shù)方案。在另一個(gè)技術(shù)方案中，在初級(jí)灌流機(jī)內(nèi)部進(jìn)行冷卻和低溫灌流，沒(méi)有操作者介入其中。本發(fā)明者在-22℃下用V52灌流或在-25℃下用V55灌流兔腎臟，其灌流壓在20-40mmHg之間波動(dòng)，但通常不超過(guò)30mmHg，這在接著的移植中產(chǎn)生了優(yōu)秀的效果。認(rèn)可的方法中對(duì)于非肝臟器官，對(duì)灌流壓的限制范圍是在灌流設(shè)備中先前壓力的50-150％，對(duì)于肝臟，灌流壓的限制范圍是先前壓力的50-400％。對(duì)于腎臟通過(guò)收集低溫灌流時(shí)產(chǎn)生的“尿”來(lái)測(cè)定低溫灌流溫度下與玻璃化濃度平衡所需的時(shí)間，并在適當(dāng)稀釋后測(cè)定其滲透性。當(dāng)尿的滲透性接近于動(dòng)脈灌流液的滲透性時(shí)可認(rèn)為腎臟達(dá)到平衡。對(duì)于其它器官，通過(guò)動(dòng)脈靜脈濃度差來(lái)測(cè)定平衡程度。測(cè)定的認(rèn)可的平衡時(shí)間范圍約為20-60分鐘。在另一個(gè)技術(shù)方案中，給不能耐受暴露于低溫灌流溫度下的可完全玻璃化溶液的器官使用的方法是三步引入方法。這些器官可這樣成功地被低溫保存在低溫灌流溫度下用低于完全玻璃化的濃度的溶液進(jìn)行灌流(步驟二)，所述的濃度比冷卻到灌流溫度前的濃度高，這樣能使器官的結(jié)冰點(diǎn)(即3-20℃)明顯地低于低溫灌流溫度，然后在接近新器官結(jié)冰點(diǎn)溫度下用全玻璃化濃度灌流，(步驟三)在該溫度下完全玻璃化濃度是無(wú)毒的，因?yàn)榭杀荒褪堋Ｔ摷夹g(shù)方案也可用于需要避免凍傷的器官。h)兩步最佳模式法的基本原理雖然不希望為任何理論所約束，最佳模式兩步方法的基本原理是避免凍傷。在低溫灌流溫度下引入低溫保護(hù)劑被假定也可減少低溫保護(hù)劑的毒性。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，在-3℃下用V49灌流腎臟，存活率100％(14個(gè)灌流的14個(gè)都存活)，但當(dāng)器官冷卻到-30℃，溫?zé)岵⒂卯?dāng)時(shí)已知的最佳技術(shù)洗滌，存活率明顯下降(參見(jiàn)圖13)。在-3℃下用當(dāng)時(shí)的最佳技術(shù)用V52進(jìn)行灌流，存活率為75％，但當(dāng)將這些腎臟冷卻到-30℃時(shí)，隨著溫?zé)岷拖礈?，存活率?％。這樣，在49％(w/v)的低溫保護(hù)劑時(shí)，冷凍引起傷害，在52％(w/v)低溫保護(hù)劑時(shí)冷凍導(dǎo)致存活力完全喪失。理論上器官在V55中保存(可避免對(duì)高壓的需求)，該趨勢(shì)是不好的。然而，濃度低于49％時(shí)凍傷可變成輕微的，因而接近-30℃的冷凍溫度時(shí)為無(wú)害的。這提示了相對(duì)低濃度的凍傷可能性，為了避免凍傷，于是在較低溫下將濃度上升到查玻璃化的水平。該方法有另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，將器官暴露于其次一點(diǎn)是，毒性被減低的溫度下和玻璃化溶液中。這樣，避免凍傷時(shí)，也可避免毒性。關(guān)于上皮細(xì)胞和腎臟切片的熱沖擊現(xiàn)象作了各種實(shí)驗(yàn)表明，若首先在-30℃以上防止了凍傷，即使有V55的存在，低于-30℃的凍傷為最少。因此，首先在不會(huì)導(dǎo)致凍傷的濃度下冷凍到接近于-30℃，人們推測(cè)，當(dāng)器官用V55在低溫的灌流溫度下灌流，再冷卻到低于-30℃時(shí)，即使V55也不會(huì)引起致命的凍傷。如前面一節(jié)所述，第一個(gè)假設(shè)在兩步方法因成功地避免了V55在-25℃下凍傷和毒性得以證實(shí)。如結(jié)果部分所述，第二個(gè)假設(shè)也因進(jìn)一步避免冷卻到低于-46℃下并未發(fā)生致命損傷得以證實(shí)。4.器官的低溫保存任何實(shí)用的低溫保存過(guò)程的下一個(gè)步驟如玻璃化是用適當(dāng)?shù)姆桨福诩訅夯虿患訅呵皩⑵鞴倮鋮s到低溫。低溫保存步驟也包括儲(chǔ)存器官。本發(fā)明不涉及器官真正的低溫保存和儲(chǔ)存，而只涉及用作低溫保存的器官的制備和用作移植的預(yù)先低溫保存的器官的制備。5.對(duì)制備用作移植的器官的灌流在制備移植用器官時(shí)，首先將器官由儲(chǔ)存溫度溫?zé)岬竭m合器官再灌流溫度。在本發(fā)明的設(shè)備中不進(jìn)行低溫保存后溫?zé)崞鞴俚牟襟E。然后可將器官放回本發(fā)明灌流設(shè)備中以恢復(fù)在第5階段(洗去第一低溫保護(hù)劑平穩(wěn)段)的開(kāi)始時(shí)圖5和6所示的類型的灌流方案。a)第5階段的溫度在最佳的模式方法中，將器官溫?zé)岬郊s-3.0℃，并放進(jìn)灌流設(shè)備中開(kāi)始在該溫度下洗去低溫保護(hù)劑。本發(fā)明者出乎意料地發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用兩步最佳模式方法引入低溫保護(hù)劑時(shí)這一方法是優(yōu)秀的，即使使用V55作為最后玻璃化溶液也獲得了成功。假定在接近于-25℃溫度下可能引入玻璃化濃度，本發(fā)明者預(yù)期也是有利的是，在該溫度下除去部分低溫保護(hù)劑以避免預(yù)計(jì)在接近-3℃、完全玻璃化濃度會(huì)出現(xiàn)的高毒性。確實(shí)，發(fā)現(xiàn)在低溫灌流溫度下稀釋玻璃化溶液是有害的。在方法限度之內(nèi)，第5階段的溫度范圍為-20℃到+5℃。b)低溫保護(hù)劑濃度和第5階段的持續(xù)時(shí)間在腎臟和肝臟的最佳模式方案中第5階段的低溫保護(hù)劑濃度是30％w/v(300克/升；4.6M)到33％w/vV49溶液(D，F(xiàn)和P在普通的比例中)，認(rèn)可的變化范圍為20-40％(w/v或w/w)低溫保護(hù)劑(大約為3到6.0M)。在此階段的濃度應(yīng)當(dāng)不低于玻璃化溶液濃度的40％(2/5)以避免滲透損傷；在最佳模式中，第5階段的濃度是最高灌流濃度的3/5。第5階段的終止和第6階段開(kāi)始的標(biāo)準(zhǔn)稍不同于前述標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)發(fā)現(xiàn)延長(zhǎng)第5階段的時(shí)間有時(shí)導(dǎo)致改變，暗示細(xì)胞攝入了在此平穩(wěn)期一般存在且應(yīng)當(dāng)留在細(xì)胞外以保持器官存活的LMWOBA。因此確定的是第5階段的持續(xù)時(shí)間應(yīng)當(dāng)受到限制到讓A-V的濃度差開(kāi)始回歸到0的時(shí)候(按照發(fā)明者的經(jīng)驗(yàn)，從關(guān)閉值回歸到接近-50mM的值)，而不是延長(zhǎng)到A-V濃度差不再迅速改變的點(diǎn)。注意與圖5階段比圖6中更短的第5階段，它反映了圖6方案中反映出的方法中使用的更高濃度下成功所需的最優(yōu)化。也注意，圖6A-V濃度梯度恢復(fù)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，這與圖5中第5階段期間A-V濃度長(zhǎng)時(shí)間平衡相反。對(duì)于兔腎，最佳時(shí)間是9分鐘。在該方法限度內(nèi)，認(rèn)可的持續(xù)時(shí)間是0-30分鐘。c)OBA和它們?cè)诘?階段中的應(yīng)用在第5中一般存在一種或多種OBA(定義同上)。如前定義，為了便于討論，OBA的一種分類方法是低分子量(Mr為100和1000道爾頓之間)OBA和高分子量(Mr為1000和500,000道爾頓之間)OBA。但是，事實(shí)上低分子量和高分子量OBA之間沒(méi)有明顯的分界線，不同的Mr范圍有獨(dú)特的不同的性質(zhì)，因此有不同的實(shí)際應(yīng)用。這些關(guān)鍵性質(zhì)中的一些可使下述應(yīng)用的后面有更寬的原理，可綜述如下本發(fā)明者出人意料地發(fā)現(xiàn)OBA用途的一些新模式。對(duì)于在第5和6階段使用，這些新模式由i)合并低分子量和高分子量OBA(用于最高濃度方案)，ii)單個(gè)中等范圍OBA(用于高和中等濃度的方案)，iii)極低分子量OBA(用于低濃度方案)和iv)對(duì)于肝臟的特定OBA方案所構(gòu)成。在本節(jié)中，對(duì)這些用途和它們依據(jù)的原理作一般討論而不參照第6階段。i)低分子量和高分子量OBA的合用。對(duì)于腎臟和大多數(shù)其它的器官，最佳的OBA應(yīng)用模式被認(rèn)為是蔗糖，如約300-350mM，或其它低分子量OBA與羥乙基淀粉(HES相對(duì)分子量(Mr)20-500千道爾頓)，如3-8％w/v，或與其它等當(dāng)量高分子量OBA的合用。下面闡述了兩種特定實(shí)驗(yàn)實(shí)施例，它們?cè)谟谜鈮翰ＡЩ芤篤55灌流后得到良好的結(jié)果，所述的玻璃化溶液涉及350mM蔗糖和3％w/v的Mr為450千道爾頓的HES合用。其它優(yōu)選的低分子量OBA包括麥芽糖、棉籽糖、果糖1，6-二磷酸鉀和鈉、乳糖酸鉀和鈉、甘油磷酸鉀和鈉、葡糖酸鉀和鈉、麥芽三糖、麥芽五糖、水蘇糖和甘露醇。較好的高分子量OBA、HES是McGawCorp.(美國(guó)加利福尼亞lrvin)出售的200千道爾頓或450千道爾頓鏈，但易于水解成低分子量形式的物質(zhì)。最為優(yōu)選的HES分子量的范圍是1-100千道爾頓。其它優(yōu)選的高分子量OBA包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、棉籽糖乙酸十一碳酯鉀鹽(SigmaChemicalCo.出售)(美國(guó)伊利諾斯)和Ficoll(1-100千道爾頓)。低分子量OBA的存在是來(lái)對(duì)抗在穿透性的低溫保護(hù)劑濃度大步下降時(shí)的致命的滲透效應(yīng)。在低溫保護(hù)劑濃度大幅度下降的方案中(如第5階段濃度的下降接近20％w/v低溫保護(hù)劑)，需要更多的低分子量OBA(達(dá)上限750mM)。在使用更高的第5階段濃度的方案中(如40％w/v低溫保護(hù)劑)，需要較少的OBA(達(dá)下限約150mM)。在第一洗去低溫保護(hù)劑平臺(tái)(第5階段)期間使用OBA的最佳模式特別適用于采用大于7.5MV49溶質(zhì)的方案，即用于低于500-1,000大氣壓的以供玻璃化的靜水壓的方案。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)僅僅使用低分子量OBA甘露醇和蔗糖和最好情況下用V52代替V49時(shí)腎存活率僅有30％(7個(gè)被處理者僅有2個(gè)存活)，而用V49時(shí)有100％存活率(14/14)相符的。但是，在洗去低溫保護(hù)劑期間加入3％w/v450千道爾頓HES可使存活率上升到75％，此時(shí)使用了甘露醇或蔗糖作為低分子量OBA(8個(gè)被處理腎臟有6個(gè)存活)，并使用了一步玻璃化溶液加入方法。以前沒(méi)有預(yù)料到會(huì)有用高分子量試劑作為OB的概念，至少部分地是，因?yàn)檫@類試劑與低分子量化合物相比滲透作用很小。雖然不希望受任何特定的理論束縛，下列考慮導(dǎo)致發(fā)明者使用HES作為高分子量OBA。(a)在高濃度低溫保護(hù)劑存在下，高分子材料的濃度比傳統(tǒng)的稀水溶液的濃度高。因此，試劑的滲透效應(yīng)增加。(b)高分子試劑的腫脹功能在保護(hù)血管系統(tǒng)不致由于低溫保護(hù)劑的突然稀釋而破裂是至關(guān)重要的，或可能對(duì)血管系統(tǒng)有好處。(c)通過(guò)降低孔隙體積(這樣可降低低分子量OBA滲透進(jìn)細(xì)胞可利用的的池體積)或通過(guò)對(duì)低分子量OBA擴(kuò)散到和/或擴(kuò)散通過(guò)細(xì)胞膜起物理屏障的作用，高分子量試劑可減少細(xì)胞對(duì)低分子量OBA的異常攝入。(d)高分子量OBA通過(guò)腫脹作用擴(kuò)大或防止血管室破裂，故應(yīng)當(dāng)有助于洗去低溫保護(hù)劑，從而減少延遲洗去低溫保護(hù)劑時(shí)導(dǎo)致的滲透脅迫。(e)膜通透性的任何異常的增加會(huì)導(dǎo)致低分子量OBA對(duì)器官細(xì)胞的部分滲透，但不會(huì)使高分子量OBA滲透，這樣使用高分子量OBA會(huì)降低所用的每毫滲克分子OBA的異常滲透的凈量。使用高分子量OBA的最佳模式是至少滲透壓或腫脹壓的3-6％、450千道爾頓HES。但是，較好的是使用比這更低的Mr的試劑，因?yàn)?0-200kd的相對(duì)分子量會(huì)產(chǎn)生相等或更大的腫脹壓，仍然使試劑不能滲透進(jìn)活細(xì)胞。較好的是聯(lián)合使用高分子量和低分子量的OBA，因?yàn)榍罢叩咒N了后者的攝入，并增加了后者的滲透作用，而低分子量試劑提供了充足的滲透壓，從而完成防止在低溫保護(hù)劑稀釋時(shí)細(xì)胞攝入水分的首要任務(wù)。另外，低溫保護(hù)劑溶液中的高分子量OBA的高粘度可支撐粘度小的低分子量試劑用作初吸滲透劑，對(duì)此而言，高分子試劑是作為輔劑加入的。ii)中等范圍OBA。對(duì)于腎臟和大多數(shù)其它器官來(lái)說(shuō)，另一個(gè)較好的OBA使用方法是單獨(dú)使用分子量范圍為360-10,000道爾頓、總濃度為2-15％w/vOBA。本申請(qǐng)中合適的OBA例子包括麥芽糖、棉子糖、果糖1，6-二磷酸鉀和鈉、乳糖酸鉀和鈉、麥芽三糖、麥芽戊糖、水蘇糖、棉子糖十一烷乙酸鉀、在上述分子量范圍內(nèi)的Ficoll和HES。雖然不希望受任何理論束縛，該分子量范圍的單個(gè)試劑常常有低分子量和高分子量OBA適當(dāng)?shù)芈?lián)合成單個(gè)試劑的特性。滲透劑的不可通透性是OBA最重要的特征，該不可通透性在分子量范圍為360-10,000道爾頓，或更窄的是約360-2,000道爾頓時(shí)可能達(dá)到與實(shí)際有關(guān)的最大值。該分子量范圍的溶質(zhì)有相當(dāng)大的通透作用，而粘度也相當(dāng)對(duì)低，溶解度相當(dāng)高。此分子量范圍的試劑在沒(méi)有腫脹作用或成本最為重要時(shí)被推定為理想模式。該重量范圍的一些試劑對(duì)腎臟和肝臟也是不可通透的，這樣至少部分消除了這些器官之間的差別。iii)極低分子量OBA作為唯一OBA的“低”濃度方法。當(dāng)玻璃化方法涉及使用相對(duì)低濃度低溫保護(hù)劑時(shí)，如B49，用甘露醇(Mr＝180道爾頓)作為唯一OBA得到令人滿意的結(jié)果(參見(jiàn)結(jié)果一節(jié)的有關(guān)數(shù)據(jù))，低粘度甘露醇溶液比粘度高的溶液(Mr更高)能更好地維持器官的流量。結(jié)果，在使用升高的壓力和/或濃度低于V52的玻璃化方法時(shí)，最佳模式的另一個(gè)技術(shù)方案是使用極低分子量OBA作為唯一OBA(0BA的Mr≤400道爾頓)。雖然不希望受任何理論束縛，較低濃度的低溫保護(hù)劑的脅迫性更低，能更有效地保持膜的通透性，基于這樣的原因，較低的Mr試劑是有效的。因?yàn)楦事洞嫉某杀緲O低，普遍沒(méi)有毒性，而Mr范圍為180-2,000道爾頓或更高道爾頓的OBA成本隨Mr急劇升高，故甘露醇和/或相似的低分子量OBA(如蔗糖、麥芽糖)在本方法技術(shù)方案中作為“低”濃度試劑的首選藥物。(iv)對(duì)肝臟應(yīng)用的OBA。對(duì)于肝臟，OBA最佳的使用模式是完全不用OBA。其它兩個(gè)優(yōu)選應(yīng)用的OBA是單獨(dú)使用高分子量OBA(如，3-5％HES、Mr10,000-450,000道爾頓，或如上所述的相當(dāng)物)，和使用中等范圍的OBA(Mr約為350-10，000)，特別是在低溫保護(hù)劑的洗去速度很高時(shí)。(a)完全不用OBA。既不用低溫保護(hù)劑又不有正常的HES的改性UW溶液灌流4個(gè)對(duì)照肝臟的實(shí)驗(yàn)表明在三個(gè)實(shí)驗(yàn)中可保持生命支持功能。用包括V49灌流，但不用低分子量滲透劑來(lái)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，移植后不僅有約50％肝臟可支持生命，而且在用V49幾乎完全平衡后也有同樣的結(jié)果，這與肝臟用存在有HES的V49灌流后的結(jié)果相反，其平衡不良，存活率不比沒(méi)有HES灌流的肝臟好。因此，無(wú)論低分子量或高分子量的滲透劑對(duì)于肝臟都不是必須采用的。雖然不希望受任何理論束縛，省去所有OBA對(duì)于肝臟的可接受性和需要性被認(rèn)為是基于肝臟對(duì)低溫保護(hù)劑和列出的低分子量OBA的高通透性。肝臟的獨(dú)特性在于它的薄壁細(xì)胞對(duì)低分子量溶質(zhì)，包括低溫保護(hù)劑是極度通透的。這可讓低溫保護(hù)劑的加入和洗出速度比其它器官更快，并且滲透脅迫比其它器官中的小。例如，據(jù)發(fā)現(xiàn)肝臟切片可耐受低溫保護(hù)劑濃度的多個(gè)摩爾的突然變化，這對(duì)其它類型的組織，包括腎臟可能是致命的，在暴露于低溫保護(hù)劑和洗去后，用較小的濃度變化對(duì)肝臟細(xì)胞的存活率沒(méi)有改善。對(duì)于完整的肝臟，盡管沒(méi)有低分子量OBA和高分子量OBA，也洗去來(lái)自肝臟的V49期間，圖10表示有合理的穩(wěn)定流速(這提示沒(méi)有過(guò)度的滲透細(xì)胞腫脹)。最后，由于肝臟細(xì)胞對(duì)蔗糖稍可通透，在洗去低溫保護(hù)劑時(shí)蔗糖相對(duì)不如OB有效，但它能滲入細(xì)胞，這會(huì)在移植時(shí)確實(shí)導(dǎo)致細(xì)胞腫脹。(v)僅僅使用高分子量OBA。上述實(shí)驗(yàn)揭示了不用HES的一種困難，即4個(gè)對(duì)照肝臟有3個(gè)(沒(méi)有低溫保護(hù)劑)在沒(méi)有HES存在下作灌流時(shí)存活了，反之使用HES時(shí)存活率較高。不論低溫保護(hù)劑是否存在，HES或它的等價(jià)物可能必須存在，以支持肝的存活。因?yàn)樵谘b載可玻璃化濃度期間，部分由于對(duì)粘度的不良效應(yīng)，不可存在HES(除非以最小的濃度存在)，使HES最大以保持活力的一個(gè)方法是在洗去低溫保護(hù)劑時(shí)加入HES，這簡(jiǎn)單地因?yàn)榕c玻璃化濃度相比低溫保護(hù)劑濃度很低，且這些濃度下降而不是上升時(shí)，用HES灌流從物理角度(低粘度)來(lái)看是更可行的。關(guān)于這一點(diǎn)HES不必作為真正的OBA，而只作為普通的滲透支持試劑起作用。不管怎樣，HES的使用方法基本與用作OBA的相同，從實(shí)用角度來(lái)看，這相當(dāng)于使用高分子量OBA作為唯一的OBA。此外，必須記取的是肝臟不只是由肝細(xì)胞構(gòu)成，諸如HES的滲透劑對(duì)這些非肝細(xì)胞可能一起真正的OBA作用。根據(jù)肝臟類型在控制灌流時(shí)對(duì)沒(méi)有HES的耐受性和低溫保護(hù)劑洗去時(shí)對(duì)沒(méi)有HES的耐受性來(lái)決定在洗去肝臟的低溫保護(hù)劑時(shí)使用HES或其它相當(dāng)?shù)母叻肿恿縊BA。雖然在上述實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合用低溫保護(hù)劑和HES灌流時(shí)肝臟與低溫保護(hù)劑的平衡不良，但該問(wèn)題可通過(guò)使用足夠低Mr滲透劑以適當(dāng)控制粘度來(lái)克服，如相當(dāng)于Mr＝2-50kd的HES的高分子量OBA。(c)中等范圍OBA用于肝臟的快速流出低溫保護(hù)劑。Mr范圍為350-10,000道爾頓的OBA比蔗糖的滲透性小，比大多數(shù)高分子量OBA的粘度更小，(因此灌流速度可以很快)，這可防止肝臟細(xì)胞而不是肝細(xì)胞受到滲透損傷，特別是在極快速地改變低溫保護(hù)劑的濃度時(shí)。因此，這樣一個(gè)試劑或兩種或多種這類試劑的聯(lián)合處在對(duì)肝臟方法的限度內(nèi)。d)第6階段低溫保護(hù)劑濃度梯度逐漸減少到0，同時(shí)升高灌流溫度在腎臟的最佳模式方法中，以約-42mM/分鐘的恒速(對(duì)于肝臟，可接受的范圍為-31到-75mM/分鐘)使低溫保護(hù)劑的濃度逐步減少到0或接近0。非恒定的濃度下降表(在高濃度時(shí)迅速下降，在較低濃度時(shí)緩慢下降)也是可接受的方法，如在第一個(gè)1/3洗出時(shí)以平均線性速度的1.5倍線性下降，接著的2/3洗去時(shí)以平均線性速度的0.86倍線性下降。在洗出低溫保護(hù)劑時(shí)，升高溫度以利于洗出，減少滲透力，并使不含低溫保護(hù)劑的器官恢復(fù)到適合灌流的溫度。在對(duì)于腎臟的最佳模式方法中，在濃度下落到4.7M并隨濃度下降時(shí)開(kāi)始繼續(xù)作線性升高溫度直至達(dá)到最初的灌流溫度，動(dòng)脈濃度達(dá)1.3-0.8M(濃度每降低0.68-0.78M升高1℃在溫?zé)釙r(shí)有3.4-3.9M的總濃度改變)，如圖5和6所示。在溫度開(kāi)始上升時(shí)認(rèn)可的濃度變動(dòng)認(rèn)可范圍為2.5-5.5M，完成溫度上升時(shí)的濃度為0.5-4.5M。e)第6階段的OB洗去第6v期間OB洗去的一般方法是不完全地洗去低分子量OBA，同時(shí)將高分子量OBA濃度保持恒定或只減少1-2％w/v。更具體的是，隨著滲透低溫保護(hù)劑濃度的下降，低分子量OBA濃度也按比例地下降到達(dá)最終的OB非0濃度，此時(shí)滲透性的低溫保護(hù)劑濃度達(dá)到0。該低分子量OBA最終的非0濃度在最佳模式方法中為50mM，認(rèn)可的范圍為25-500mM。例如，在最佳模式(圖6)中，350mM蔗糖被稀釋到50mM，而5.0M低溫保護(hù)劑以42mM/分鐘的速度下降到0.0M，蔗糖濃度的下降速度為2.5mM/分鐘。雖然不希望受任何理論束縛，在降低低溫保護(hù)劑濃度期間，可歸因于低溫保護(hù)劑跨膜濃度梯度的絕對(duì)跨膜滲透力減少了，這樣減少了對(duì)滲透緩沖的需求。在低溫保護(hù)劑洗去期間降低OB濃度可使低溫保護(hù)劑洗去期間和此后的來(lái)自O(shè)B的滲透損傷最小，這可進(jìn)一步被設(shè)計(jì)成細(xì)胞對(duì)所列出的非滲透OBA的攝入潛力。以前的洗去低溫保護(hù)劑的灌流技術(shù)沒(méi)有使用該“OB降低原理”。當(dāng)一道使用低分子量和高分子量OBA時(shí)，OB有區(qū)分的降低，其中低分子量藥劑下降，而高分子量OBA保持不變或基乎不變。t)OB洗去第7階段i)標(biāo)準(zhǔn)模式。在除去所有低溫保護(hù)劑后繼續(xù)方法中的最后步驟是以灌流器官，讓它與沒(méi)有低溫保護(hù)劑的介質(zhì)完全平衡，需要時(shí)繼續(xù)或完全洗出OB。在目前腎臟用的最佳模式中，在低溫保護(hù)劑洗去的最終，還有50mM蔗糖和3％w/vHESMr450kd，在移植前不再洗去這些OBA。雖然可以在移植前很短的保存時(shí)間里在器官中殘留這些低濃度的OB，但孔隙中的OB預(yù)料在血液回流時(shí)導(dǎo)致孔隙空間的滲透擴(kuò)張，隨后暫時(shí)減少了體內(nèi)器官的灌流。該效應(yīng)在較高OB濃度(≥100-500mM，或≥3-7％w/v)時(shí)是不可接受的，因此在移植前必須至少部分洗去OB。在移植前OB長(zhǎng)時(shí)間留在器官里的再一個(gè)問(wèn)題是OB可能滲入器官細(xì)胞，后來(lái)移植時(shí)細(xì)胞腫脹，灌流減少。在用V49進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明者典型情況下在30分鐘內(nèi)完全洗去50mM甘露醇，移植時(shí)得到徹底的成功。但是，據(jù)一般觀察，在移植前在腎臟里留下50mM低分子量OB達(dá)很短的時(shí)間，某些情況下代表器官生存或死亡之間的差異，較高的低溫保護(hù)劑濃度是有利的。從未觀察到在移植前在腎臟中留下50mM甘露醇或蔗糖比完全除去這最后濃度更為有害，故第7階段期間最先考慮洗去OBA考慮將低分子量OBA濃度減少到低于100-500mM，高分子量OBA濃度減少到約5-8％w/v以下。雖然不希望受與任何理論束縛，據(jù)信殘留40mM低分子量OBA是有利的，因?yàn)榭紫兜臐B透劑會(huì)減少細(xì)胞和細(xì)胞器的腫脹，直到體內(nèi)的新陳代謝得以恢復(fù)，代謝的細(xì)胞能作滲透調(diào)節(jié)以抵御滲入細(xì)胞內(nèi)的甘露醇或蔗糖，倘若細(xì)胞外的滲透劑可減慢被動(dòng)的細(xì)胞腫脹，其時(shí)間長(zhǎng)到足以恢復(fù)滲透調(diào)節(jié)。另外，使用更高的Mr的OBA會(huì)排除細(xì)胞對(duì)OBA的攝取，進(jìn)一步增加OBA殘留的可接受性。更高濃度的OB(直至500mM)可在更長(zhǎng)的時(shí)間(30-90分鐘)里被洗去，這取決于對(duì)OB稀釋的灌流耐受性的反應(yīng)。對(duì)于臨床使用，洗去后灌流時(shí)期的長(zhǎng)度包括OB洗去，和OBA洗去的程度，必須被調(diào)節(jié)到與器官運(yùn)輸和移植所需的暴露時(shí)間相配。ii)三-滲透劑洗去技術(shù)。在本發(fā)明者早先的經(jīng)驗(yàn)中包括在-3℃下灌流8.4M低溫保護(hù)劑(一步加入技術(shù))，在低溫保護(hù)劑洗去期間一致地控制血管阻力，在移植后40分鐘腎臟的外觀極好，使用如下方法，并使用這一方法。用8.4M低溫保護(hù)劑灌流后，低溫保護(hù)劑的濃度下降到約5.0M，同時(shí)加入250mM蔗糖和4％w/vHES。在第5階段平臺(tái)達(dá)9分鐘后，用標(biāo)準(zhǔn)的線性蔗糖洗去技術(shù)，同時(shí)將HES濃度保持為4％w/v。但是，一旦除去了低溫保護(hù)劑，HES的濃度被逐漸降低到3％w/v，同時(shí)將HES的濃度逐漸降低到0，同時(shí)加入最終濃度為50mM約甘露醇。這樣，涉及三-滲透劑洗去技術(shù)的革新是1)將高分子量OB與兩個(gè)低分子量OB聯(lián)合，得到3-OBA方法，和(2)僅在移植前用另一個(gè)OB(甘露醇)代替一個(gè)OB(蔗糖)。雖然不希望受任何理論束縛，建立該方法的理由如下。蔗糖比甘露醇更具有滲透效應(yīng)，即由于它的分子量更高，它可能更不易滲入腎細(xì)胞。但是，不象甘露醇，在移植時(shí)用血液再灌流器官時(shí)它不能淬滅游離基反應(yīng)。通過(guò)使用蔗糖執(zhí)行最初的滲透緩沖功能，甘露醇在灌流末保持滲透緩沖作用，這樣得到了兩種試劑的優(yōu)點(diǎn)，并避免了它們的缺點(diǎn)。其次，在第5階段和第6階段期間，對(duì)于使粘度降至最小和使?jié)B透和腫脹作用變到最大之間的交替達(dá)到平衡雖然是最適的4％HES。最后，在移植前即刻將4％HES降低到3％以使灌流液粘度和孔隙間的高分子種類的數(shù)量最小。尚未得到分析的的是該方法特別依賴于蔗糖、HES或甘露醇。所涉及的主導(dǎo)原理是普遍的。6.在移植時(shí)和此后對(duì)器官和接受者的處理重要的是在松開(kāi)血管夾和對(duì)移植器官再灌流前即刻給接受者服下阿司匹林(乙酰水楊酸，1-3nmg/kg)和肝素(100-250單位/kg)，兩種藥物的濃度較高或較低都會(huì)使血管阻塞和衰竭。最佳濃度分別為2mg/kg和200單位/kg。逐漸地注入能逆轉(zhuǎn)硫氫基氧化作用的試劑(如硫代葡萄糖金或N-乙?；腚装彼?，其血清水平為0.1-10mM)、抑制細(xì)胞外(如α-2巨球蛋白、阿米洛利、金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP))和細(xì)胞內(nèi)蛋白酶(亮肽素、甘氨酸)或促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞粘附的試劑(TGFβ1，每5分鐘靜注0.1-10微克，持續(xù)40-300分鐘)。發(fā)明者現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)二甲亞砜降低了腎組織對(duì)被消耗光的組織中SH含量的修復(fù)能力，在兔腎移植后發(fā)現(xiàn)尿激酶大量升高。III.用非低溫保護(hù)劑灌流液灌流器官的方法除了用低溫保護(hù)劑灌流器官的方案外，這里所述的設(shè)備和方法能用于各種常規(guī)的低溫和正常溫度的器官灌流方案。另外，各種正常的藥理學(xué)、生理學(xué)和病理學(xué)方案也可用本發(fā)明的設(shè)備和方法。本發(fā)明者早就指出了這些可能性，并在圖11A和11B中闡述了這些方案所需的步驟，圖中有解釋說(shuō)明。IV.結(jié)果A.用TGFβ1對(duì)上皮細(xì)胞保護(hù)當(dāng)用表4的低溫保護(hù)劑溶液洗滌時(shí)，在培養(yǎng)瓶中TGFβ1使內(nèi)皮細(xì)胞正確地附著于粘連蛋白介質(zhì)或基底。預(yù)計(jì)TGFβ1在體內(nèi)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有相似的作用。表4</tables>*通過(guò)每次實(shí)驗(yàn)后使燒瓶受胰蛋白酶作用，洗去培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞并計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定去粘附。在該試驗(yàn)中未見(jiàn)到過(guò)冷時(shí)去粘附細(xì)胞被除去，這導(dǎo)致細(xì)胞的計(jì)數(shù)下落。B.兔腎1.V49B-型溶液的適用性。用V49或V49B處理的兔腎切片的活力數(shù)據(jù)如表5所示。表5在洗去低溫保護(hù)劑和在25℃下將皮層切片培養(yǎng)90分鐘以活化K+和Na+的運(yùn)輸來(lái)測(cè)量K/Na比率。2.V49和V52對(duì)于完整的腎臟的適用性圖12顯示接受了預(yù)先用V49在Euro-Collins溶液灌流的腎臟移植的兔子的手術(shù)后血清肌酸酐水平。在獲取器官前，通過(guò)在20分鐘內(nèi)全身靜脈輸液，0、15或25微克/kg伊洛前列腺素在體內(nèi)處理腎臟。這三組的腎臟在+2℃、0-2℃和-1到-6℃下分別被暴露于V49(7.5M)。所有情況下的最初和最終灌流溫度為2℃。這三組兔子的存活率分別為5/16(31％)，6/10(60％)和10/10(100％)。只有手術(shù)后第一夜存活的兔子數(shù)據(jù)。兔子存活完全取決于移植的腎臟的功能，因?yàn)樵谝浦驳耐瑫r(shí)執(zhí)行了反側(cè)的腎摘除術(shù)，沒(méi)有濃度進(jìn)行滲析支持。沒(méi)有伊洛前列腺素處理、用邊緣的低劑量伊洛前列腺素處理和用較高劑量的伊洛前列腺和最低灌流溫度正常處理后這些兔子的組織學(xué)很長(zhǎng)時(shí)間都不良。用EuroCollins灌流的對(duì)照(沒(méi)有低溫保護(hù)劑)結(jié)果如圖8所示(底下的曲線)。雖然最佳V49組的損傷比對(duì)照的大，所有的損傷在手術(shù)后短時(shí)間里看來(lái)完全是可逆的。表6顯示了將7.5M低溫保護(hù)劑擴(kuò)展到8M低溫保護(hù)劑時(shí)，除非用加了3％HES的溶液洗去8M濃度的低溫保護(hù)劑，結(jié)果幾乎一致地衰竭。移植后使用HES使兔子腎臟的存活率為75％。在兔子腎臟內(nèi)遺留低分子量OBA對(duì)移植后的腎臟也是有利的。(表6)。表6C.克服在-46℃下的凍傷和8.4M的低溫保護(hù)劑的毒性當(dāng)腎臟用7.5M或8M低溫保護(hù)劑處理，在如表6所示的洗去時(shí)用3％HES時(shí)，它們?nèi)匀徊荒苣褪?30℃的冷凍(圖13)。49％低溫保護(hù)劑的100％存活率由于冷凍而下降到50％，8M組的75％存活率下降到0％。雖然一些損傷是由于發(fā)生冷凍和溫?zé)嵝枰嗟臅r(shí)間，組織切片本身表明冷凍的證據(jù)本身是自動(dòng)有害的。從圖14可見(jiàn)，將切片暴露于0℃下的8M低溫保護(hù)劑明顯地比暴露于相同溫度下的6.1M低溫保護(hù)劑受傷害更甚(參見(jiàn)第2和4欄)，8M的切片冷卻到-23℃，引起另外的損傷(參見(jiàn)第2和3欄)。但是，有意思的是，冷卻到-23℃的6.1M切片沒(méi)有另外的損傷(參見(jiàn)第4和5欄)。更有意思的是，當(dāng)負(fù)載6.1M低溫保護(hù)劑的切片轉(zhuǎn)到-23℃的8M溶液或甚至是8.4M低溫保護(hù)劑中，沒(méi)有與冷卻相關(guān)的損傷，也沒(méi)有與暴露于較高濃度相關(guān)的損傷(參見(jiàn)第4和5-6和7欄)。事實(shí)上，根據(jù)兩步方法(首先冷卻，然后暴露于較高的濃度，第7欄)暴露于-23℃的8.4M的活力比單純暴露于0℃的8M最低濃度沒(méi)有冷凍的活力高(第2欄，p＝0.033)。這些結(jié)果顯示，通過(guò)首先在低濃度下冷凍，然后在第二步于更低溫度下，如-23℃引入更高的濃度可以防止凍傷和低溫保護(hù)劑的毒性。圖13的再檢查提示完整的腎臟有相同的現(xiàn)象。較低濃度低溫保護(hù)劑的恢復(fù)率較高，若一條線連接8M冷卻點(diǎn)和7.5M冷卻點(diǎn)，外推得到低于7.5M的濃度有100％存活率。由于這類外推的線性是未知的，發(fā)明者通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇，確證低于7.5M，即在切片實(shí)驗(yàn)中的6.1M是合格的濃度。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖15所示。100％腎臟用6.1M低溫保護(hù)劑裝載，冷卻到約-22℃，升溫(在插入中指出的方案)維持的生命，在14天后(Cr14)后得到優(yōu)秀的平均血清肌酸酐和可接受的峰值肌酸酐(pCr)。圖16顯示結(jié)果，是-3℃下裝載6.1M低溫保護(hù)劑，冷卻到-23℃，然后用8M低溫保護(hù)劑灌流腎臟直至達(dá)到平衡所得的。如前述實(shí)驗(yàn)，8M低溫保護(hù)劑用3％HES洗去。與冷卻到-30℃后再進(jìn)行一步低溫保護(hù)劑加入方法適成對(duì)照的是(圖13)，圖16的8M腎臟有7/8極好的存活率，存活的腎臟的Cr14和pCr值與6.1M的腎臟沒(méi)有不同，與圖14的切片結(jié)果完全一致。此外，如圖17所示，當(dāng)腎臟在-22℃下用8M低溫保護(hù)劑灌流時(shí)，它們可再下降10℃達(dá)到-32℃(比圖13內(nèi)的更冷)，升溫時(shí)存活率達(dá)到100％，Cr14值與僅暴露于6.1M低溫保護(hù)劑的切片相同，與圖14預(yù)計(jì)的完全一致。由圖18可見(jiàn)在-30到-60℃之間凍傷增加，但在接近玻璃化溫度時(shí)不進(jìn)一步增加。圖18的主要部分顯示在-30到-60℃之間更精確地測(cè)定凍傷停止增加的地方。雖然該實(shí)驗(yàn)的數(shù)量回落稍小，但它顯示切片在冷凍到-45℃到-50℃處有最大的凍傷。用圖18的信息作為指導(dǎo)對(duì)完整腎臟進(jìn)行的兩個(gè)附加實(shí)驗(yàn)。在約9個(gè)月優(yōu)化的引入和除去V55程序之后，確定以下最佳方法。兩步方法的第一步是在-3℃下灌流44％w/v低溫保護(hù)劑(6.73M)，然后冷卻到-25℃，用V55灌流(55％低溫保護(hù)劑，8.4M)。再將腎臟溫?zé)岬?3℃，如上所述用3％w/vHES和350mM蔗糖洗出。該方案迄今得到的結(jié)果是3個(gè)這樣處理的腎臟中有2個(gè)存活。這些腎臟在體內(nèi)血液再流動(dòng)40分鐘后看上去良好，結(jié)果如圖19所示，它們能將血清的肌酸酐水平恢復(fù)到接近或低于2mg/dl的水平，這是很好的結(jié)果。此外，用該方法在-25℃下用V55灌流的腎臟在溫?zé)崆袄鋮s到-46℃，用與非冷凍V55腎臟中所用的相同方法洗滌。該腎臟的結(jié)果也在圖19中顯示(虛線)，它們是相似的移植后腎臟外觀很好，在提交本專利申請(qǐng)時(shí)該腎臟血清的肌酸酐水平恢復(fù)到接近2mg/dl的值。和在另外兩個(gè)V55腎臟上看到的沒(méi)有區(qū)別，其恢復(fù)特別地延遲，在一段無(wú)前例的時(shí)間里其肌酸酐值接近15，但在這一長(zhǎng)時(shí)間延誤后血清的肌酸酐峰值回到基線。綜合來(lái)看，圖18的切片結(jié)果和圖19完整腎臟所得的數(shù)據(jù)表明兔腎臟可被冷卻到玻璃化溫度而不會(huì)失去存活性。此外，由于圖19采用不施加壓力即可玻璃化的低溫保護(hù)劑的濃度，這表明高壓不再是器官玻璃化所必須的。D.動(dòng)物數(shù)據(jù)與人體腎臟低溫保存的相關(guān)性1.第一例人腎臟根據(jù)本發(fā)明的方法對(duì)232克垂的人體腎臟進(jìn)行灌流，然后玻璃化。用BASIC程序收集來(lái)自該方法的數(shù)據(jù)，用SigmaPlot5.0圖像部件(JandelScientific，美國(guó)加利福尼亞)編輯和作圖重新獲得圖20A、20B和21內(nèi)的數(shù)據(jù)。圖20A內(nèi)的數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明的方法在該人體的腎臟中產(chǎn)生了預(yù)期的結(jié)果。雖然測(cè)得的摩爾量稍大于目標(biāo)的摩爾量，濃度第一步的改變稍超過(guò)目標(biāo)，遵守該方案的數(shù)據(jù)仍是合理的。來(lái)自相同人體腎臟的圖20B的數(shù)據(jù)顯示其阻力(用mmHg除以流量表達(dá))和流量(毫升/分鐘/腎臟克數(shù))的行為與兔子腎臟的行為相似。來(lái)自人體腎臟玻璃化的數(shù)據(jù)顯示該方法是合適的。圖21的數(shù)據(jù)沒(méi)有指出腎臟的結(jié)冰，這由溫度相對(duì)快速下降后出現(xiàn)平臺(tái)來(lái)表示。最初的溫度滯后在0℃以上代表外部的溫度滲入腎臟中部的溫度探頭處，在這之后溫度相當(dāng)平穩(wěn)地下落，表示沒(méi)有冰形成。2.第二例人的腎臟該人腎臟是來(lái)自四個(gè)月齡的提供者的小兒腎臟。該腎臟在收到后但在用V55根據(jù)本發(fā)明方法灌流前儲(chǔ)存79小時(shí)。圖22的數(shù)據(jù)顯示用V55對(duì)該腎臟的灌流(曲線的上升部分)，和從腎臟除去V55低溫保護(hù)劑(曲線的下降部分)。圖22的虛線和實(shí)線分別顯示了所得的和目標(biāo)的V55濃度。該實(shí)驗(yàn)中的灌流壓為35mmHg。測(cè)量的和目標(biāo)濃度的不一致只是由于計(jì)量上的原因，而不是該方法的局限性所致。當(dāng)迅速達(dá)到8.4M濃度或從折射的軟件中退出時(shí)壓力出現(xiàn)尖峰信號(hào)，沒(méi)有特別的設(shè)計(jì)來(lái)防止這些尖峰信號(hào)并改正這些信號(hào)。這不是該方法的限制。由于該腎臟未經(jīng)負(fù)載，故沒(méi)有產(chǎn)生冷凍曲線。圖22沒(méi)有顯示阻力、流量和溫度。E.腎臟切片存活數(shù)據(jù)來(lái)自兔腎臟(圖23A)和人腎臟(圖23B)的存活數(shù)據(jù)和兔(R)和人(H)腎臟切片正常的數(shù)據(jù)(圖23C)顯示，人和兔腎臟切片對(duì)V49的響應(yīng)幾乎相同。雖然數(shù)據(jù)顯示，在冷卻到-30℃后與兔組織相比人腎臟組織的恢復(fù)稍差，但該恢復(fù)用兔子腎臟切片時(shí)被視為在存活率范圍里。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前對(duì)人腎臟放置了數(shù)天，而兔腎臟是“新鮮的”。人的絕對(duì)K/Na比率的抑制與預(yù)計(jì)兔子切片儲(chǔ)存相似時(shí)間所得的大致相同。在本部分中的與灌流數(shù)據(jù)結(jié)合的這些數(shù)據(jù)顯示，根據(jù)本發(fā)明的方法人體腎臟可被低溫保護(hù)劑所裝載，并可在冷凍下玻璃化--如，被冷凍到玻璃化溫度以下，在器官內(nèi)有極少或沒(méi)有冰形成。這些數(shù)據(jù)也顯示可用本發(fā)明的方法從人腎臟中除去低溫保護(hù)劑。最后，兔和人腎臟切片存活數(shù)據(jù)的相似性，并結(jié)合兔腎臟可存活且維持經(jīng)移植入腎臟的兔子的生命的事實(shí)表明，人腎臟用本發(fā)明的方法處理也可得到相似的結(jié)果。F.對(duì)其它器官的實(shí)用性鼠肝臟模式鼠肝臟用圖10所示的方案進(jìn)行灌流。灌流液體不含HES或低分子量rOB。表7的數(shù)據(jù)顯示在移植后5、10和15分鐘產(chǎn)生的總的膽汁，以及在肝臟移植入鼠體內(nèi)后7天里的存活數(shù)。這些數(shù)據(jù)顯示用溶液灌流的鼠肝臟可支持已移植入經(jīng)灌流的鼠肝臟的飼養(yǎng)鼠的生命。表7</tables>*Pfn＝灌流+UW1＝修改的UW溶液1(參見(jiàn)表3)≠UW2＝修改的UW溶液2(參見(jiàn)表3)綜合來(lái)看，來(lái)自腎臟和肝臟的數(shù)據(jù)表明這里揭示為了低溫保存的器官的制備方法和低溫保存后用于移植的器官的制備方法是有廣泛用途的。雖然上面揭示了本發(fā)明各種技術(shù)方案，應(yīng)當(dāng)明白它們只代表實(shí)施例而并非作為限制。這樣，本發(fā)明的覆蓋面和范圍不被上述的任何列舉的技術(shù)方案所限制，而應(yīng)當(dāng)根據(jù)下面的權(quán)利要求書和它們的等價(jià)物來(lái)定義。由于應(yīng)當(dāng)明白該
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的人員的可對(duì)形式和細(xì)節(jié)作出各種改變而不背離本發(fā)明的精神和范圍，本申請(qǐng)覆蓋了本發(fā)明的任何改變、使用或適應(yīng)性，總之，是覆蓋了本發(fā)明的原理，并包括背離了本說(shuō)明書但對(duì)本
技術(shù)領(lǐng)域：
是已知的或常用的，并可實(shí)施得到前述的必不可少的特征和遵從所附權(quán)利要求的范圍。權(quán)利要求1.一種用于低溫保存的生物器官的制備方法，包括(a)用梯度增加到第一預(yù)定濃度的低溫保護(hù)劑溶液灌流所述的器官，同時(shí)降低所述器官的溫度；(b)讓所述低溫保護(hù)劑濃度保持足以與所述器官達(dá)到滲透平衡的時(shí)間；和(c)將所述溶液的低溫保護(hù)劑濃度增加到較高的第二預(yù)定濃度，讓所述低溫保護(hù)劑溶液在第二濃度保持足以與所述器官達(dá)到滲透平衡的時(shí)間。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，它進(jìn)一步包括在用濃度逐漸增加的低溫保護(hù)劑灌流所述器官前用沒(méi)有低溫保護(hù)劑的物質(zhì)灌流所述器官。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括用伊洛前列腺素或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1灌流所述的器官。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的第二預(yù)定濃度不是玻璃化所允許的，步驟(c)進(jìn)一步包括在向器官引入可玻璃化濃度的低溫保護(hù)劑前冷凍所述的器官。5.根據(jù)權(quán)利要求1-3或4任一所述的方法，其中所述的器官是腎臟或肝臟。6.根據(jù)權(quán)利要求1-3或4任一所述的方法，其中所述的低溫保存是玻璃化，所述的最終低溫保護(hù)劑濃度使玻璃化可以進(jìn)行。7.一種在器官低溫保存后用于移植的器官的制備方法，包括(a)將所述的器官溫?zé)岬皆试S對(duì)所述器官再灌流的溫度，其中對(duì)所述器官的損傷最?。?b)用非-玻璃化濃度的低溫保護(hù)劑灌流一段時(shí)間，使之足以與所述器官達(dá)成大致的滲透平衡；和(c)基本將所述器官中所用的低溫保護(hù)劑灌流出來(lái)，同時(shí)將所述器官的溫度升高到使所述器官適合移植的溫度。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的低溫保存是通過(guò)玻璃化進(jìn)行。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的低溫保存是冷凍。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，它進(jìn)一步包括在步驟(b)中用非-玻璃化濃度的低溫保護(hù)劑與滲透緩沖劑的結(jié)合灌流所述的器官。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的滲透緩沖劑是低分子量滲透緩沖劑。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的低分子量滲透緩沖劑選自麥芽糖、果糖1，6-二磷酸鉀和鈉、乳糖酸鉀和鈉、甘油磷酸鉀和鈉、棉子糖、麥芽五糖、水蘇糖、蔗糖和甘露醇。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的低分子量緩沖劑是蔗糖。14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的低分子量緩沖劑是甘露醇。15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法其中所述的滲透緩沖劑是高分子量試劑。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的高分子量滲透緩沖劑選自羥乙基淀粉(≤450,000道爾頓)、聚乙烯吡咯烷酮、棉子糖十一烷基乙酸鉀鹽和Ficoll(1,000到100,000道爾頓)。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的高分子量滲透緩沖劑是羥乙基淀粉。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的羥乙基淀粉的分子量約為450,000。19.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，它進(jìn)一步包括用所述的非-玻璃化濃度的低溫保護(hù)劑與一種或多種低分子量和一種或多種高分子量滲透緩沖劑組合灌流所述的器官。20.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，它進(jìn)一步包括用所述的非-玻璃化濃度的低溫保護(hù)劑與一種低分子量和一種高分子量滲透緩沖劑結(jié)合灌流所述的器官。21.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述低分子量滲透緩沖劑的濃度逐步減少到非0值，同時(shí)所述低溫保護(hù)劑的濃度也逐步減少到低于200mM。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的低分子量滲透緩沖劑的濃度被減少到150mM和1,000mM之間。23.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的方法，其中所述的低溫保護(hù)劑的濃度被減少到0。24.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述低分子量滲透緩沖劑的濃度在低溫保護(hù)劑濃度被減少到低于200mM后被逐步減少。25.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的低分子量滲透緩沖劑選自甘露醇和蔗糖，所述的高分子量滲透緩沖劑是羥乙基淀粉(HES)。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中一旦所有的所述低溫保護(hù)劑從所述器官中除去，HES的濃度被逐漸減少到非0水平，而蔗糖濃度被逐步降低到0，甘露醇被同時(shí)灌流入所述的器官。27.根據(jù)權(quán)利要求15、16、18、19或20所述的方法，其中所述的器官是肝臟。28.根據(jù)權(quán)利要求10、19、20、25或26所述的方法，其中所述的器官是腎臟。29.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述的器官是肝臟。30.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中當(dāng)器官是腎臟或肝臟時(shí)，步驟(a)所述的溫度是-3.0℃。31.根據(jù)權(quán)利要求7、10、19或20所述的方法，其中所述的低溫保護(hù)劑的非玻璃化濃度是20-40％(w/v)。32.一種用于灌流器官的組合物，其中所述的組合物可維持所述器官的存活力，所述的組合物包括NaH2PO4·H2O；葡糖酸鉀；葡糖酸鎂；葡萄糖；谷胱甘肽；腺嘌呤苷；HEPES；腺嘌呤；核糖和氯化鈣。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的組合物，進(jìn)一步包括羥乙基淀粉。34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的溶液，其中所述溶液的組份濃度為NaH2PO4·H2O(3.45g/l)；葡糖酸鉀(23.42g/l)；葡糖酸鎂(0.21g/l)；谷胱甘肽(0.92g/l)；腺嘌呤苷氫氯化物(1.34g/l)；HEPES(2.38g/l)；腺嘌呤(0.17g/l)；核糖(0.15g/l)和氯化鈣(0.0056g/l)。35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的溶液，其中所述羥乙基淀粉的濃度是50g/l，葡萄糖的濃度是0.90g/l。全文摘要本發(fā)明涉及器官和組織灌流的領(lǐng)域。更具體的是，本發(fā)明涉及通過(guò)引入玻璃化濃度的低溫保護(hù)劑來(lái)低溫保存的器官，如腎臟和肝臟的器官制備方法。為了制備低溫保存的器官，人或動(dòng)物供體以通常的方法處理，也可用伊洛前列腺素或其它血管舒張劑和/或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1進(jìn)行處理。另一種方法，或另外的是，對(duì)被低溫保存的器官直接將伊洛前列腺素或其它血管舒張劑和/或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1用于動(dòng)脈。本發(fā)明也涉及通過(guò)用低分子量(如棉子糖、蔗糖、甘露醇等)、中等分子量(如分子量為600-20,000的中等分子量)如高分子(如羥乙基淀粉)的滲透緩沖劑除去器官中的低溫保護(hù)劑來(lái)制備移植的器官。本發(fā)明也涉及新的移植后處理，如使用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、N-乙酰基半胱氨酸、亞金基硫代葡萄糖。文檔編號(hào)A01N1/02GK1162900SQ95195669公開(kāi)日1997年10月22日申請(qǐng)日期1995年8月11日優(yōu)先權(quán)日1995年8月11日發(fā)明者G·M·法伊,B·希拉巴迪,Y·奧庫(kù)齊,T·麥齊亞哥申請(qǐng)人:全美紅十字會(huì)