本發(fā)明涉及生物技術領域，特別是涉及一種功能性地檢測抗體介導的器官排異的方法及其應用與試劑盒，用于確定在接受器官移植的病人體內是否產生了導致慢性器官排斥的抗體。

背景技術：

外科移植是目前根治器官衰竭最有效的途徑，它不但需要嚴格廣泛的醫(yī)療護理，還要求器官供者和受者之間的人類組織相容抗原相同以避免受者的免疫系統(tǒng)攻擊外來的組織。如果二者的人類組織相容抗原類型不同，受者體內天然存在或誘導合成的抗體將攻擊移植的器官組織。然而，在臨床實踐中，器官供者和資源十分限制，供者和受者之間的抗原相同程度變異相當巨大。據報道，8－25％的接受器官移植的病人都會產生針對供者特異的抗體即dsa,其中50％的病人在五年內將出現抗體介導的排斥反應并最終導致器官移植失敗。

然而，不是所有的dsa都能介導排斥反應。雖然dsa的某些特性包括亞型、滴度、特異性、結合力及克隆性與致病性有密切關系，但是目前尚無試驗手段直接觀察dsa與供者血管細胞的相互作用。這是鑒定dsa的致病性的關鍵步驟；dsa與供者細胞的相互作用才是決定器官在受者體內生存時間的決定性因素。

迄今為止，luminex公司生產的單抗原微球是臨床上檢測dsa最常用的方法。它評估的原理是在每個微球上均包被不同的人類組織相容抗原，它們可特異性地結合病人血內的dsa，從而確定它們的種類和強度。雖然單抗原微球法可以提供dsa在免疫學上的特性，但是，它不能完全確立dsa在介導細胞功能方面的作用。這在一定程度上限制了它在指導臨床醫(yī)師決策的應有的價值。

c1q單抗原球檢測法是在臨床中使用的鑒定致病性dsa的試驗。c1q受抗體活化并啟動經典補體激活途徑，其產物c4d沉積在組織中導致細胞毒性溶解，造成移植的器官功能喪失。迄今為止，大量科學研究與臨床結果認為補體激活是急性排斥反應的主要途徑，而慢性排斥反應與非補體途徑的激活更相關。

抗體介導的排斥反應是一個極為復雜包含眾多機制的過程。具有致病性的dsa不但要與血管內皮細胞表面的人類組織相容抗原緊密結合，而且能進一步觸發(fā)細胞內的信號傳導通路，才會造成內皮細胞激活。持續(xù)激活的內皮細胞一方面加速釋放炎性因子，另一方面在細胞表面增加粘附蛋白。這些反應的綜合結果是在毛細血管周圍侵潤大量炎性細胞和細胞增殖，進一步發(fā)展為血管阻塞，組織壞死。由此可見，精準評估dsa的致病性必須依賴于dsa與血管內皮細胞的相互作用。

綜上所述，慢性抗體介導的排斥反應是當今器官移植醫(yī)學首要解決的問題，它不僅增加了病人的經濟負擔，而且令移植的器官在體內不能發(fā)揮予期的功能。本發(fā)明建立了洞察dsa與血管內皮細胞相互作用的檢測手段；它可特異地，準確地確定dsa的致病性。

技術實現要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的是解決功能性地檢測抗體介導的器官排異的方法。

所述再構細胞板的血管內皮細胞培養(yǎng)物均具有確定的人類白細胞組織相容抗原譜。確定抗原的方法是提取血管內皮細胞培養(yǎng)物dna，使用微量聚合酶鏈式反應試劑盒，美國onelamda產品，將人類白細胞組織相容抗原分類為：hla－a，hla－b，hla－c，hla－dr，hla－dq，和hla－dp。將所獲得的細胞抗原的信息儲存在數據庫內；確定抗原的細胞凍存在液氮中備用。

本發(fā)明所述的診斷試劑盒使用抗原確定的血管內皮細胞培養(yǎng)物，它們能與dsa特異地結合并被dsa激活。在加入病人血清后，致病性dsa激活細胞內的信號傳導通路，導致細胞表面粘附蛋白表達增加，并釋放引起炎性反應的細胞因子和介質；而非致病性dsa不能激活上述傳導通路。通過測定細胞激活的產物，本試劑盒可準確地區(qū)別致病與非致病性dsa，為臨床醫(yī)師提供了可靠的診斷依據。

本發(fā)明所述的診斷試劑盒使用抗原確定的血管內皮細胞培養(yǎng)物是依據供者白細胞相容抗原分型而選擇的；它們有序地種植在微孔培養(yǎng)板上，為再構細胞板。所述血管內皮細胞為高度選擇性，亦是，所述細胞診斷試劑盒內再構細胞板的設計是由醫(yī)師依據供者的人類白細胞組織相容抗原的類型而為受者特殊制定的。當醫(yī)師申請使用此診斷試劑的同時，亦提交已植入病人體內供者器官的人類白細胞組織相容抗原的分型即hla－a，hla－b，hla－c，hla－dr，hla－dq，hla－dp。依據此抗原分型譜在細胞庫內提取、復蘇、種植表達這些抗原的細胞于96-孔細胞培養(yǎng)微孔板的底部，種植數量為3000-4000活細胞/孔。

本發(fā)明所述的一種功能性地檢測抗體介導的器官排異的方法，包括如下步驟：

(1)依據病人血樣中要鑒定dsa的分型，在細胞庫內選擇表達與dsa類型相對應抗原的血管內皮細胞；

(2)將所述血管內皮細胞種植在96-孔細胞培養(yǎng)微孔板的底部，詳見附圖2，每孔含3000-4000活細胞，所述種植活細胞的微孔板定義為再構細胞板；

(3)向測試的每孔內加入病人血清，在一定條件下孵育一段時間；

(4)收集再構細胞板孔內的上清液，測定血管內皮細胞與血清反應后釋放的生物活性細胞因子；

(5)用體積比4％聚甲醛固定種植在再構細胞板的底部血管內皮細胞，采用免疫熒光組化的方法分析細胞表面粘附分子；

(6)準備試劑盒；

(7)參考試劑盒內提供的陽性與陰性對照血清數值，用于確定病人血清與血管內皮細胞的反應幅度。

本發(fā)明所采用的血管內皮細胞培養(yǎng)物來自正常人群志愿者。

原代細胞自分離培養(yǎng)后，種植于血管內皮細胞板用于測定dsa的細胞傳代次數低于3代。

本發(fā)明采用兩種手段判斷細胞反應終點：

(1)使用免疫酶聯試劑盒定量培養(yǎng)上清液內炎性因子，敏感度為0.1-1.0pg/ml；

(2)使用免疫熒光組化定量細胞表面粘附分子，以同時測定的陰性和陽性標本為對照判定結果。

所述血管內皮細胞培養(yǎng)在本診斷試劑盒中的特征為：

(1)從正常人群組織中分離；

(2)與供者人類白細胞組織相容抗原相同的培養(yǎng)物；

(3)與器官移植受者血清孵育后，具有致病性的dsa可激活損傷血管內皮細胞。

所述血管內皮細胞在dsa刺激下的反應，在診斷試劑盒中的特征為：

(1)使用免疫酶聯法測定上清液內白細胞介素－1β，白細胞介素－2，白細胞介素－6，白細胞介素－8(il-8)，單核細胞趨化蛋白－1(mcp-1)，干擾素，粒單－克隆刺激因子，單核－克隆刺激因子，腫瘤壞死因子－a(tnf－a)；

(2)使用免疫熒光測定細胞表面細胞間粘附分子－1(icam-1)和血管細胞粘附分子(vcam-1)。致病性dsa引發(fā)血管內皮細胞的激活與損傷，因而，增加上述分子的表達與釋放，非致病性dsa不引發(fā)上述分子的改變。

優(yōu)選的，血管內皮細胞表達的人類組織相容抗原與接受器官移植的病人dsa抗體相對應。

優(yōu)選的，所述的一種功能性地檢測抗體介導的器官排異的方法步驟(3)中，所述條件為攝氏溫度35℃－37℃、二氧化碳分壓為4％－5％。

優(yōu)選的，所述的一種功能性地檢測抗體介導的器官排異的方法步驟(3)中，所述病人血清和血管內皮細胞的反應時間是24小時。

優(yōu)選的，人類組織相容抗原的測定使用低分辨分型方法。

優(yōu)選的，血管內皮細胞來自人的新鮮標本，為血管片段、脂肪、肌肉、皮膚、臍帶、肝、肺、腎中的一種。

優(yōu)選的，所述的一種功能性地檢測抗體介導的器官排異的方法的用途是檢測接受器官移植后的病人血液內的dsa是否具有攻擊供者組織的能力的應用。

優(yōu)選的，所述的一種功能性地檢測抗體介導的器官排異的方法的用途是揭示病人慢性抗體介導的排斥反應，鑒別引發(fā)血管內皮細胞活化、調整、以及功能紊亂的體液因子。

優(yōu)選的，所述一種功能性地檢測抗體介導的器官排異的方法的試劑盒，所述試劑盒包括陽性對照血清、陰性對照血清、陽性標準品、空白試劑、再構細胞板、培養(yǎng)液、漢氏磷酸緩沖液、羊血清/磷酸緩沖液、聚甲醛、抗體a、抗體b，白蛋白溶液；其中，所述的陽性標準品、培養(yǎng)液、羊血清/磷酸緩沖液、聚甲醛、白蛋白溶液的組分及配比如下：

陽性標準品：0.1ng/ml腫瘤壞死因子－a；

培養(yǎng)液：egm-2培養(yǎng)液，egm-2培養(yǎng)液內含ham’氏12培基、生長因子添加物；

羊血清/磷酸緩沖液：體積比10％；

聚甲醛：體積比4％。

白蛋白溶液：重量比1％。

優(yōu)選的，所述一種功能性地檢測抗體介導的器官排異的方法的試劑盒，抗體a是羊抗icam-1，抗體b是抗羊fitc于抗體。

所述試劑盒整合了分子生物學和免疫學手段，不僅能定量地分析培養(yǎng)上清液內的可溶性分子，而且能測定血管內皮細胞在dsa刺激下其表面的反應分子。

由以上本發(fā)明提供的技術方案可見，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)該試劑盒用于鑒定能導致血管內皮激活和損傷的dsa；

(2)該試劑盒所檢測的dsa分型是特異性，是確定的，例如，抗a11、抗b44；

(3)該試劑盒用于檢測接受器官后的病人血內dsa功能性，亦即導致dsa引發(fā)血管內皮細胞的激活與損傷；

(4)該試劑盒為臨床醫(yī)生提供診斷病情的依據；

(5)該試劑盒為臨床醫(yī)生提供診斷病情的依據早于病理活檢、影像學和臨床癥狀；

(6)該試劑盒依據抗原－抗體反應原理測定dsa，結果是特異的；

(7)該試劑盒使用基于免疫酶聯和免疫組化定量反應結果具有高度靈敏性和精確性。

本發(fā)明首次建立了模擬毛細血管的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，檢測dsa與所述細胞的相互作用，從而在功能的角度上鑒定dsa的致病性。本發(fā)明所建立體外診斷方法不僅填補dsa功能檢測的空白，而且完善現行的在實驗室內評估抗體介導的排斥反應應有的環(huán)節(jié)。

附圖說明

圖1為實施例4中的pcr電泳圖譜。

圖2為制作血管內皮細胞板的96-微孔細胞板。

圖3為實施例5中的制作再構血管內皮細胞板的96-微孔細胞板圖。

圖4為實施例9中的dsa誘發(fā)的mcp-1釋放圖。

圖5為實施例9中的dsa誘發(fā)的il-8釋放圖。

圖6為實施例9中的dsa誘發(fā)的細胞表面icam-1的表達圖。

圖7為實施例10中的制作再構血管內皮細胞板的96-微孔細胞板圖。

圖8為實施例10中的dsa誘發(fā)的mcp-1釋放圖。

圖9為實施例10中的dsa誘發(fā)的il-8釋放圖。

圖10為實施例10中的dsa誘發(fā)的細胞表面icam-1的表達圖。

圖11為實施例11中的制作再構血管內皮細胞板的96-微孔細胞板圖。

圖12為實施例12中的dsa誘發(fā)的mcp-1釋放圖。

圖13為實施例12中的dsa誘發(fā)的il-8釋放圖。

圖14為實施例12中的dsa誘發(fā)的細胞表面icam-1的表達圖。

陽－陽性對照血清，陰－陰性對照血清，tnf－陽性標準品，空－空白試劑。

具體實施方式

為了使本技術領域的人員更好地理解本發(fā)明方案，下面結合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細說明：

實施例1血管內皮細胞的分離

經外科手術無菌獲得的實體組織置于富含培養(yǎng)基內，在3－5小時內轉送至加工室。依據實體組織的性質，采用不同的處理方案。

(1)對于不完整組織如血管片段，脂肪，肌肉，皮膚，部分臟器，臍帶，將采用直接消化收集細胞。具體步驟為：將組織剪碎至1立方毫米的碎塊，清洗并移除全部血液，置于含體積比1％膠原酶的培養(yǎng)基內解體組織，在攝氏溫度37℃下孵育0.5－1小時，機械地松散被消化的組織并用紗布分離單細胞和殘余組織。在使用離心方法去除膠原酶。

(2)對于有血管連接的完整器官如肝、肺、腎等，用器官灌流的途徑收集血管內皮細胞。依據器官血管的大小，將不同孔徑的乳膠管與之結扎。在反復使用生理鹽水沖洗組織后，在攝氏溫度37℃下灌流0.5－1小時。機械地松散被消化的組織并用紗布分離單細胞和殘余組織。在使用離心方法去除膠原酶后，收集單細胞懸液備用。

實施例2血管內皮細胞的培養(yǎng)

將實施例1所得的單細胞懸液置于含體積比20％胎牛血清、15毫克/毫升內皮細胞生長刺激添加物(ecgs)、50單位/毫升肝素，100單位/m1青霉素一100單位/m1鏈霉素的培養(yǎng)基內，接種于涂有1％明膠的培養(yǎng)瓶中，放于攝氏溫度35℃、體積比4％c02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后更換培養(yǎng)液。

實施例3血管內皮細胞的凍存

當細胞的生長達到覆蓋培養(yǎng)瓶內90％的表面積時，使用濃度為體積比0.05％胰蛋白酶－乙二胺四乙酸二鈉鹽(edta)消化液將細胞從培養(yǎng)瓶表面脫落。在離心移除殘余酶后，將細胞懸浮于含濃度為體積比5％dmso的培養(yǎng)液內，以1－2℃/分鐘的速度逐步降低上述液體的溫度至-80℃，隨后轉入液氮罐內保存。

實施例4用低分辨pcr試劑分型血管內皮細胞的人類白細胞組織相容抗原

使用離心的方法收集內皮細胞，按照dna純化試劑盒創(chuàng)作規(guī)程(invitrogen，#10503027，美國)，加入細胞裂解液，提取dna。測定樣本的a260/a280比值，如大于1.8時，符合質量要求。使用微量pcr試劑盒(ssp，onelamda,加利福尼亞，美國)確定人類白細胞組織相容抗原的類型。具體方法為：在反應液內加入100ng/μldna樣本，pcr反應基質，tagdna多聚酶，水，依照設定下述循環(huán)溫度和擴增時間擴增：

起始變性期:94℃，兩分鐘；

第一期：變性94℃，10秒；退火和延伸65℃，60秒，共10個循環(huán)；

第二期：變性94℃，10秒；退火61℃，50秒；延伸72℃，30秒，共20個循環(huán)。將pcr產物在濃度為重量比1％的瓊脂膠分離。如附圖1所示，瓊脂膠呈現抗原特異性的電泳帶譜。依據pcr試劑生產者提供的參考圖譜，確定白細胞組織相容抗原的分型。

實施例5制備人類白細胞組織相容抗原確定的再構細胞板

依據病人dsa結果和器官移植供者人類白細胞組織相容抗原結果，臨床醫(yī)師和實驗室科學家共同制定的血管內皮細胞檢測方案和制定細胞板編碼。表1顯示了實施例5中該編碼如何定位每株細胞在96-孔細胞培養(yǎng)微孔板(如圖2)上的位置(如圖3)。將欲使用的血管內皮細胞復蘇后，懸浮于內皮細胞生長培基中。按照細胞板編碼，在涂有細胞粘附基質的96-孔細胞培養(yǎng)微孔板的底部，種植具有不同人類白細胞相容抗原的細胞，數量為3，000－4，000活細胞。每株細胞重復三孔。

表1為制作血管內皮細胞板的96-微孔細胞板的編碼。表1中陽對為陽性對照血清的縮寫，陰對為陰性對照血清縮寫，空白為空白試劑的縮寫，tnf為陽性標準品的縮寫。

表1

實施例6dsa介導的血管內皮細胞激活的測定方法和結果評估

(1)標本收集與制備

用于檢測的標本是1ml血清。通常情況下，5ml病人靜脈全血加入不加任何添加劑的試管內，室溫置放30分鐘后離心收集血清。在特殊情況下，可用肝素抗凝的血漿。乙二胺四乙酸和檸檬酸鈉抗凝血禁止使用本試劑盒。

在使用前30－60分鐘內，使用培養(yǎng)基制備含體積比20％病人血清的溶液作為檢體。同時，使用相同培養(yǎng)基制備含體積比20％對照陽性血清和陰性血清的溶液。陽性標準品為含0.1ng/mltnf－α的細胞培養(yǎng)液；空白對照為細胞培養(yǎng)液。

(2)血管內皮細胞板的預處理

在試驗前10－12小時更換培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下觀察生長狀態(tài)。

(3)步驟

去除細胞培養(yǎng)上清，將病人標本，陽性血清對照標本，陰性血清對照標本，陽性標準品對照和空白對照按細胞板編碼位置相應地加入96-孔細胞培養(yǎng)微孔板。輕微混勻后，放于攝氏溫度37℃、體積比5％c02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時后，首先收集培養(yǎng)上清以測定細胞炎性因子；然后用漢氏磷酸緩沖液沖洗血管內皮細胞板兩遍以定量細胞表面粘附分子。向所有的含細胞的孔內加入體積比4％多聚甲醛以固定細胞，5分鐘后，移除固定液，用10％羊血清封閉細胞。接著使用cy－3標記的抗人vcam-1和cy－5標記的抗人icam-1染色。完成免疫組化染色后，將96-孔細胞培養(yǎng)微孔板插入細胞成像系統(tǒng)(美國spectramaxplus,moleculardevice),在soft－maxpro分析軟件下，獲得每孔內的熒光強度。

(4)數據收集與結果分析

依據陽性標準品對照和空白對照的光密度(免疫酶聯法)和熒光強度(免疫熒光法)，以判斷是否需要進一步的參數調整。當陽性和陰性血清對照標本的光密度比值>5，熒光強度>3時，說明所種植的血管內皮細胞具有區(qū)分致病性dsa的反應性。檢測樣品標本結果的計算方法為病人血清/陰性血清的比值，評判的標準如下，見表2：

表2

實施例7dsa介導的血管內皮細胞激活的測定方法和結果評估

(3)去除細胞培養(yǎng)上清，將病人標本，陽性血清對照標本，陰性血清對照標本，陽性標準品對照和空白對照按細胞板編碼位置相應地加入96-孔細胞培養(yǎng)微孔板。輕微混勻后，放于攝氏溫度35℃、體積比4％c02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其余步驟同實施例6。

實施例8dsa介導的血管內皮細胞激活的測定方法和結果評估

(3)去除細胞培養(yǎng)上清，將病人標本，陽性血清對照標本，陰性血清對照標本，陽性標準品對照和空白對照按細胞板編碼位置相應地加入96-孔細胞培養(yǎng)微孔板。輕微混勻后，放于攝氏溫度36℃、體積比4.5％c02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其余步驟同實施例6。

實施例9實例分析1

1.血管內皮細胞板的設計和制作

(1)依據臨床醫(yī)師和實驗室科學家共同制定的血管內皮細胞檢測方案制定血管內皮細胞板編碼－在獲得病人的知情同意后，臨床醫(yī)師將病人(#2105)的抗體分析結果和器官供者(#0096)材料送至臨床實驗室。依據抗體在器官移植前、后的變化，醫(yī)師確定病人#2105具有如下dsa：a31，b5，dr3和dq4。詳見表3。

表3

(2)依據供者人類白細胞抗原分型，實驗室工作人員從細胞庫內提取表達a2，a31，b5，b35，dr3，dr8，dq4和dq5的血管內皮細胞。

(3)在圖3所示的位置種植相應的細胞

在a1-3孔內種植表達a2的血管內皮細胞；

在b1-3孔內種植表達a31的血管內皮細胞；

在c1-3孔內種植表達b5的血管內皮細胞；

在d1-3孔內種植表達b35的血管內皮細胞；

在e1-3孔內種植表達dr3的血管內皮細胞；

在f1-3孔內種植表達dr8的血管內皮細胞；

在g1-3孔內種植表達dq4的血管內皮細胞；

在h1-3孔內種植表達dq5的血管內皮細胞；

在a4-6孔內種植陽性對照血管內皮細胞；

在b4-6孔內種植陰性對照血管內皮細胞；

在c4-6孔內種植混合血管內皮細胞；

在d4-6孔內種植混合血管內皮細胞。

(4)在a1-3，b1-3，c1-3，d1-3，e1-3，f1-3，g1-3和h1-3孔內加入體積比20％病人血清培養(yǎng)液；在a4-6孔內加入體積比20％陽性對照血清培養(yǎng)液；在b4-6孔內加入體積比20％陰性對照血清培養(yǎng)液；在c4-6孔內加入陽性標準品0.1ng/mltnf－α的細胞培養(yǎng)液；在d4-6孔內加入細胞培養(yǎng)液。

(5)放于攝氏溫度37℃、體積比5％c02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后。

(6)收集培養(yǎng)上清以測定可溶分子。

(7)用漢氏磷酸鹽緩沖液沖洗血管內皮細胞板兩遍，加入體積比4％多聚甲醛固定液。

(8)5分鐘后，移除固定液。

(9)用10％羊血清/生理鹽水封閉細胞。

2.使用免疫酶聯試劑盒測定上清液內mcp-1，結果如圖4所示。

3.使用免疫酶聯試劑盒測定上清液內il-8，結果如圖5所示。

4.使用免疫組化法定量細胞表面icam-1的表達，結果如圖6所示。

5.結果分析表明，如表4，a31，dq4是強致病性dsa；b5的致病性可疑，它可引發(fā)細胞釋放反應因子，但未導致細胞表面粘附因子表達增加。a2，b35，dr3，dr8和dq5未見激活內皮細胞培養(yǎng)物。

表4

實施例10實例分析2

1.血管內皮細胞板的設計和制作

(1)依據臨床醫(yī)師和實驗室科學家共同制定的血管內皮細胞檢測方案制定血管內皮細胞板編碼－在獲得病人的知情同意后，臨床醫(yī)師將病人(#2106)的抗體分析結果和器官供(#0097)材料送至臨床實驗室。依據抗體在器官移植前、后的變化，醫(yī)師確定病人#2106具有如下dsa：a3，b7，和dr7。詳見表5。

表5

(2)依據供者人類白細胞抗原分型，實驗室工作人員從細胞庫內提取表達a3，a24，b7，b13，dr7，dr11，dq5和dq6的血管內皮細胞。

(3)在圖7所示的位置種植相應的細胞

在a1-3孔內種植表達a3的血管內皮細胞；

在b1-3孔內種植表達a24的血管內皮細胞；

在c1-3孔內種植表達b7的血管內皮細胞；

在d1-3孔內種植表達b13的血管內皮細胞；

在e1-3孔內種植表達dr7的血管內皮細胞；

在f1-3孔內種植表達dr11的血管內皮細胞；

在g1-3孔內種植表達dq5的血管內皮細胞；

在h1-3孔內種植表達dq6的血管內皮細胞；

在a4-6孔內種植陽性對照血管內皮細胞；

在b4-6孔內種植陰性對照血管內皮細胞；

在c4-6孔內種植混合血管內皮細胞；

在d4-6孔內種植混合血管內皮細胞。

(4)在a1-3，b1-3，c1-3，d1-3，e1-3，f1-3，g1-3和h1-3孔內加入體積比20％病人血清培養(yǎng)液；在a4-6孔內加入體積比20％陽性對照血清培養(yǎng)液；在b4-6孔內加入體積比20％陰性對照血清培養(yǎng)液；在c4-6孔內加入陽性標準品0.1ng/mltnf－α的細胞培養(yǎng)液；在d4-6孔內加入細胞培養(yǎng)液。

(5)放于攝氏溫度35℃、體積比4％c02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后。

(6)收集培養(yǎng)上清以測定可溶分子。

(7)用漢氏磷酸鹽緩沖液沖洗血管內皮細胞板兩遍，加入體積比4％多聚甲醛固定液。

(8)5分鐘后，移除固定液。

(9)用10％羊血清/生理鹽水封閉細胞。

2.使用免疫酶聯試劑盒測定上清液內mcp-1，結果如圖8所示。

3.使用免疫酶聯試劑盒測定上清液內il-8，結果如圖9所示。

4.使用免疫組化法定量細胞表面icam-1的表達，結果如圖10所示。

5.結果分析表明，如表6，a3，b7,dr7是強致病性dsa。

表6

實施例11實例分析3

1.血管內皮細胞板的設計和制作

(1)依據臨床醫(yī)師和實驗室科學家共同制定的血管內皮細胞檢測方案制定血管內皮細胞板編碼－在獲得病人的知情同意后，臨床醫(yī)師將病人(#2107)的抗體分析結果和器官供(#0098)材料送至臨床實驗室。依據抗體在器官移植前、后的變化，病人#2107具有如下dsa:a26，b18，b67，dr7，dr15，和dq7。詳見表7。

表7

(2)依據供者人類白細胞抗原分型，實驗室工作人員從細胞庫內提取表達a3，a26，b18，b67，dr7，dr15，dq2和dq7的血管內皮細胞。

(3)在圖11所示的位置種植相應的細胞

在a1-3孔內種植表達a3的血管內皮細胞；

在b1-3孔內種植表達a26的血管內皮細胞；

在c1-3孔內種植表達b18的血管內皮細胞；

在d1-3孔內種植表達b67的血管內皮細胞；

在e1-3孔內種植表達dr7的血管內皮細胞；

在f1-3孔內種植表達dr15的血管內皮細胞；

在g1-3孔內種植表達dq2的血管內皮細胞；

在h1-3孔內種植表達dq7的血管內皮細胞；

在a4-6孔內種植陽性對照血管內皮細胞；

在b4-6孔內種植陰性對照血管內皮細胞；

在c4-6孔內種植混合血管內皮細胞；

在d4-6孔內種植混合血管內皮細胞。

(4)在a1-3，b1-3，c1-3，d1-3，e1-3，f1-3，g1-3和h1-3孔內加入體積比20％病人血清培養(yǎng)液；在a4-6孔內加入體積比20％陽性對照血清培養(yǎng)液；在b4-6孔內加入體積比20％陰性對照血清培養(yǎng)液；在c4-6孔內加入陽性標準品0.1ng/mltnf－α的細胞培養(yǎng)液；在d4-6孔內加入細胞培養(yǎng)液。

(5)放于攝氏溫度36℃、體積比4.5％c02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后。

(6)收集培養(yǎng)上清以測定可溶分子。

(7)用漢氏磷酸鹽緩沖液沖洗血管內皮細胞板兩遍，加入體積比4％多聚甲醛固定液。

(8)5分鐘后，移除固定液。

(9)用10％羊血清/生理鹽水封閉細胞。

2.使用免疫酶聯試劑盒測定上清液內mcp-1，結果如圖12所示。

3.使用免疫酶聯試劑盒測定上清液內il-8，結果如圖13所示。

4.使用免疫組化法定量細胞表面icam-1的表達，結果如圖14所示。

5.結果分析表明，如表8，a26，b18，dr15，dq7是強致病性dsa；b67，dr7的致病性可疑，它在引發(fā)細胞釋放反應因子或導致細胞表面粘附因子表達增加方面未達到預定標準。a3和dq2未見激活內皮細胞培養(yǎng)物。

表8

實施例12試劑盒的制備方法

(一)制備以下試劑：

1.從正常人群中收集血清，使用單抗原微球法測定和質量控制步驟確定(1)陽性對照血清；(2)陰性對照血清。將陽性對照血清和陰性對照血清分別分裝于1毫升凍存管，在攝氏溫度-80℃下保存。

2.將腫瘤壞死因子－a，陽性標準品，溶于體積比1％人白蛋白磷酸緩沖液內，分裝于1毫升凍存管，在攝氏溫度-80℃下保存。

3.空白試劑是分裝體積比1％人白蛋白磷酸緩沖液于1毫升凍存管，在攝氏溫度-80℃下保存。

4.體積比10％羊血清的配制方法：按1:9比例將羊血清與0.9％氯化鈉溶液混合，分裝后在攝氏溫度-20℃下保存。

5.將100微升羊抗icam-1抗體分裝于1毫升凍存管，在攝氏溫度-80℃下保存。將10微升抗羊連接fitc于抗體分裝于1毫升凍存管，在攝氏溫度-80℃下保存。

6.體積比4％聚甲醛配制方法：按1:3比例將16％聚甲醛與0.9％氯化鈉溶液混合，分裝后在室溫下保存。

7.重量比1％白蛋白溶液的配制方法：稱取1克白蛋白，溶于100毫升磷酸緩沖液中，分裝后在攝氏溫度-20℃下保存。

(二)準備以下試劑和材料，包括egm-2培養(yǎng)液和漢氏磷酸緩沖液，egm-2培養(yǎng)液和漢氏磷酸緩沖液是商業(yè)化的產品，不用制備。

試劑盒組裝－將如下產品包裝在共同的盒內，攝氏溫度-80℃保存：

(1)陽性對照血清；(2)陰性對照血清；(3)陽性標準品(0.1ng/ml腫瘤壞死因子－a)；(4)空白試劑。

試劑盒組裝－將如下產品包裝在共同的盒內，室溫下保存：

(1)再構血管內皮細胞板；(2)體積比4％聚甲醛溶液：(3)漢氏磷酸緩沖液；(4)egm-2培養(yǎng)液。

試劑盒組裝－將如下產品包裝在共同的盒內，攝氏溫度4℃下保存：

(1)體積比10％羊血清磷酸緩沖液；(2)抗體a－羊抗icam-1；(3)抗體b－抗羊fitc于抗體。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。