【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明是關(guān)于針對(duì)cd4之單克隆抗體介導(dǎo)競(jìng)爭(zhēng)型hiv進(jìn)入抑制、其組合物，以及使用此組合物治療和功能性治愈hiv感染的方法。

背景技術(shù)：

獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmunedeficiencysyndrome，aids)是一種由人類(lèi)免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)所引起之人類(lèi)免疫系統(tǒng)的疾病(http://en.wikipedia.org/wiki/hiv/aids)。基因研究指出hiv于十九世紀(jì)晚期或二十世紀(jì)早期起源于非洲中西部。aids最早是于1981年由美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心所辨識(shí)，且其原因，hiv，在1980年代初被鑒別。由于疫情的開(kāi)始，已有超過(guò)70萬(wàn)人感染hiv，且已有35萬(wàn)人死于aids。在全球，截至2011年底已有34.0萬(wàn)人感染hiv(http://www.who.int/gho/hiv/en/)。

hiv感染逐漸地降低免疫系統(tǒng)的效力，且使個(gè)體容易受到機(jī)會(huì)性感染和產(chǎn)生腫瘤。hiv可透過(guò)粘膜或是具有含有hiv之體液(例如血液、精液、陰道液、射精前液體和母乳)的血液直接接觸而傳播。這種傳播可涉及肛門(mén)、陰道或口交、輸血、受污染的注射針頭、母親與嬰兒于懷孕、分娩或母乳喂養(yǎng)期間之交流，或是于上述之體液中其它方式的暴露。

30年來(lái)，科學(xué)家們認(rèn)為aids是由“制造病毒”的cd4t細(xì)胞所引起，而非靜默t細(xì)胞。但是這些“制造病毒”的受感染的細(xì)胞并不足以去解釋于發(fā)展aids之患者體中t細(xì)胞的大量耗竭。greene和其同僚指出95％的靜默淋巴cd4t細(xì)胞是死于細(xì)胞焦亡(pyroptosis)，而其是由失敗的病毒感染所引發(fā)(doitsh，g.etal.2014)。此些細(xì)胞具有細(xì)胞質(zhì)病毒dna，但不像變成病毒-復(fù)制單位的t細(xì)胞，這些“hiv感染的”靜默t細(xì)胞被涉及前發(fā)炎性細(xì)胞激素釋放之程序性細(xì)胞死亡(細(xì)胞焦亡)的高度炎癥形式所自毀。此細(xì)胞蛋白，γ干擾素誘導(dǎo)蛋白16(interferon-gamma-inducibleprotein16，ifi16)，可辨認(rèn)病毒dna并于t細(xì)胞引發(fā)一連串反應(yīng)(包含介導(dǎo)細(xì)胞焦亡之caspase-1酶活化，且造成細(xì)胞腫脹、細(xì)胞膜通透性和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物泄漏)。靜默t細(xì)胞的自毀無(wú)益于殺死病毒。此過(guò)程最終導(dǎo)致hiv致病機(jī)理轉(zhuǎn)以推進(jìn)病程至aids。

現(xiàn)行用以延遲aids發(fā)生之hiv感染的治療是由高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法或haart(highlyactiveantiretroviraltherapy)組成，以防止病毒復(fù)制?，F(xiàn)行優(yōu)選的haart包含聯(lián)合療法(或“雞尾酒”)，其由屬于至少兩種類(lèi)抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物中的至少三個(gè)藥物所組成(聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(combinationantiretroviraltherapy，cart))。典型治療方案包含兩個(gè)核苷類(lèi)似物反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nartis或nrtis)加上一個(gè)蛋白酶抑制劑或非核苷類(lèi)反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nnrti)。

在發(fā)達(dá)國(guó)家，當(dāng)決定要何時(shí)推薦開(kāi)始haart治療時(shí)，醫(yī)生會(huì)評(píng)估病毒量、cd4t細(xì)胞數(shù)量、cd4陽(yáng)性細(xì)胞減少速度和患者準(zhǔn)備就緒。一般來(lái)說(shuō)，會(huì)建議對(duì)cd4t細(xì)胞數(shù)量下降至每毫升血液200-250細(xì)胞之無(wú)癥狀的患者進(jìn)行治療。然而，越早開(kāi)始治療(于cd4水平為350個(gè)細(xì)胞/微升下)可顯著地減少aids的風(fēng)險(xiǎn)和死亡。

在沒(méi)有治療的狀況下，評(píng)估感染hiv后之凈存活期中位數(shù)為9至11年，此取決于hiv亞型；且aids診斷后之平均存活率范圍介于6至19個(gè)月。在廣泛使用haart治療的地區(qū)，此疾病的死亡率減少了80％，其轉(zhuǎn)而增加新確診hiv感染患者的預(yù)期壽命至約20年。

haart的標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)包括患者生活品質(zhì)的改善、并發(fā)癥的減少，以及將hiv病毒血癥減少至低于檢測(cè)極限。

然而，haart治療存在多種問(wèn)題。首先，其無(wú)法治愈hiv感染的患者，一旦停止治療也無(wú)法避免大多數(shù)“haart抗藥性”的hiv回復(fù)至高血液水平。第二，haart具有包含倦怠、無(wú)力、腹瀉、頭痛、惡心和嘔吐之討人厭的副作用。從長(zhǎng)期來(lái)看，hiv感染的患者可能經(jīng)歷神經(jīng)認(rèn)知障礙癥、骨質(zhì)疏松癥、神經(jīng)病變、癌癥、腎病和心血管疾病。盡管較新的抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物比較舊的藥物具有較少的副作用，終生使用仍然會(huì)造成不良的結(jié)果。無(wú)法規(guī)則服藥意謂hiv反彈、抗藥性和疾病進(jìn)程。第三，就達(dá)到超過(guò)50％以上患者而言，haart之表現(xiàn)遠(yuǎn)較理想結(jié)果差，此乃因?yàn)樗幬锊荒桶Y、過(guò)去無(wú)效的抗病毒治療，以及hiv之抗藥性病毒株的感染。

越來(lái)越多研究人員研究如何治愈hiv感染，或至少達(dá)成無(wú)抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療下之長(zhǎng)期或永久緩解。

兩種治療策略，消除性(即根除)和功能性治愈為針對(duì)hiv感染之現(xiàn)行研究(如表1所示)。消除性治愈方法目的是消除所有hiv感染的細(xì)胞，由體內(nèi)完全地清除hiv，且定義為其可減少病毒量至每毫升血液低于1個(gè)拷貝。功能性治愈目的是hiv的緩解狀態(tài)與長(zhǎng)期控制，包含于無(wú)抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法下的低病毒量，其于永久或延長(zhǎng)的期間內(nèi)可減少病毒量至每毫升血液低于50個(gè)拷貝。

“消除性治愈”現(xiàn)行唯一的例子是來(lái)自一名感染hiv男子的案例研究，此人被昵稱(chēng)為“柏林患者”，其罹患急性骨髓性白血病，且接受來(lái)自具有ccr5基因之突變或不同形式的捐贈(zèng)者的骨髓移植。于停止治療45個(gè)月后，醫(yī)生已無(wú)法于其體內(nèi)偵測(cè)到hiv。然而，采用具有ccr5突變之捐贈(zèng)者的骨髓移植策略并非可行的hiv治愈方法，此策略帶來(lái)毒性和治療的復(fù)雜性。可于精英的控制者發(fā)現(xiàn)“功能性治愈”之自然案例。精英的控制者是指感染hiv的個(gè)體，其免疫系統(tǒng)可自然地控制病毒而無(wú)須使用抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物。此個(gè)體成功地維持穩(wěn)定的cd4(白血球)細(xì)胞數(shù)量、低或低于檢測(cè)極限的病毒量，以及于其細(xì)胞中顯著較低量之“潛伏的hiv”。

事實(shí)上，治愈的主要障礙是“潛伏hiv病毒庫(kù)”之存在，其潛伏在免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(例如記憶細(xì)胞)內(nèi)，于抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療期間具有長(zhǎng)的壽命，而此種治療可藉由阻斷復(fù)制作用而作用于活躍的病毒感染而非潛伏的hiv。然而，若停用此種抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療，潛伏的hiv可能會(huì)被活化，以更新hiv感染的過(guò)程。

針對(duì)此些“有問(wèn)題的”潛伏hiv病毒庫(kù)的現(xiàn)行策略包含致力于haart治療下透過(guò)病毒表達(dá)之活化以耗竭潛伏病毒庫(kù)，以滅絕感染的細(xì)胞，只留下未受感染的細(xì)胞。有一群活化劑為組蛋白脫乙酰酶(histonedeacetylase，hdac)抑制劑(請(qǐng)參見(jiàn)表2)。目前，以hdac抑制劑作為情緒穩(wěn)定劑、抗癲癇藥物和抗癌治療之使用。hdac抑制劑之長(zhǎng)期影響在于提高惡性腫瘤及/或致癌基因再活化的風(fēng)險(xiǎn)，此仍為主要問(wèn)題。如果以聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(cart)可完全地抑制活躍的病毒復(fù)制，則此策略可行。到目前為止，這些努力尚未能達(dá)成長(zhǎng)期的病毒抑制或功能性治愈。

于hiv感染之人體用以限制或減少潛伏hiv病毒庫(kù)大小的兩個(gè)計(jì)劃涉及(1)加強(qiáng)治療(藉由對(duì)患者治療方案加入新的art藥物)，以及(2)早期治療(藉由感染后立即地開(kāi)始art)。多個(gè)試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)于hiv感染的早期急性期而非慢性晚期開(kāi)始cart，hiv感染細(xì)胞的數(shù)量可顯著地下降。

總之，對(duì)用于hiv治療之有效和安全的藥物具有高度需求(不論是提供作為單獨(dú)使用或是作為對(duì)cart的輔助使用)，此些藥物(1)于無(wú)細(xì)胞(cell-free)和細(xì)胞間(cell-to-cell)傳播模式中均可阻斷hiv進(jìn)入，顯著地減少活化或靜默cd4t細(xì)胞(包含那些長(zhǎng)壽的記憶t細(xì)胞)之hiv感染；(2)特異性地再活化hiv感染的靜默cd4t細(xì)胞以釋出hiv，導(dǎo)致潛伏感染細(xì)胞的細(xì)胞凋亡；及/或(3)當(dāng)抗原/細(xì)胞激素刺激時(shí)抑制hiv感染的靜默cd4t細(xì)胞活化/發(fā)炎，此種活化發(fā)生之時(shí)可引起細(xì)胞焦亡和正常cd4陽(yáng)性t細(xì)胞的大量耗竭，因而導(dǎo)致aids。對(duì)hiv感染之功能性或消除性治愈之一致努力以導(dǎo)致后續(xù)無(wú)cart下之長(zhǎng)期或永久緩解，此為全球公共衛(wèi)生的重要議題，并正于世界各地積極地探究中，且如果可行，此將在hiv感染治療方面實(shí)現(xiàn)突破性重大變革。

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是針對(duì)用以預(yù)防、治療，及/或功能性治愈hiv感染的組合物和方法。本發(fā)明之一方面是關(guān)于針對(duì)cd4之單克隆抗體、其組合物，以及使用此組合物以預(yù)防、治療，和功能性治愈hiv感染的方法。

本發(fā)明之一方面是關(guān)于針對(duì)cd4之抗體、其組合物，以及使用此組合物以預(yù)防、治療，及/或功能性治愈hiv感染的方法。在某些實(shí)施方案中，此抗體可特異性地結(jié)合位于cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域。于無(wú)細(xì)胞和細(xì)胞間的系統(tǒng)中，本發(fā)明抗體透過(guò)其結(jié)合至cd4的結(jié)構(gòu)域1而展現(xiàn)有效的競(jìng)爭(zhēng)型hiv進(jìn)入抑制。本發(fā)明之抗體也可抑制抗原引起的t細(xì)胞增生和cd4陽(yáng)性t細(xì)胞的細(xì)胞激素制造(il2和ifn-gamma)，其涉及細(xì)胞焦亡的致病循環(huán)。本發(fā)明抗體也具有再活化靜默cd4陽(yáng)性t細(xì)胞的能力。此特性對(duì)靜默t細(xì)胞中潛伏hiv病毒庫(kù)的再活化特別有用，可使這些細(xì)胞對(duì)抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療敏感。為了釋放hiv，此種對(duì)cd4高親和力之抗體可活化靜默的hiv感染細(xì)胞。hiv感染靜默cd4+t細(xì)胞的再活化允許于hiv感染患者使用合并本發(fā)明抗體與haart的合并治療，以達(dá)成功能性治愈。

本發(fā)明是針對(duì)用以治療、預(yù)防，和功能性治愈hiv感染的方法。在某些實(shí)施方案中，此劑型包含針對(duì)cd4之抗體。本發(fā)明也包含可用于治療、預(yù)防，和功能性治愈hiv感染之方法的抗病毒藥物。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明是關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類(lèi)、人源化或嵌合，抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，當(dāng)以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約10mg/kg或更高之劑量投予作為單一藥物治療時(shí)，此種治療可使接受治療之受試者的病毒量減少至低于檢測(cè)極限，且只要血清抗體水平高于10μg/ml即無(wú)病毒量反彈。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明是關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其可作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，當(dāng)以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約10mg/kg或更高之劑量投予未使用治療藥物之hiv患者，將達(dá)成患者的功能性治愈。

【附圖說(shuō)明】

圖1系競(jìng)爭(zhēng)型與非競(jìng)爭(zhēng)型hiv進(jìn)入抑制機(jī)制。圖1a系顯示于競(jìng)爭(zhēng)型hiv進(jìn)入抑制模型中所提供理論結(jié)果的曲線(xiàn)圖，在此，hiv包膜蛋白gp120和抑制劑(例如抗體藥物)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于一個(gè)共同目標(biāo)表面分子上的相同位置(即cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2)。在此模型中，當(dāng)此抑制劑濃度達(dá)到某個(gè)閥值時(shí)可達(dá)成hiv結(jié)合/進(jìn)入的100％抑制。相較之下，圖1b系顯示于非競(jìng)爭(zhēng)型hiv進(jìn)入抑制模型中所提供理論結(jié)果的曲線(xiàn)圖，在此，hiv和抑制劑結(jié)合至位于相同目標(biāo)分子上的不同位置(例如cd4的結(jié)構(gòu)域2對(duì)于tmb-355)。在此非競(jìng)爭(zhēng)型抑制模型中，抑制劑可減少hiv結(jié)合/進(jìn)入，但不論抑制劑之濃度為何都無(wú)法達(dá)成完全抑制。不論藥物濃度為何，作為于％抑制之“高原”反映了hiv對(duì)抗體藥物的抗藥性。

圖2系來(lái)自利用tmb-355對(duì)一組涵蓋11個(gè)進(jìn)化支的118種不同hiv-1env假型病毒株的hiv進(jìn)入抑制的結(jié)果(pace，g，etal.，2011)。對(duì)每一種病毒而言，黑線(xiàn)是指當(dāng)以濃度達(dá)到10μg/ml之tmb-355處理時(shí)的最大抑制百分比(mpi)(請(qǐng)參見(jiàn)左邊的y軸)；且灰線(xiàn)是指相對(duì)應(yīng)的ic50(請(qǐng)參見(jiàn)右邊的y軸)。tmb-355以≥50％抑制中和了92％的病毒株，且以≥95％抑制只中和了31％的病毒株。

圖3系來(lái)自利用mabb4對(duì)在10年間所收集的一組超過(guò)850種env假型hiv病毒株的hiv進(jìn)入抑制的結(jié)果。mabb4于hiv進(jìn)入抑制提供了廣泛性與效力，其于所有850種env假型病毒株具有接近100％最大抑制百分比(mpi)，且具有兩個(gè)ic50濃度(一個(gè)是介于0.01至1μg/ml，且第二個(gè)是約10μg/ml)。

圖4系mabdb4c7抗體fv區(qū)域之重鏈的完整氨基酸序列(seqidno：7)，其于ub-421中使用。代表衍生自其親本鼠源b4抗體之相對(duì)應(yīng)cdr1、2和3區(qū)域的序列在下方劃有底線(xiàn)(表4，seqidnos：1至3)?？勺儏^(qū)和恒定區(qū)分別以淺灰色和深灰色陰影表示(分別為seqidnos：11和12)。以重鏈上位于第101個(gè)氨基酸殘基asn(n)作為n-糖化點(diǎn)，此對(duì)于其fv區(qū)域位置具有獨(dú)特性，對(duì)b4抗體結(jié)合具有重要性。為了取代的人類(lèi)igg1之fc區(qū)域序列，位于第298個(gè)氨基酸殘基asn(n)的n-糖化點(diǎn)乃利用氨基酸his(h)取代而加以移除(即n298h)。發(fā)現(xiàn)此突變可于抗體b4存在下消除igg介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴(lài)型細(xì)胞毒性作用(complementdependentcytotoxicity，cdc)和cd4陽(yáng)性t細(xì)胞的耗竭。

圖5系db4c7抗體fv區(qū)域之輕鏈的完整氨基酸序列(seqidno：8)，其于ub-421中使用。代表衍生自其親本鼠源b4抗體之相對(duì)應(yīng)cdr1、2和3區(qū)域的序列在下方劃有底線(xiàn)(表4，seqidnos：4至6)?？勺儏^(qū)和恒定區(qū)分別以淺灰色和深灰色陰影表示(分別為seqidnos：13和14)。

圖6系經(jīng)進(jìn)一步改進(jìn)之人源化抗體之重鏈的完整氨基酸序列(seqidno：9)，因?yàn)閷?duì)位于重鏈位置第253、255和257個(gè)氨基酸的fc區(qū)域分別地將met(m)取代為tyr(y)(即m253y)、將ser(s)取代為thr(t)(即s255t)、以及將thr(t)取代為glu(e)(即t257e)，以使此抗體具有更長(zhǎng)的半衰期。

圖7系人源化抗體mabdb4之重鏈的完整氨基酸序列(seqidno：10)，其包含于圖4和6中所討論的變異氨基酸。

圖8系顯示在對(duì)細(xì)胞經(jīng)過(guò)三次抗體繼代后mabb4對(duì)位于hpb-all細(xì)胞之表面cd4的結(jié)合親和力(抗體濃度)和結(jié)合容量(游離和結(jié)合的抗體)的曲線(xiàn)圖。

圖9系mabb4(---)和mabdb4(-)對(duì)涂覆于elisa微量盤(pán)上之可溶性cd4(scd4)和p2704a肽捕獲混合物之結(jié)合親和力的曲線(xiàn)圖比較。分別地利用mabb4和mabdb4去競(jìng)爭(zhēng)地抑制b4-生物素和db4c7-alexa結(jié)合至捕獲混合物而加以測(cè)定結(jié)合親和力。

圖10系mabb4(---)和mabdb4(-)對(duì)位于hpb-all細(xì)胞上cd4之結(jié)合親和力的曲線(xiàn)圖比較。結(jié)合親和力是以facs加以測(cè)定，分別地利用mabb4和mabdb4去競(jìng)爭(zhēng)地抑制b4-生物素和db4c7-alexa結(jié)合至位于hpb-all細(xì)胞上的表面cd4。

圖11系mabdb4(---)和gp120mn(-)對(duì)位于hpb-all細(xì)胞上cd4之結(jié)合親和力的曲線(xiàn)圖比較。結(jié)合親和力是以facs加以測(cè)定，利用mabdb4和gp120mn去競(jìng)爭(zhēng)地抑制db4c7-alexa結(jié)合至位于hpb-all細(xì)胞上的表面cd4。

圖12系顯示mabdb4c7對(duì)pbmccd4+t細(xì)胞之溫度依賴(lài)性結(jié)合(mfi)的曲線(xiàn)圖。

圖13系顯示來(lái)自6位未受感染個(gè)體血液樣品之未被占據(jù)的cd4受體(-)和以mabdb4占據(jù)/結(jié)合之cd4受體(---)的平均百分比(±標(biāo)準(zhǔn)差)，并作為mabdb4濃度之函數(shù)的曲線(xiàn)圖。利用db4c7-alexa結(jié)合至位于血液cd4+t細(xì)胞表面之未被占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)以偵測(cè)未被占據(jù)的受體。然而mabdb4占據(jù)之受體是利用山羊抗-huigg-fitc加以偵測(cè)。

圖14系顯示現(xiàn)行抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(cart)藥物tenofovir于hiv無(wú)細(xì)胞和細(xì)胞間傳播上之效果的長(zhǎng)條圖(sigal，a.，etal.，2011)。y軸代表來(lái)自于存在或缺乏tenofovir狀況下由不同感染源所分離之外周血單核細(xì)胞(pbmcs)的傳播指數(shù)(sigal，a.etal.，2011)。

圖15系顯示藉由以下刺激所引發(fā)于靜默pbmcs之病毒再活化的長(zhǎng)條圖(其乃利用hiv-1p24gag制造加以測(cè)量)，刺激種類(lèi)包含未受刺激(第1長(zhǎng)條)、植物凝集素(pha)(第2長(zhǎng)條)、不活化的hiv(ihiv)溶胞產(chǎn)物(第3長(zhǎng)條)、針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域的單克隆抗體(第4長(zhǎng)條)、針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr3區(qū)域的單克隆抗體(第5長(zhǎng)條)、針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1/2的單克隆抗體(第6長(zhǎng)條)、可溶性cd4存在下之ihiv(第7長(zhǎng)條)、可溶性cd4存在下針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域的單克隆抗體(第8長(zhǎng)條)、可溶性cd4存在下針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr3區(qū)域的單克隆抗體(第9長(zhǎng)條)，以及可溶性cd4存在下針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1/2的單克隆抗體(第10長(zhǎng)條)，如附圖說(shuō)明所示(改編自briantl.，etal.，1999)。

圖16系顯示利用抗-hivrc多克隆抗體對(duì)生物素化-b4結(jié)合至rscd4之競(jìng)爭(zhēng)型抑制的圖式，其藉由elisa加以測(cè)量。

圖17系顯示mabdb4和抗-hivrc多克隆抗體對(duì)位在pbmcs上之表面cd4的抗體效價(jià)測(cè)定圖式。抗體效價(jià)測(cè)定為％cd4結(jié)合對(duì)抗體濃度(μg/ml)。

圖18a至圖18g系顯示于未使用治療藥物之hiv陽(yáng)性和hiv陰性受試者以mabdb4和抗-hivrc多克隆抗體對(duì)由超抗原seb所引起增生cd4+和cd8+t細(xì)胞之細(xì)胞激素il2和ifn-γ制造抑制的分析。對(duì)hiv陰性(圖18a)和hiv陽(yáng)性(圖18b)受試者，mabdb4和抗-hivrc多克隆抗體對(duì)由超抗原所引起增生cd4+t細(xì)胞之il2制造的抑制如圖所示。對(duì)hiv陰性受試者和年齡一致的hiv陽(yáng)性受試者(圖18c)，mabdb4和抗-hivrc多克隆抗體對(duì)由超抗原所引起增生cd8+t細(xì)胞之il2制造的抑制也如圖所示。對(duì)hiv陰性(圖18d)和hiv陽(yáng)性(圖18e)受試者，mabdb4和抗-hivrc多克隆抗體對(duì)由超抗原所引起增生cd4+t細(xì)胞之ifn-γ制造的抑制如圖所示。對(duì)hiv陰性(圖18f)和hiv陽(yáng)性(圖18g)受試者，mabdb4和抗-hivrc多克隆抗體對(duì)由超抗原所引起增生cd8+t細(xì)胞之ifn-γ制造的抑制如圖所示。

圖19a至圖19c系顯示藉由對(duì)于hiv-1原代分離株dh12(hiv-1dh12)暴露前(圖19a)和暴露后(圖19b)投予mabb4以保護(hù)黑猩猩免于hiv感染的圖式，其藉由于感染后一段時(shí)間測(cè)定在pbmcs中的hiv-1rna拷貝/ml而加以評(píng)估。暴露于hiv-1dh12而未投予抗體之對(duì)照組動(dòng)物的結(jié)果圖式(圖19c)如圖所示。向下箭頭標(biāo)記試驗(yàn)開(kāi)始，此時(shí)mabb4是于hiv-1dh12攻毒前或后一小時(shí)投予。

圖20a和圖20b系顯示未接受治療和以mabb4治療之hiv-1感染黑猩猩的hiv病毒量的圖式，其藉由隨時(shí)間測(cè)定的hiv-1rna拷貝/ml而加以評(píng)估。圖20a系比較于黑猩猩x356(接受三次mabb4輸注(實(shí)心圓))與未接受治療的對(duì)照組黑猩猩x084(在之前試驗(yàn)中先前接受mabb4的單一劑量(空心圓))之血漿病毒血癥的持續(xù)時(shí)間。

圖20b系比較于黑猩猩x356(接受三次mabb4輸注(實(shí)心圓))與未接受治療的對(duì)照組黑猩猩x259(未接受mabb4之先前用藥劑量(空心圓))之血漿病毒血癥的持續(xù)時(shí)間。

圖21系mabdb4對(duì)人類(lèi)(---)和狒狒(-)cd4陽(yáng)性t細(xì)胞之結(jié)合親和力的曲線(xiàn)圖比較。

圖22a和圖22b系顯示對(duì)在藥物增量(1、5、10和25mg/kg)之第i期臨床試驗(yàn)中接受抗體藥物ub-421(mabdb4c7)單次投予的患者于hiv-1rna的平均log10變化對(duì)試驗(yàn)天數(shù)的圖式。圖22a系顯示在本試驗(yàn)期間每一劑量所展現(xiàn)之病毒減少的圖式。圖22b系顯示對(duì)每一劑量之平均和最大個(gè)別最低點(diǎn)的圖式。

圖23a至圖23c系顯示ub-421(mabdb4c7)之療效和先前報(bào)導(dǎo)之tmb-355(tmb-355先前稱(chēng)為tnx-355；kuritzkes，d.r.，etal.，2004，圖1)療效數(shù)據(jù)的理論比較圖式。圖23a系顯示以5mg/kg之ub-421和3mg/kg之tmb-355單次投予后所觀察之病毒量下降的圖式比較。圖23b系顯示以10mg/kg之ub-421或tmb-355單次投予后所觀察之病毒量下降的圖式比較。圖23c系顯示以25mg/kg之ub-421或tmb-355單次投予后所觀察之病毒量下降的圖式比較。

圖24a和圖24b系顯示于為期8周治療期期間在接受每周10mg/kg(圖24a)或每?jī)芍?5mg/kg(圖24b)ub-421(mabdb4c7)投予之受試者的平均pbmccd4t細(xì)胞數(shù)量/mm³的圖式。可藉由針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域2之生物素化抗體測(cè)得于ub-421治療的患者中穩(wěn)定的cd4t細(xì)胞數(shù)量。

圖25a至圖25d系顯示在第iia期臨床試驗(yàn)期間ub-421治療之臨床療效的圖式，如利用病毒量減少(上圖)和ub-421的藥物動(dòng)力學(xué)(如以μg/ml血清濃度加以測(cè)定(下圖))所測(cè)定。提供了用于以下代表性患者的相關(guān)數(shù)據(jù)：接受每周10mg/kgub-421投予的患者1-1-01(圖25a)；接受每周10mg/kgub-421投予的患者1-1-02(圖25b)；接受每?jī)芍?5mg/kgub-421投予的患者1-2-03(圖25c)；以及接受每?jī)芍?5mg/kgub-421投予的患者1-2-06(圖25d)。以整個(gè)涂滿(mǎn)灰色陰影之區(qū)間代表ub-421結(jié)合于pbmccd4+細(xì)胞上的持續(xù)期間。

圖26a和圖26b系顯示于使用ub-421之第iia期臨床試驗(yàn)所觀察之病毒量減少對(duì)照于由他人所作之tmb-355(ibalizumab，先前稱(chēng)為tnx-355)類(lèi)似試驗(yàn)(jacobson，j.l.，etal.，2009；toma，j.，etal.，2011；andpace，c.s.，etal.，2013)所觀察之病毒量減少的理論比較圖式。圖26a概述于以10mg/kg和25mg/kgub-421治療之受試者所觀察的病毒量變化，而圖26b概述于以相同劑量水平tmb-355治療之受試者所觀察的病毒量變化。

圖27系顯示于hiv患者群體的治療形式示意圖，此hiv患者群體是于未使用治療藥物之hiv患者和haart治療穩(wěn)定之hiv患者使用ub-421單一藥物治療以替代haart治療。

圖28系顯示于hiv患者群體的治療形式示意圖，其利用ub-421合并使用haart治療以于未使用治療藥物之hiv患者、haart治療穩(wěn)定之hiv患者，和haart治療失敗之hiv患者達(dá)成hiv感染的功能性治愈。

【具體實(shí)施方式】

本發(fā)明有關(guān)于用以預(yù)防、治療，及/或功能性治愈hiv感染的組合物和方法。本發(fā)明之一方面是關(guān)于針對(duì)cd4之抗體、其配制劑，以及使用此配制劑以預(yù)防、治療，及/或功能性治愈hiv感染的方法。

在此使用之章節(jié)標(biāo)題僅作為組織的目的，且并非被解釋作為限制所述之專(zhuān)利標(biāo)的。為了任何目的，此申請(qǐng)案引用之所有參考文獻(xiàn)或參考文獻(xiàn)之部分透過(guò)引用在此明確地被并入本文整體。

cd4

cd4(clusterofdifferentiation4)是一種糖蛋白(uniprotkb/swiss-prot：p01730.1)，其位于免疫細(xì)胞(例如輔助t細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞)(http://en.wikipedia.org/wiki/cd4)。cd4是免疫球蛋白超家族的成員，且具有暴露于細(xì)胞外表面的四個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(d1至d4)。cd4結(jié)構(gòu)域d1和d3類(lèi)似免疫球蛋白可變(igv)區(qū)；而d2和d4類(lèi)似免疫球蛋白恒定(igc)區(qū)。cd4使用其d1結(jié)構(gòu)域與第二型主要組織相容性復(fù)合體(mhcii)分子的β2-結(jié)構(gòu)域相互作用。因此，于其表面表達(dá)cd4分子的t細(xì)胞對(duì)mhcii所呈現(xiàn)之抗原具有特異性。包含特殊氨基酸序列的cd4短細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞內(nèi)尾端使其可與lck分子相互作用。

cd4的第一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白共有同源性，其三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(cdrs)與免疫球蛋白鏈相似。發(fā)現(xiàn)cd4分子細(xì)胞外區(qū)域的結(jié)構(gòu)域1和結(jié)構(gòu)域2均對(duì)mhcii分子之結(jié)合位點(diǎn)具有貢獻(xiàn)；然而，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)結(jié)構(gòu)域1涉及hiv結(jié)合與合胞形成(syncytiaformation)。特別地，發(fā)現(xiàn)hiv包膜糖蛋白gp120之結(jié)合位點(diǎn)位于結(jié)構(gòu)域1的類(lèi)cdr-2環(huán)(cdr2-likeloop)。

hiv-1藉由cd4進(jìn)入宿主t細(xì)胞，此乃透過(guò)其病毒包膜蛋白(稱(chēng)為gp120)達(dá)成。結(jié)合cd4引起gp120構(gòu)型變化以允許hiv-1結(jié)合至表達(dá)于宿主細(xì)胞上的化學(xué)激素受體ccr5或cxcr4。接著另一個(gè)病毒蛋白(gp41)結(jié)構(gòu)改變，hiv將融合肽插入宿主細(xì)胞，以允許病毒的外膜與細(xì)胞膜融合。hiv感染造成表達(dá)cd4之t細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。

抗體

本發(fā)明之一方面是關(guān)于針對(duì)cd4之抗體、其組合物，以及使用此組合物以預(yù)防、治療，及/或功能性治愈hiv感染的方法。

本發(fā)明抗體廣泛地包含完整的抗體分子，其包含完整的多克隆、單克隆、單特異性、多特異性、嵌合、去免疫化、人源化、人類(lèi)、靈長(zhǎng)類(lèi)、單鏈、單結(jié)構(gòu)域(single-domain)、合成和重組抗體，以及具有所欲活性或功能之抗體片段。

本發(fā)明抗體可辨認(rèn)cd4的結(jié)構(gòu)域1。在某些實(shí)施方案中，抗體可特異性地結(jié)合位于cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域。

本發(fā)明抗體可以任何標(biāo)準(zhǔn)方法制造。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體可藉由以重組cd4蛋白、重組cd4蛋白的片段、或是表面表達(dá)cd4的細(xì)胞免疫動(dòng)物(例如：小鼠、狗、天竺鼠、豬、山羊、馬等)加以制造?；蛘?，可化學(xué)合成抗體。

在某些實(shí)施方案中，可藉由以含有cd4結(jié)構(gòu)域1之氨基酸序列的肽免疫動(dòng)物以制造抗體。例如，可藉由以含有cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域氨基酸序列的肽或其組合免疫動(dòng)物以制造多克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，含有cd4之第39-66個(gè)氨基酸的肽(稱(chēng)為hiv受體復(fù)合體(“hivrc”))，如同hiv結(jié)合至cd4之此部分。在某些實(shí)施方案中，hivrc肽可藉由二硫鍵以創(chuàng)造環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

在某些實(shí)施方案中，可利用環(huán)狀hivrc肽免疫動(dòng)物以制造多克隆抗體。本發(fā)明所述“抗-hivrc多克隆抗體”是指抗含有cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域第39-66個(gè)氨基酸的環(huán)狀肽的免疫血清。

在其它實(shí)施方案中，利用cd4陽(yáng)性細(xì)胞免疫動(dòng)物以制造抗體。例如，在某些實(shí)施方案中，以完整、未感染的cd4+人類(lèi)hpb-all細(xì)胞、t細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞株(t-acutelymphoblasticleukemiacellline)免疫balb/c小鼠制造抗體。于wang的專(zhuān)利(美國(guó)5,912,176號(hào)和6,090,388號(hào)專(zhuān)利)以及wang等人于1999年發(fā)表的期刊論文對(duì)此抗體有更詳細(xì)的討論，其均透過(guò)引用以并入本文整體。

在其它實(shí)施方案中，抗體包含如序列表所列之重鏈和輕鏈的氨基酸序列。本發(fā)明包含含有序列表所列氨基酸序列之抗體的同源物和功能類(lèi)似物。

本發(fā)明抗體的功能類(lèi)似物包含序列變異和同源物，其保持如原抗體實(shí)質(zhì)上相同之功能特征(結(jié)合辨認(rèn)、結(jié)合親和力等)。例如，作為功能類(lèi)似物或同源物之抗體變異于氨基酸位置具有保留性取代；靜電荷改變；共價(jià)結(jié)合至其它官能基；或小的加入、插入、刪除或保留性取代及/或其任意組合。因此，此抗體的變異抗體功能類(lèi)似物和同源物將可辨識(shí)并結(jié)合cd4，且用于受試者以治療hiv。

在一實(shí)施方案中，抗體功能類(lèi)似物或同源物通常與含有揭露于序列表之氨基酸序列的抗體具有至少約50％序列相似度。在其它實(shí)施方案中，抗體功能類(lèi)似物或同源物與含有揭露于序列表之氨基酸序列的抗體具有至少約50％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、或約99％相似度。

保留性取代是指一個(gè)氨基酸殘基以另一個(gè)具有相似化學(xué)特性之氨基酸殘基取代。例如，非極性(疏水性)氨基酸包含丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包含甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；正電(堿性)氨基酸包含精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸；以及負(fù)電(酸性)氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸。

在其它實(shí)施方案中，抗體的功能類(lèi)似物可藉由對(duì)氮基端、羧基端加入或刪除氨基酸，及/或藉由插入序列中間而加以修飾。在本發(fā)明之不同實(shí)施方案中，是對(duì)肽的氮基端或羧基端加入或刪除?？蔀?、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸殘基的加入或刪除。此種加入或刪除可能構(gòu)成氨基酸序列，而此氨基酸序列未呈現(xiàn)于序列表所列之序列中，但并不改變此抗體的一般功能特征。

在某些實(shí)施方案中，以化學(xué)物質(zhì)標(biāo)記或標(biāo)幟本發(fā)明抗體。例如，抗體可以生物素、間隔臂、探針(例如：熒光素異硫氰酸鹽(fitc)、藻紅蛋白(pe)、四甲基異硫氰酸羅丹明(tritc)、dylightfluors、alexa、綠色熒光蛋白(gfp)、r-藻紅蛋白(r-phycoerythrin)、量子點(diǎn)(quantumdots)等)、酶綴合物，及其組合加以標(biāo)幟。在具體實(shí)施方案中，抗體是以生物素或熒光探針標(biāo)幟。

在具體實(shí)施方案中，抗體透過(guò)已知的去免疫化過(guò)程加以修飾。本發(fā)明所述“去免疫化”一般是指用以修飾抗體之部分的過(guò)程，藉此使其投予動(dòng)物時(shí)不引起動(dòng)物體內(nèi)之免疫反應(yīng)。具體來(lái)說(shuō)，此抗體于投予至特定動(dòng)物時(shí)具有免疫原性(例如，t細(xì)胞抗原表位)，去免疫化涉及定位與移除抗體部分氨基酸序列的過(guò)程。此過(guò)程可藉由結(jié)合使用免疫學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)達(dá)成。此過(guò)程先前已揭露(例如jones，t.d.，etal.2009)。在抗體去免疫化的狀況下，可普遍地引入突變以移除t細(xì)胞抗原表位而未顯著地減少抗體的結(jié)合親和力。

本發(fā)明所述“人源化”是指修飾(去免疫化)非人類(lèi)物種抗體的蛋白質(zhì)序列，藉此移除當(dāng)此抗體投予人類(lèi)時(shí)的免疫原性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體是利用以人類(lèi)恒定區(qū)取代其恒定區(qū)及/或利用表達(dá)于哺乳類(lèi)細(xì)胞編碼此些抗體的基因以去免疫化供人類(lèi)使用。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體具有如表4所示之重鏈和輕鏈氨基酸序列。

本發(fā)明所述“mabb4”或“b4”或“鼠源b4”分別地是指具有seqidnos：1-6之重鏈和輕鏈的cdr1、2、3區(qū)域氨基酸序列的鼠源單克隆抗體(如表4所示)。鼠源單克隆抗體可辨識(shí)cd4并抑制hiv進(jìn)入。此抗體之結(jié)構(gòu)與功能特征于實(shí)施例與下文中有更詳細(xì)之討論。

本發(fā)明所述“mabdb4“或“db4”是指衍生自mabb4之人類(lèi)去免疫化抗體。人類(lèi)去免疫化mabdb4分別地具有seqidnos：1-6之重鏈和輕鏈的cdr1、2、3區(qū)域之氨基酸序列(如表4所示)。在一些實(shí)施方案中，mabdb4之輕鏈具有seqidno：8之氨基酸序列(如圖5所示)。在一些實(shí)施方案中，mabdb4之重鏈具有seqidno：7之氨基酸序列(如圖4所示)。在不同實(shí)施例中，mabdb4之重鏈具有seqidno：9之氨基酸序列(如圖6所示)。mabb4可藉由于本領(lǐng)域所知悉的任何適當(dāng)方法加以去免疫化。在一實(shí)施方案中，mabb4是利用依據(jù)美國(guó)7,501,494號(hào)和7,872,110號(hào)專(zhuān)利所述之方法去免疫化以供人類(lèi)使用，其透過(guò)引用在此并入本文整體。在特殊實(shí)施方案中，人類(lèi)去免疫化mabdb4是藉由移除mabb4之鼠源抗體恒定區(qū)(ch和cκ)，并以人類(lèi)igg1的恒定區(qū)取代，而制造。mabdb4包含以任何適當(dāng)之細(xì)胞克隆制造的db4。在具體實(shí)施方案中，mabdb4是由7號(hào)克隆所制造。

本發(fā)明所述“mabdb4c7”或“db4c7”，是指由包含重組基因b4divhv1/vk1cho#7的7號(hào)克隆所表達(dá)的mabdb4，其先前于美國(guó)7,501,494號(hào)和7,872,110號(hào)專(zhuān)利揭露，這些專(zhuān)利透過(guò)引用在此并入本文整體。顯示c7克隆可制造高品質(zhì)的mabdb4抗體。特別的是，mabb4c7為人類(lèi)去免疫化抗體，其具有包含seqidno：8氨基酸序列之輕鏈(如圖5所示)和包含seqidno：7氨基酸序列之重鏈(如圖4所示)。此外，將位于mabdb4c7位置298之a(chǎn)sn(n)殘基以his(h)取代，以移除n-糖化點(diǎn)，因此于抗體b4存在下消除igg介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴(lài)型細(xì)胞毒性作用(cdc)以防止cd4陽(yáng)性t細(xì)胞的耗竭。

本發(fā)明所述“ub-421”是指使用于投予人類(lèi)受試者之合適形式的mabdb4c7。

本發(fā)明抗體也可藉由其有趣與獨(dú)特的功能特征而加以描述。

例如，本發(fā)明之抗體可透過(guò)其結(jié)合至cd4之結(jié)構(gòu)域1而發(fā)揮有效的競(jìng)爭(zhēng)型hiv進(jìn)入抑制。特別是，本發(fā)明之抗體于測(cè)試的所有env假型病毒具有接近100％的最大抑制百分比(mpi)，具有兩個(gè)ic50濃度；一個(gè)是介于0.01至1μg/ml，且第二個(gè)是約10μg/ml。本發(fā)明抗體的結(jié)合活性較hivgpl20包膜蛋白所展現(xiàn)之cd4結(jié)合親和力高了約兩個(gè)對(duì)數(shù)(即100倍更緊密的結(jié)合)。此外，本發(fā)明抗體的平均解離常數(shù)(kd)測(cè)得為5.6x10^-11m(范圍：3.1至8.1x10^-11m)，且最大結(jié)合容量(bmax)測(cè)得為每細(xì)胞1.2x10⁶ab(范圍：0.93至1.4x10⁶)。

于無(wú)細(xì)胞和細(xì)胞間的系統(tǒng)中均顯示本發(fā)明抗體的競(jìng)爭(zhēng)型抑制特性。本發(fā)明抗體以較hiv包膜蛋白gp120mn高至少50倍之親和力結(jié)合至cd4受體。并且，本發(fā)明抗體以相較于其它市售抗體(例如leu3a)更高的親和力與特異性結(jié)合至cd4。

本發(fā)明抗體也可抑制由抗原引起的t細(xì)胞增生和cd4陽(yáng)性t細(xì)胞的細(xì)胞激素制造(il2和ifn-gamma)，其涉及細(xì)胞焦亡的致病循環(huán)。此種對(duì)cd4具高親和力之單克隆抗體可抑制抗原(例如超抗原seb(金黃色葡萄球菌b型腸毒素(staphylococcalenterotoxinb，seb))引起的cd4陽(yáng)性t細(xì)胞活化和細(xì)胞激素(例如il2和ifn-γ)制造。此種抗原引起的活化導(dǎo)致hiv感染失敗的靜默cd4+t細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞激素，造成這些靜默cd4+t細(xì)胞和附近正常靜默cd4陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞焦亡，其導(dǎo)致之后cd4+t細(xì)胞的大量耗竭，因而導(dǎo)致aids。

本發(fā)明抗體也具有再活化靜默cd4陽(yáng)性t細(xì)胞的能力。此特性對(duì)再活化靜默t細(xì)胞中的潛伏hiv病毒庫(kù)特別有用，可使這些細(xì)胞對(duì)抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療敏感。為了釋放hiv，此種對(duì)cd4高親和力之抗體可活化靜默的hiv感染細(xì)胞。hiv感染的靜默cd4+t細(xì)胞再活化允許hiv感染患者使用合并本發(fā)明抗體與haart之合并治療，以達(dá)成功能性治愈。

于以下實(shí)施例提供本發(fā)明抗體額外的結(jié)構(gòu)與功能特征。

劑型

本發(fā)明也針對(duì)用以預(yù)防、治療，及/或功能性治愈hiv感染的藥劑劑型。在某些實(shí)施方案中，劑型包含針對(duì)cd4之抗體。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含對(duì)cd4高親和力之單克隆抗體的醫(yī)藥組合物(此抗體可針對(duì)位于cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域內(nèi)或附近的位置)。此種抗體的結(jié)合活性(ecs0)較hivgp120包膜蛋白所展現(xiàn)之cd4結(jié)合親和力(對(duì)gp120之ec50＝97nm)高了約兩個(gè)對(duì)數(shù)(即100倍更緊密的結(jié)合)。

抗體蛋白質(zhì)的藥劑劑型可藉由混合抗體蛋白質(zhì)與任選的藥物學(xué)上可接受的載體而加以制備。藥物學(xué)上可接受的載體包含溶劑、分散介質(zhì)、等滲劑等。載體可為液體、半固體(例如膏狀物)或固體載體。載體的例子包含水、鹽溶液或其它緩沖液(例如磷酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液)、油類(lèi)、醇類(lèi)、蛋白質(zhì)(例如血清白蛋白、明膠)、碳水化合物(例如單糖、雙糖，以及其它碳水化合物(包含葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇或糊精)、凝膠、脂質(zhì)、微脂體、樹(shù)脂、多孔基體、粘合劑、充填劑、涂層、穩(wěn)定劑、防腐劑、抗氧化劑(包含抗壞血酸以及甲硫氨酸)、螯合劑(例如edta)；成鹽的抗衡離子(saltformingcounter-ions)(例如鈉)；非離子表面活性劑(例如tween^tm、pluronics^tm或聚乙二醇(peg)，或其組合)。

此劑型可包含至少一種的活性物質(zhì)。例如，劑型可含有用于預(yù)防和治療hiv感染之一或多個(gè)抗體及/或一或多個(gè)具有額外優(yōu)點(diǎn)的化合物?；钚晕镔|(zhì)可以任何方便使用的方式(例如：混合、溶液、懸浮液、乳化作用、膠囊化、吸附等)與載體結(jié)合，且可制成適用于注射、攝取、輸注等的劑型(例如：錠劑、膠囊、粉末(包含冷凍干燥粉末)、糖漿劑、懸浮液)。亦可制備成緩釋制劑。

在某些實(shí)施方案中，藥劑劑型包含供人類(lèi)使用之mabdb4c7。包含mabdb4c7之藥劑劑型可配制于適當(dāng)緩沖液中，包含，但不限于，檸檬酸鹽、磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷(tris)、1，3-二[三(羥甲基)甲基氨基]丙烷(bis-tris)等，于介于6.0至7.0之ph值，且可包含賦形劑(例如糖類(lèi)(50mm至500mm的蔗糖、海藻糖、甘露醇，或其混合))、表面活性劑(例如：0.025％-0.5％的tween20或tween80)，及/或其它試劑。在具體實(shí)施方案中，劑型包含mabdb4c7于含有20mm甘氨酸，以及0.05％(v/v)tween(polysorbate20)之磷酸鹽緩沖生理食鹽水(pbs)(ph6.5)中。在其它具體實(shí)施方案中，也可制備mabdb4之高濃度劑型以供包含皮下注射之應(yīng)用，其包含10mm組氨酸。

可制備含有不同量抗體的劑型。一般來(lái)說(shuō)，用于投予受試者的劑型包含介于約0.1mg/ml至約200mg/ml。在某些實(shí)施方案中，劑型可包含介于約0.5mg/ml至約50mg/ml；介于約1.0mg/ml至約50mg/ml；介于約1mg/ml至約25mg/ml；或介于約10mg/ml至約25mg/ml的抗體。在具體實(shí)施方案中，劑型包含約1.0mg/ml，約5.0mg/ml，約10.0mg/ml，或約25.0mg/ml的抗體。

在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域之人類(lèi)、人源化或嵌合、單克隆抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其展現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)型hiv進(jìn)入抑制與cd4+t細(xì)胞活化，作為hiv患者的免疫療法。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類(lèi)、人源化或嵌合，抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其作為單一藥物治療使接受治療之受試者血清抗體水平高于10μg/ml，可將病毒量降低至檢測(cè)極限以下。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類(lèi)、人源化或嵌合，抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其作為單一藥物治療可于為期12周治療期間使接受治療之受試者血清抗體水平高于10μg/ml，且維持穩(wěn)定的cd4t細(xì)胞數(shù)量，將病毒量降低至檢測(cè)極限以下。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類(lèi)、人源化或嵌合，抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，當(dāng)以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約10mg/kg或更高之劑量投予作為單一藥物治療時(shí)，此種治療可于為期12周治療期間使接受治療之受試者的病毒量降低至檢測(cè)極限以下。

在另一較佳實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其可作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，當(dāng)以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約10mg/kg或更高之劑量投予未使用治療藥物之hiv患者，將達(dá)成患者的功能性治愈。

在另一較佳實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其可作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，當(dāng)以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約10mg/kg或更高之劑量投予于haart下具有穩(wěn)定病毒量的患者，將達(dá)成患者的功能性治愈。

抗病毒藥物

本發(fā)明之治療、預(yù)防，和功能性治愈hiv感染的方法更包括抗病毒藥物。

抗病毒藥物包含可于哺乳類(lèi)動(dòng)物有效抑制hiv之形成及/或復(fù)制的任何藥物(化合物或生物的)。抗病毒藥物的例子包含，但不限于，進(jìn)入/融合抑制劑(例如：maraviroc、enfuvirtide)；核苷類(lèi)反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nrti)和核苷酸類(lèi)反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(ntrti)(例如：zidovudine、abacavir、lamivudine、emtricitabine和tenofovir)；非核苷類(lèi)反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nnrti)(例如：nevirapine、efavirenz、etravirine和rilpivirine)；整合酶抑制劑(也稱(chēng)為整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑或instis(例如：raltegravir、dolutegravir)；蛋白酶抑制劑(例如：saquinavir、saquinavirmesylate、fosamprenavir、tipranavir、lopinavir、indinavir、nelfinavir、amprenavir、ritonavir、darunavir、atazanavir、bevirimat、vivecon)；病毒成熟抑制劑；針對(duì)hiv基因表達(dá)的藥物；針對(duì)涉及hiv復(fù)制之重要宿主細(xì)胞基因和基因產(chǎn)物的藥物；以及其它抗-hiv藥物；irna藥物；反義rna(antisenserna)；表達(dá)irna藥物或反義rna之載體；肽核酸(pna)以及抗病毒抗體；及其組合。

抗病毒藥物可以單獨(dú)或合并方式使用。以合并方式使用抗病毒藥物稱(chēng)為抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(art)，聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(cart)或高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)。抗反轉(zhuǎn)錄病毒(arv)藥物藉由藥物抑制反轉(zhuǎn)錄病毒生命周期的階段而廣泛地被分類(lèi)。典型的合并使用包含以?xún)煞Nnrtis作為“骨架”，以及以一種nnrti、pi或insti作為“基底”。在某些實(shí)施方案中，合并使用抗病毒藥物的方式，例如：combivir、trizivir、kaletra、epzicom、truvada、atripla、complera、stribild、triumeq。

治療、預(yù)防和功能性治愈的方法

本發(fā)明也包括用以治療、預(yù)防，和功能性治愈hiv感染的方法。在某些實(shí)施方案中，劑型包含針對(duì)cd4之抗體。

另一方面，本發(fā)明之抗體、任選的藥物學(xué)上可接受的載體可于受試者用以預(yù)防、治療，及/或功能性治愈hiv感染，以及預(yù)防hiv傳播。

本發(fā)明所述hiv感染的“治療”是指對(duì)hiv感染的有效抑制，藉此延遲發(fā)生、延緩病程、減少病毒量，及/或改善由hiv感染所引起之癥狀。治療包含對(duì)hiv暴露前和暴露后。

本發(fā)明所述hiv感染的“預(yù)防”是指延遲hiv感染之發(fā)生，及/或減少或消除hiv感染的發(fā)生率或可能性。本發(fā)明所述hiv傳播的“預(yù)防”是指減少或消除hiv由一個(gè)體傳染至另一個(gè)體(例如于懷孕、分娩或生產(chǎn)，或母乳喂養(yǎng)期間由hiv陽(yáng)性之女性傳至小孩)的發(fā)生率或可能性。

本發(fā)明所述“受試者”是指任何靈長(zhǎng)類(lèi)受試者，包含人類(lèi)、恒河猴、狒狒和黑猩猩受試者。

為治療及/或預(yù)防hiv感染，對(duì)有需求的受試者投予本發(fā)明抗體的治療劑量。

本發(fā)明所述“治療上有效劑量”是指抑制hiv感染效果所需劑量，藉此治療及/或預(yù)防hiv感染?？贵w的劑量取決于疾病狀態(tài)和其它臨床因素，例如受試者重量和狀況、受試者對(duì)此療法的反應(yīng)、劑型的種類(lèi)和給藥途徑。作為治療上有效且非有害的精確劑量可由本領(lǐng)域之技術(shù)人員所決定。

一般來(lái)說(shuō)，投予成年人類(lèi)之抗體的適當(dāng)劑量范圍介于約3至50mg/kg受試者體重，具有范圍介于約5至25mg/kg受試者體重的典型初步范圍可供使用。適當(dāng)劑量也包含約5.0mg/kg、約10.0mg/kg、或約25.0mg/kg受試者體重。

包含本發(fā)明人類(lèi)單克隆抗體的治療性組合物可便于靜脈投予(例如藉由單位劑量注射)。單位劑量一般是指本發(fā)明之治療性組合物，其進(jìn)一步是指對(duì)受試者適合作為單位劑量之物理上分開(kāi)的單位，每一單位包含計(jì)算用以產(chǎn)生所欲治療反應(yīng)之活性物質(zhì)的預(yù)定量和所需稀釋劑(即載體或賦形劑)。

以適當(dāng)劑型之方式與治療上有效劑量投予組合物。給藥量取決于所欲治療的受試者、受試者身體利用活性物質(zhì)的能力，以及所欲治療效果之程度。需要投予之活性成分的精確劑量取決于醫(yī)生之判斷與個(gè)體的差異性。然而，所揭露供系統(tǒng)性應(yīng)用之適當(dāng)劑量范圍取決于給藥途徑。用于投予的適當(dāng)治療方案也不盡相同，而是以于初次投予后投予重復(fù)劑量作為代表(于一或多個(gè)小時(shí)之間隔藉由之后的注射或其它投予方式)。另外，考慮在生物治療中持續(xù)靜脈輸注以維持血液中的濃度于指定范圍。

于受試者用以治療、預(yù)防，及/或功能性治愈hiv感染的方法包含投予受試者有效劑量之含有抗體的劑型。在某些實(shí)施方案中，以單次投予的方式提供劑型給受試者。在某些實(shí)施方案中，以多次投予的方式提供劑型給受試者。當(dāng)以多次投予的方式提供劑型時(shí)，劑型可以每天一次、每周一次、每?jī)芍芤淮?每隔一周)，或每月一次投予。在具體實(shí)施方案中，當(dāng)治療時(shí)程表是以每周一次時(shí)，劑型是以約5.0mg/kg受試者體重之劑量投予受試者。在另一實(shí)施方案中，當(dāng)治療時(shí)程表是以每?jī)芍芤淮螘r(shí)，劑型是以約25.0mg/kg受試者體重之劑量投予受試者。

在某些實(shí)施方案中，當(dāng)以總共8周，以5mg/kg或25mg/kg劑量以每周為基礎(chǔ)重復(fù)投予受試者時(shí)，含有單克隆抗體之劑型顯現(xiàn)高安全系數(shù)且耐受性良好。在具體實(shí)施方案中，單克隆抗體可以5mg/kg劑量在hiv感染數(shù)小時(shí)內(nèi)投予受試者，以提供hiv感染的消除性治愈。在其它實(shí)施方案中，單克隆抗體可以5mg/kg劑量于hiv感染后在數(shù)天內(nèi)投予受試者，以提供hiv感染的功能性治愈。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類(lèi)、人源化或嵌合，抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其透過(guò)靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予hiv患者作為免疫療法以減少病毒量。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1cdr2區(qū)域之人類(lèi)、人源化或嵌合單克隆抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其展現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)型hiv進(jìn)入抑制與cd4+t細(xì)胞活化，以作為hiv感染之患者的免疫療法。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類(lèi)、人源化或嵌合抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約10mg/kg或更高之劑量透過(guò)靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予hiv患者作為免疫療法以減少病毒量。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類(lèi)、人源化或嵌合抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其作為單一藥物治療可使接受治療之受試者血清抗體水平高于10μg/ml，將病毒量降低至檢測(cè)極限以下。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類(lèi)、人源化或嵌合抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其作為單一藥物治療可于為期12周治療期間使接受治療之受試者血清抗體水平高于10μg/ml，且維持穩(wěn)定的cd4t細(xì)胞數(shù)量，將病毒量降低至檢測(cè)極限以下。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類(lèi)、人源化或嵌合抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，當(dāng)以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約10mg/kg或更高之劑量投予作為單一藥物治療時(shí)，此種治療可于為期12周治療期間使接受治療之受試者的病毒量降低至檢測(cè)極限以下。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類(lèi)、人源化或嵌合抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，當(dāng)以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約10mg/kg或更高之劑量投予作為單一藥物治療時(shí)，此種治療可使接受治療之受試者的病毒量降低至檢測(cè)極限以下，且只要血清抗體水平高于10μg/ml即無(wú)病毒量反彈。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其可作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，當(dāng)以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約10mg/kg或更高之劑量投予未使用治療藥物之hiv患者，可達(dá)成患者的功能性治愈。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其可作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，當(dāng)以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約10mg/kg或更高之劑量投予于haart下具有穩(wěn)定病毒量的患者，可達(dá)成患者的功能性治愈。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約10mg/kg或更高之劑量透過(guò)靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予對(duì)haart之輔助治療中haart治療失敗之患者，可使病毒進(jìn)一步減少。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為于haart替代療法的關(guān)鍵成份，藉此進(jìn)行治療循環(huán)，每治療循環(huán)以抗-cd4抗體治療2至4個(gè)月作為開(kāi)始，其如同對(duì)于harrt之下經(jīng)歷穩(wěn)定低于檢測(cè)極限病毒量之患者的治療假日(treatmentholiday)，之后接續(xù)haart治療，進(jìn)行1至4個(gè)或更多循環(huán)的期間，可達(dá)成功能性治愈。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為于haart替代療法的關(guān)鍵成份，藉此進(jìn)行治療循環(huán)，對(duì)于未使用治療藥物之hiv患者每治療循環(huán)以抗-cd4抗體治療2至4個(gè)月作為開(kāi)始，之后接續(xù)2至4個(gè)月的haart治療，進(jìn)行1至4個(gè)或更多循環(huán)的期間，可達(dá)成功能性治愈。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為于haart替代療法的關(guān)鍵成份，藉此進(jìn)行治療循環(huán)，每治療循環(huán)以抗-cd4抗體治療2至4個(gè)月作為開(kāi)始，其如同對(duì)于harrt之下經(jīng)歷穩(wěn)定低于檢測(cè)極限病毒量之患者的治療假日，之后接續(xù)haart治療，進(jìn)行1至4個(gè)或更多循環(huán)的期間，以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約5mg/kg或更高之劑量，可達(dá)成功能性治愈。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為于haart替代療法的關(guān)鍵成份，藉此進(jìn)行治療循環(huán)，對(duì)于未使用治療藥物之hiv患者每治療循環(huán)以抗-cd4抗體治療2至4個(gè)月作為開(kāi)始，之后接續(xù)2至4個(gè)月的haart治療，進(jìn)行1至4個(gè)或更多循環(huán)的期間，以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約5mg/kg或更高之劑量，可達(dá)成功能性治愈。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其可作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，當(dāng)以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約10mg/kg或更高之劑量投予未使用治療藥物之hiv患者，將達(dá)成患者的功能性治愈。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其可作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，當(dāng)以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約10mg/kg或更高之劑量投予于haart下具有穩(wěn)定病毒量的患者，將達(dá)成患者的功能性治愈。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約10mg/kg或更高之劑量透過(guò)靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予對(duì)haart之輔助治療中haart治療失敗之患者，使病毒進(jìn)一步減少。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，于間歇模式中，對(duì)于未使用治療藥物之hiv患者，每循環(huán)以2至4個(gè)月之治療期作為開(kāi)始，以及1至2個(gè)月之治療假日，進(jìn)行1至4個(gè)或更多循環(huán)的期間，如同于密集haart治療模式的輔助治療，可達(dá)成患者的功能性治愈。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，于間歇模式中，對(duì)于未使用治療藥物之hiv患者，每循環(huán)以2至4個(gè)月之治療期作為開(kāi)始，以及1至2個(gè)月之治療假日，進(jìn)行1至4個(gè)或更多循環(huán)的期間，以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約5mg/kg或更高之劑量，如同于密集haart治療模式的輔助治療，可達(dá)成患者的功能性治愈。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，于間歇模式中，對(duì)harrt之下經(jīng)歷穩(wěn)定低于檢測(cè)極限病毒量之患者，每循環(huán)以2至4個(gè)月之治療期作為開(kāi)始，以及1至2個(gè)月之治療假日，進(jìn)行1至4個(gè)或更多循環(huán)的期間，以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約5mg/kg或更高之劑量，如同于密集haart治療模式的輔助治療，可達(dá)成患者的功能性治愈。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類(lèi)、人源化或嵌合抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予hiv患者作為免疫療法以減少病毒量。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類(lèi)、人源化或嵌合抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約5mg/kg或更高之劑量透過(guò)靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予hiv患者作為免疫療法以減少病毒量。

具體實(shí)施方案

本發(fā)明包含以下具體實(shí)施方案：

(1)一種用以治療暴露于hiv感染之受試者的方法，包含：a)投予針對(duì)cd4之單克隆抗體的藥理學(xué)上有效劑量包含：seqidno：1之鼠源抗體b4之重鏈的cdr1、seqidno：2之鼠源抗體b4之重鏈的cdr2、seqidno：3之鼠源抗體b4之重鏈的cdr3、seqidno：4之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr1、seqidno：5之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr2，以及seqidno：6之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr3；b)在步驟(a)后評(píng)估受試者血液之每毫升的hivrna水平。

(2)依據(jù)(1)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：7。

(3)依據(jù)(1)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：9。

(4)依據(jù)(1)的方法，其中抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(5)依據(jù)(1)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：7，且抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(6)依據(jù)(1)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：9，且抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(7)依據(jù)(1)的方法，其中投予步驟(a)是于暴露于hiv感染24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。

(8)依據(jù)(1)的方法，其中投予步驟(a)是于暴露于hiv感染48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。

(9)依據(jù)(1)的方法，其中單克隆抗體的藥理學(xué)上有效劑量是以于12周之期間內(nèi)以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約為10μg/ml或更高之血清水平被投予。

(10)依據(jù)(1)的方法，其中低于1個(gè)拷貝/ml之每毫升的hivrna水平數(shù)值被視為病毒的根除。

(11)依據(jù)(1)的方法，其中介于1至低于50個(gè)拷貝/ml之每毫升的hivrna水平數(shù)值被視為病毒的功能性治愈。

(12)一種用以治療hiv患者的方法，包含：a)投予組合物之藥理學(xué)上有效劑量，此組合物包含針對(duì)cd4之單克隆抗體，此針對(duì)cd4之單克隆抗體包含：seqidno：1之鼠源抗體b4之重鏈的cdr1、seqidno：2之鼠源抗體b4之重鏈的cdr2、seqidno：3之鼠源抗體b4之重鏈的cdr3、seqidno：4之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr1、seqidno：5之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr2，以及seqidno：6之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr3；以及高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)；以及b)在步驟(a)后評(píng)估受試者血液中每毫升的hivrna水平。

(13)依據(jù)(12)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：7。

(14)依據(jù)(12)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：9。

(15)依據(jù)(12)的方法，其中抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(16)依據(jù)(12)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：7，且抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(17)依據(jù)(12)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：9，且抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(18)依據(jù)(12)的方法，其中抗體的藥理學(xué)上有效劑量是以每周或每?jī)芍苤A(chǔ)以10mg/kg或更高之劑量被投予。

(19)依據(jù)(12)的方法，其中抗體是以間歇模式被投予以作為于haart治療模式中的輔助治療。

(20)依據(jù)(19)的方法，其中每循環(huán)是于約2至4個(gè)月之期間投予抗體作為haart治療模式中的輔助治療，之后為haart治療模式中1至2個(gè)月的抗體治療假日。

(21)依據(jù)(20)的方法，其中間歇方式持續(xù)一至四循環(huán)的期間。

(22)一種用以治療hiv患者的方法，包含：a)藉由活化患者體內(nèi)之潛伏感染細(xì)胞的hiv病毒表達(dá)和細(xì)胞凋亡，以減少于hiv患者體內(nèi)的潛伏hiv病毒庫(kù)；以及b)對(duì)患者投予haart的藥理學(xué)上有效劑量。

(23)依據(jù)(22)的方法，其中活化患者體內(nèi)潛伏感染細(xì)胞的hiv病毒表達(dá)和細(xì)胞凋亡是藉由對(duì)患者投予針對(duì)cd4之單克隆抗體的藥理學(xué)上有效劑量而加以執(zhí)行，包含：seqidno：1之鼠源抗體b4之重鏈的cdr1、seqidno：2之鼠源抗體b4之重鏈的cdr2、seqidno：3之鼠源抗體b4之重鏈的cdr3、seqidno：4之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr1、seqidno：5之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr2，以及seqidno：6之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr3。

(24)依據(jù)(22)的方法，其中活化患者體內(nèi)潛伏感染細(xì)胞的hiv病毒表達(dá)和細(xì)胞凋亡是藉由對(duì)患者投予組蛋白脫乙酰酶(hdac)抑制劑而加以執(zhí)行。

(25)一種用以治療暴露于hiv感染之受試者的方法，包含：a)投予對(duì)cd4類(lèi)cdr2結(jié)構(gòu)域區(qū)域(cdr2-likedomainregion)具有高度親和力之單克隆抗體的藥理學(xué)上有效劑量；以及b)在步驟(a)后評(píng)估受試者血液之每毫升的hivrna水平。

(26)依據(jù)(25)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：7。

(27)依據(jù)(25)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：9。

(28)依據(jù)(25)的方法，其中抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(29)依據(jù)(25)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：7，且抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(30)依據(jù)(25)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：9，且抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(31)依據(jù)(25)的方法，其中投予步驟(a)是于暴露于hiv感染24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。

(32)依據(jù)(25)的方法，其中投予步驟(a)是于暴露于hiv感染48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。

(33)依據(jù)(25)的方法，其中單克隆抗體的藥理學(xué)上有效劑量是于12周之期間內(nèi)以每周或每?jī)芍苤畷r(shí)程表以約10μg/ml或更高之血清水平被投予。

(34)依據(jù)(25)的方法，其中低于1個(gè)拷貝/ml之每毫升的hivrna水平數(shù)值被視為病毒的根除。

(35)依據(jù)(25)的方法，其中介于1至低于50個(gè)拷貝/ml之每毫升的hivrna水平數(shù)值被視為病毒的功能性治愈。

額外的具體實(shí)施方案

(1)一種用以治療暴露于hiv之受試者的方法，包含投予受試者針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1之抗體的藥理學(xué)上有效劑量。

(2)依據(jù)(1)的方法，其中抗體特異性地結(jié)合位于cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域。

(3)依據(jù)(2)的方法，其中抗體為單克隆抗體、多克隆抗體，或其組合。

(4)依據(jù)(2)的方法，其中抗體為人源化單克隆抗體。

(5)依據(jù)(4)的方法，其中人源化單克隆抗體包含：重鏈氨基酸序列包含：seqidno：1的cdr1、seqidno：2的cdr2，以及seqidno：3的cdr3；以及輕鏈氨基酸序列包含：seqidno：4的cdr1、seqidno：5的cdr2，以及seqidno：6的cdr3。

(6)依據(jù)(4)的方法，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：11之氨基酸序列的重鏈；以及包含seqidno：13之氨基酸序列的輕鏈。

(7)依據(jù)(4)的方法，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：10之氨基酸序列的重鏈；以及包含seqidno：8之氨基酸序列的輕鏈。

(8)依據(jù)(7)的方法，其中重鏈包含seqidno：7的氨基酸序列。

(9)依據(jù)(8)的方法，其中人源化抗體是于暴露于hiv前投予受試者。

(10)依據(jù)(8)的方法，其中人源化抗體是于暴露于hiv后投予受試者。

(11)依據(jù)(10)的方法，其中人源化抗體是于暴露于hiv后48小時(shí)內(nèi)投予。

(12)依據(jù)(8)的方法，其中人源化抗體是以至少約5mg/kg體重之劑量投予受試者。

(13)依據(jù)(12)的方法，其中人源化抗體是以多次投予受試者。

(14)依據(jù)(13)的方法，其中人源化抗體是以每周或每?jī)芍苤g隔投予受試者。

(15)依據(jù)(13)的方法，更包含投予受試者抗病毒藥物之步驟。

(16)依據(jù)(15)的方法，其中抗病毒藥物為高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)。

(17)依據(jù)(16)的方法，其中haart包含核苷類(lèi)似物反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑合并使用蛋白酶抑制劑或非核苷類(lèi)反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。

(18)依據(jù)(16)的方法，其中人源化抗體是與haart同時(shí)投予。

(19)依據(jù)(16)的方法，其中在循環(huán)的期間內(nèi)投予受試者人源化抗體和haart，其中此循環(huán)包含：(i)以每周或每?jī)芍苤g隔于4個(gè)月之期間對(duì)受試者投予人源化抗體，之后為兩個(gè)月的治療假日；以及(ii)于(i)內(nèi)之六個(gè)月期間持續(xù)地對(duì)此受試者投予haart。

(20)依據(jù)(18)的方法，其中受試者是以二循環(huán)的期間治療。

(21)一種用以治療hiv感染之受試者的方法，包含投予此受試者治療方案包含：(a)針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1之抗體的藥理學(xué)上有效劑量；以及(b)高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)。

(22)依據(jù)(21)的方法，其中抗體特異性地結(jié)合位于cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域。

(23)依據(jù)(22)的方法，其中抗體為單克隆抗體、多克隆抗體，或其組合。

(24)依據(jù)(22)的方法，其中抗體為人源化單克隆抗體。

(25)依據(jù)(24)的方法，其中人源化單克隆抗體包含：重鏈氨基酸序列包含：seqidno：1的cdr1、seqidno：2的cdr2，以及seqidno：3的cdr3；以及輕鏈氨基酸序列包含：seqidno：4的cdr1、seqidno：5的cdr2，以及seqidno：6的cdr3。

(26)依據(jù)(24)的方法，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：11之氨基酸序列的重鏈；以及包含seqidno：13之氨基酸序列的輕鏈。

(27)依據(jù)(24)的方法，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：10之氨基酸序列的重鏈；以及包含seqidno：8之氨基酸序列的輕鏈。

(28)依據(jù)(27)的方法，其中人源化抗體是以至少約5mg/kg體重之劑量投予受試者。

(29)依據(jù)(21)的方法，其中在循環(huán)的期間內(nèi)投予受試者治療方案，其中此循環(huán)包含：(i)以每周或每?jī)芍苤g隔于4個(gè)月之期間對(duì)受試者投予人源化抗體，之后為兩個(gè)月的治療假日；以及(ii)于(i)內(nèi)之六個(gè)月期間持續(xù)地對(duì)此受試者投予haart。

(30)依據(jù)(18)的方法，其中此受試者是以二循環(huán)治療。

更具體實(shí)施方案

(1)一種用以治療暴露于hiv之受試者的組合物包含：針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1之抗體的藥理學(xué)上有效劑量。

(2)依據(jù)(1)的組合物，其中抗體特異性地結(jié)合位于cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域。

(3)依據(jù)(2)的組合物，其中抗體為單克隆抗體、多克隆抗體，或其組合。

(4)依據(jù)(2)的組合物，其中抗體為人源化單克隆抗體。

(5)依據(jù)(4)的組合物，其中人源化單克隆抗體包含：重鏈氨基酸序列包含：seqidno：1的cdr1、seqidno：2的cdr2，以及seqidno：3的cdr3；以及輕鏈氨基酸序列包含：seqidno：4的cdr1、seqidno：5的cdr2，以及seqidno：6的cdr3。

(6)依據(jù)(4)的組合物，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：11之氨基酸序列的重鏈，以及包含seqidno：13之氨基酸序列的輕鏈。

(7)依據(jù)(4)的組合物，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：10之氨基酸序列的重鏈；以及包含seqidno：8之氨基酸序列的輕鏈。

(8)依據(jù)(7)的組合物，其中重鏈包含seqidno：7的氨基酸序列。

(9)依據(jù)(8)的組合物，其中人源化抗體是于暴露于hiv前投予受試者。

(10)依據(jù)(8)的組合物，其中人源化抗體是于暴露于hiv后投予受試者。

(11)依據(jù)(10)的組合物，其中人源化抗體是于暴露于hiv后48小時(shí)內(nèi)投予。

(12)依據(jù)(8)的組合物，其中人源化抗體是以至少約5mg/kg體重之劑量投予受試者。

(13)依據(jù)(12)的組合物，其中人源化抗體是以多次投予受試者。

(14)依據(jù)(13)的組合物，其中人源化抗體是以每周或每?jī)芍苤g隔投予受試者。

(15)依據(jù)(13)的組合物，其中是以抗病毒藥物治療(或投予)受試者。

(16)依據(jù)(15)的組合物，其中抗病毒藥物為高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)。

(17)依據(jù)(16)的組合物，其中haart包含核苷類(lèi)似物反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑合并使用蛋白酶抑制劑或非核苷類(lèi)反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。

(18)依據(jù)(16)的組合物，其中人源化抗體是與haart同時(shí)投予。

(19)依據(jù)(16)的組合物，其中在循環(huán)的期間內(nèi)投予受試者人源化抗體和haart，其中此循環(huán)包含：(i)以每周或每?jī)芍苤g隔于4個(gè)月之期間對(duì)受試者投予人源化抗體，之后為兩個(gè)月的治療假日；以及(ii)于(i)內(nèi)之六個(gè)月期間持續(xù)地對(duì)此受試者投予haart。

(20)依據(jù)(18)的組合物，其中受試者是以二循環(huán)的期間治療。

(21)一種用以治療hiv感染之受試者的組合物包含：(a)針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1之抗體的藥理學(xué)上有效劑量；以及(b)高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)。

(22)依據(jù)(21)的組合物，其中抗體特異性地結(jié)合位于cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域。

(23)依據(jù)(22)的組合物，其中抗體為單克隆抗體、多克隆抗體，或其組合。

(24)依據(jù)(22)的組合物，其中抗體為人源化單克隆抗體。

(25)依據(jù)(24)的組合物，其中人源化單克隆抗體包含：重鏈氨基酸序列包含：seqidno：1的cdr1、seqidno：2的cdr2，以及seqidno：3的cdr3；以及輕鏈氨基酸序列包含：seqidno：4的cdr1、seqidno：5的cdr2，以及seqidno：6的cdr3。

(26)依據(jù)(24)的組合物，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：11之氨基酸序列的重鏈；以及包含seqidno：13之氨基酸序列的輕鏈。

(27)依據(jù)(24)的組合物，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：10之氨基酸序列的重鏈，以及包含seqidno：8之氨基酸序列的輕鏈。

(28)依據(jù)(27)的組合物，其中人源化抗體是以至少約5mg/kg體重之劑量投予受試者。

(29)依據(jù)(21)的組合物，其中在循環(huán)的期間內(nèi)投予受試者治療方案，其中此循環(huán)包含：(i)以每周或每?jī)芍苤g隔于4個(gè)月之期間對(duì)受試者投予人源化抗體，之后為兩個(gè)月的治療假日；以及(ii)于(i)內(nèi)之六個(gè)月期間持續(xù)地對(duì)此受試者投予haart。

(30)依據(jù)(18)的組合物，其中此受試者是以二循環(huán)治療。

除非特別說(shuō)明，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)用語(yǔ)如本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者的通常理解具有相同意義。除非上下文清楚地指出，否則單詞“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包含復(fù)數(shù)形式。類(lèi)似地，單詞“或(or)”是意指包括“和(and)”，除非上下文另有明確說(shuō)明。因此，“包含a或b”是指包括a，或b，或a和b。更應(yīng)被理解的是，用于給定多肽之所有的氨基酸大小和所有分子量或分子質(zhì)量值是近似的，并且被提供作為描述之用。然而類(lèi)似或等同于在此描述者的方法和材料可被用于以下所述之揭露的方法、合適的方法和材料的實(shí)踐或測(cè)試中。所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和在此提及的其它參考文獻(xiàn)透過(guò)引用在此并入本文整體。在沖突的情況下，以本說(shuō)明書(shū)(包括術(shù)語(yǔ)的解釋)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅是說(shuō)明性的而非意指加以限制。

所提供圖式和相關(guān)實(shí)施例的以下說(shuō)明性解釋是用以便于理解在此頻繁使用的某些術(shù)語(yǔ)，特別是在實(shí)施例中。解釋是為便利性而被提供而非用以限制本發(fā)明。

【實(shí)施例】

實(shí)施例1.mabb4的免疫和功能特性

單克隆抗體b4(mabb4)為可辨識(shí)位于t細(xì)胞表面之復(fù)合hiv受體位點(diǎn)(cd4)的單克隆抗體。mabb4可影響和妨礙cd4和hiv共受體的相互作用。mabb4優(yōu)先地中和原代hiv-1分離株。

以下資訊總結(jié)了鼠源mabb4之發(fā)現(xiàn)與初步的特性研究，其包含引用自?xún)善獙?zhuān)利(由wang所發(fā)明的美國(guó)5,912,176號(hào)和6,090,388號(hào)專(zhuān)利)和wang等人于1999年發(fā)表期刊論文的資料，其均透過(guò)引用以并入本文整體。

1.衍生自hpb-all免疫之鼠源單克隆抗體

以完整、未感染的cd4+人類(lèi)hpb-all細(xì)胞、t細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞株免疫balb/c小鼠以提供mabb4。

所提供之新種類(lèi)的抗-cd4抗體(以mabb4表示)對(duì)位于細(xì)胞表面之cd4具有特異性，且對(duì)hiv-1的原代分離株具有廣泛的中和活性。

2.mabb4辨識(shí)位置的特征

相較于重組可溶性cd4(rscd4)，發(fā)現(xiàn)mabb4優(yōu)先地辨識(shí)位于細(xì)胞表面上的膜結(jié)合cd4(membrane-boundcd4)。

于暴露于hiv前之mabb4結(jié)合至膜結(jié)合cd4顯示可阻斷后續(xù)gp120和整個(gè)病毒附著至cd4。然而，于暴露于抗體前就已結(jié)合至gp120的膜結(jié)合cd4仍然可結(jié)合mabb4。因此，mabb4能影響gp120結(jié)合至膜結(jié)合cd4，但是gp120并不影響mabb4結(jié)合至cd4。

mabb4的辨識(shí)位置有別于其它已充分研究之抗-cd4單克隆抗體的辨識(shí)位置，包含可辨識(shí)cd4結(jié)構(gòu)域1之單克隆抗體leu3a和okt4a(chiba，y.1992；jameson，b.d.，etal.，1988)，以及可辨識(shí)cd4結(jié)構(gòu)域2之單克隆抗體5a8(burkly，etal.，1992)。

3.mabb4的體外中和活性

透過(guò)一般的定義，鼠源mabb4并非中和性抗體。反而，mabb4是藉由覆蓋宿主細(xì)胞受體，而非藉由附著至病毒，以抑制病毒進(jìn)入?？山逵捎诖祟I(lǐng)域所使用之病毒中和試驗(yàn)而容易地觀察到mabb4對(duì)hiv感染的效果(例如mt-2微斑中和試驗(yàn)(mt-2microplaqueneutralizationassay)(sawyeretal.，1994))。鼠源mabb4的中和活性是由我們的合作者carlhanson博士(加州健康服務(wù)部)所評(píng)估，也于johnmascola博士(亨利杰克遜基金會(huì)，wrair)、davidmontefiori博士(杜克大學(xué))和malcolmmartin博士(niaid)的實(shí)驗(yàn)室中獨(dú)立地評(píng)估。以下hiv中和特性，于1995年至2010年間被廣泛地描繪，其與mabb4相關(guān)：

(1)pbmc生長(zhǎng)的原代分離株(pbmc-grownprimaryisolates)較t細(xì)胞株適應(yīng)的分離株hiv-1iiib和hiv-1mn對(duì)藉由mabb4的中和作用更加敏感。

(2)mabb4可中和透過(guò)使用ccr5/cxcr4(雙性)和ccr5共受體之原代分離株的感染。

(3)mabb4對(duì)使用cxcr4共受體之t細(xì)胞株適應(yīng)的hiv-1分離株具有低活性。

(4)mabb4可中和代表hiv-1亞型a-g之不同合胞誘導(dǎo)型(syncytialinducing(si))和非合胞誘導(dǎo)型(non-syncytialinducing(nsi))的原代分離株，達(dá)到90％終點(diǎn)指標(biāo)(endpoints)與高達(dá)3個(gè)對(duì)數(shù)的感染性。

(5)mabb4可中和具有雙性共受體hiv-1包膜的hiv-2、猿猴免疫不全病毒(siv)和人猴嵌合免疫缺陷病毒(shiv)。

(6)于扁桃體組織系統(tǒng)，mabb4減少了兩個(gè)對(duì)數(shù)之hiv-1原代分離株vl135(hiv-1vl135)的感染性。在活化的人類(lèi)補(bǔ)體存在下，在此狀況下許多抗-病毒抗體展現(xiàn)抗體依賴(lài)性增強(qiáng)作用，少至12.5μg/ml的mabb4可完全地中和＞100tid50(50％扁桃體感染劑量)的單親細(xì)胞性(monocytotropic)分離株jr-csf。

(7)當(dāng)感染后加入mabb4達(dá)48小時(shí)，mabb4于hiv-lvl135展現(xiàn)中和活性；當(dāng)加入mabb4達(dá)72小時(shí)后，則具有顯著的抗-病毒效果。

a.不論是否與細(xì)胞或病毒預(yù)培養(yǎng)，其均同樣有效。

b.它的作用是藉由阻斷感染的病灶傳播至新的細(xì)胞，而非藉由進(jìn)入后的機(jī)制。

c.在這些試驗(yàn)中，mabb4并不有助于細(xì)胞毒性。

實(shí)施例2.hiv-1中和和抗藥性試驗(yàn)

以下于1998年至2011年期間針對(duì)不同進(jìn)化支之多個(gè)hiv分離株的病毒中和和抗藥性試驗(yàn)是在carlhanson博士和monogram生物科學(xué)公司的實(shí)驗(yàn)室中執(zhí)行。此試驗(yàn)的詳細(xì)說(shuō)明如以下所述。

1.hiv-1中和試驗(yàn)

如每一試驗(yàn)所指明收集血液或抗體樣品。使用mt-2微斑試驗(yàn)或有絲分裂促進(jìn)劑(pha)-刺激的pbmc試驗(yàn)，于一組含有多個(gè)進(jìn)化支(multi-cladepanel)的hiv-1分離株評(píng)估血清或抗體樣品。

1.1.mt-2微斑試驗(yàn)

mt-2微斑試驗(yàn)限于hiv的合胞誘導(dǎo)型分離株。本試驗(yàn)于96孔盤(pán)上進(jìn)行，于其藉由在微斑上合胞的熒光染色可計(jì)數(shù)到高達(dá)每孔洞25個(gè)微小空斑。在此試驗(yàn)中，受感染的mt-2細(xì)胞藉由透過(guò)熔化的瓊脂糖離心形成單層，此熔化的瓊脂糖于離心期間膠化。此試驗(yàn)被認(rèn)為具有敏感性并具有遍布多個(gè)數(shù)量級(jí)數(shù)的動(dòng)態(tài)范圍。此試驗(yàn)也被視為是處理大量樣品時(shí)唯一具有效率的方法。利用電腦化統(tǒng)計(jì)分析大量復(fù)制的孔洞，以提供使用其它方式所難以達(dá)成之品質(zhì)控制與標(biāo)準(zhǔn)化的程度。

1.2.pbmc試驗(yàn)

pbmc試驗(yàn)是一種標(biāo)準(zhǔn)的抗原-減少試驗(yàn)，于此試驗(yàn)中，在受感染的細(xì)胞于96孔微量盤(pán)生長(zhǎng)后，以抗原-捕獲elisa定量于pbmcs的p24抗原表達(dá)。此試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)在于其適用于所有的hiv病毒株與分離株。

1.3.病毒原液

用于體外與體內(nèi)中和試驗(yàn)的hiv原液列于表3、表5和表6，以及圖1a、1b、3、22和23。來(lái)自亞型a至g和h之原代hiv-1病毒為：(a)分離自參加病毒和立克次體疾病實(shí)驗(yàn)室(vrdl)加州健康服務(wù)部之舊金山男性健康研究的男性同性戀者；(b)由hiv分離和鑒定之世界衛(wèi)生組織網(wǎng)絡(luò)取得，(c)由美國(guó)軍方hiv研究計(jì)劃提供，以及(d)由國(guó)家過(guò)敏和傳染病研究所aids研究和參考試劑計(jì)劃所饋贈(zèng)。dh-12(由患者分離，于黑猩猩外周血單核細(xì)胞(pbmc)繼代)也是由國(guó)家過(guò)敏和傳染病研究所aids研究和參考試劑計(jì)劃所提供。

1.4.b4或db4中和活性

b4或db4中和活性定義為相對(duì)于不含抗體之對(duì)照組可提供指定百分比(50-95％)之病毒減少的抗體濃度。藉由于抗體稀釋物之間的內(nèi)插法推導(dǎo)出在50％和90％終點(diǎn)指標(biāo)之抗體濃度。

2.phenosensehiv進(jìn)入試驗(yàn)

用以測(cè)定抗藥性之phenosensehiv進(jìn)入試驗(yàn)是于monogram生物科學(xué)公司執(zhí)行(南舊金山，加州)。

利用從載體庫(kù)產(chǎn)生的重組病毒于不同濃度之藥物或抗體(例如b4或db4)存在下感染細(xì)胞。依據(jù)50％(ic50)或90％(ic90)測(cè)定用以抑制試驗(yàn)載體之病毒復(fù)制所需的藥物量。

2.1.使用于phenosensehiv試驗(yàn)之重組病毒的產(chǎn)生

phenosensehiv試驗(yàn)使用之重組病毒來(lái)自于患者的樣本，此些患者是于hiv感染之縱貫性研究中所篩選出，并確定為hiv血清反應(yīng)陽(yáng)性者。對(duì)于發(fā)生hiv感染者，收集臨床和血漿樣品以供實(shí)驗(yàn)室評(píng)估(包括hiv病毒量和cd4細(xì)胞數(shù)量)。對(duì)于起初是血清反應(yīng)陰性但于后續(xù)約一年變成血清反應(yīng)陽(yáng)性的個(gè)體，利用兩個(gè)酶免疫分析法和western印跡法之確證加以確認(rèn)hiv感染。

收集來(lái)自于血清轉(zhuǎn)化期間具有亞型a、bf、c、d、e、ea、f、g或j之受試者的樣品(基于先前的hiv亞型分析，其乃利用多個(gè)雜交分析而達(dá)成)，用以建構(gòu)重組病毒(如表3所示)。由試驗(yàn)樣品放大hivenv、pol區(qū)域，并克隆放大的dnas進(jìn)入試驗(yàn)載體。于geneseqhiv，定序載體庫(kù)以確定hiv基因型。于phenosensehiv試驗(yàn)，于不同藥物濃度存在下利用從載體庫(kù)產(chǎn)生的重組病毒感染細(xì)胞。

實(shí)施例3.mabb4對(duì)所有進(jìn)化支之hiv分離株的中和活性(利用monogram生物科學(xué)的phenosense試驗(yàn))

已證實(shí)mabb4可中和b進(jìn)化支的所有hiv病毒。于本試驗(yàn)中共計(jì)73個(gè)具代表性的非b進(jìn)化支hiv分離株，將來(lái)自進(jìn)化支a(n＝8)、bf(n＝1)、c(n＝18)、d(n+18)、e(n＝4)、ea(n＝10)、f(n＝8)、g(n+4)、j(n＝2)，加上三個(gè)對(duì)照組病毒92ht594、jrcsf、jrfl，制成重組病毒，并于phenosensehiv試驗(yàn)中測(cè)試，以分析其對(duì)mabb4的敏感性(請(qǐng)參見(jiàn)表3)。顯示所有重組病毒對(duì)mabb4具有高度敏感性，其具有無(wú)先例的低ic50和ic90濃度，具有平均ic50＝0.018μg/ml和ic90＝0.062μg/ml。值得注意的是，發(fā)現(xiàn)這些hiv病毒分離株中的多個(gè)衍生自具多重抗藥性患者，此清楚地表明mabb4或其人類(lèi)對(duì)應(yīng)物在已經(jīng)對(duì)hiv藥物產(chǎn)生抗藥性之患者的治療中具有高效率。

實(shí)施例4.單克隆抗體b4的競(jìng)爭(zhēng)型hiv進(jìn)入抑制：預(yù)防治療后之hiv抗藥性突變種的不可預(yù)期效果

競(jìng)爭(zhēng)型抑制試驗(yàn)可評(píng)估抑制劑(例如，進(jìn)入抑制劑抗體)與hiv包膜蛋白競(jìng)爭(zhēng)位在cd4上相同受體結(jié)合位點(diǎn)從而抑制hiv進(jìn)入細(xì)胞的能力和療效。理論試驗(yàn)中，mabb4和hiv包膜蛋白(gp120)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合cd4。圖1a顯示此試驗(yàn)的預(yù)測(cè)結(jié)果，在此每一條線(xiàn)代表不同的病毒分離株。具體地，從此理論試驗(yàn)的預(yù)期結(jié)果證明，雖然不同的病毒分離株對(duì)mabb4具有不同敏感性(ic50)，但只要mabb4存在足夠濃度下可抑制所有病毒分離株的進(jìn)入，幅度達(dá)100％。

透過(guò)比較，非競(jìng)爭(zhēng)型抑制試驗(yàn)可評(píng)估抑制劑(例如，共受體拮抗劑或結(jié)合于cd4之不同部分的抗體)抑制或降低hiv包膜蛋白結(jié)合至cd4從而抑制hiv進(jìn)入細(xì)胞的能力和療效。在理論試驗(yàn)中，分析非競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑(例如，tmb-355)抑制hiv包膜蛋白(gp120)結(jié)合cd4的能力。圖1b顯示此試驗(yàn)的預(yù)測(cè)結(jié)果，在此每一條線(xiàn)代表不同的病毒分離株。具體地，從此理論試驗(yàn)的預(yù)期結(jié)果證明，不同的病毒分離株對(duì)tmb-355具有不同敏感性(ic50)，且不論tmb-355呈現(xiàn)量為何，至少一些部份的病毒分離株可進(jìn)入細(xì)胞?；诖死碚撛囼?yàn)，如同于最大抑制百分比的“高原”，可預(yù)期不論ic50為何均可觀察到hiv抗藥性。

tmb-355(原tnx-355，也稱(chēng)為ibalizumab)為人源化igg4單克隆抗體，設(shè)計(jì)其結(jié)合恒河猴和人類(lèi)cd4之細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域2以避免hiv結(jié)合后進(jìn)入cd4+細(xì)胞(例如，burkly，lc，etal.，1992；以及kurizkes，dr，etal.，2004)。位于cd4之tmb-355抗體結(jié)合位點(diǎn)有別于hiv包膜蛋白gp120結(jié)合所需之位點(diǎn)，且有別于與主要組織相容性復(fù)合體蛋白質(zhì)相互作用所需之位點(diǎn)。據(jù)此，tmb-355介導(dǎo)非競(jìng)爭(zhēng)型hiv進(jìn)入抑制。

已顯示tmb-355對(duì)一些hiv-1病毒具有強(qiáng)烈的中和活性，但是當(dāng)以一組廣泛的hiv-1病毒株評(píng)估時(shí)，其抑制活性與中和活性并不一致。圖2顯示tmb-355的最大抑制百分比(mpi)介于100％至15％(左邊的y軸)，伴隨由0.01μg/ml至10μg/ml之增加的ic50(右邊的y軸)，對(duì)一組118種env假型hiv病毒，以每一長(zhǎng)條代表一種病毒分離株(song，r.，etal.，2013)。于分析的所有進(jìn)化支中，進(jìn)化支a和e病毒較非進(jìn)化支a和e病毒對(duì)tmb-355顯著地具有敏感性。此外，發(fā)現(xiàn)來(lái)自接受tmb-355治療以減少病毒量之患者的病毒抗藥性突變種于gp120的v5區(qū)域具有突變(toma，j.，etal.，2011；pace，c.s.，etal.，2013)。以tmb-355(ibalizumab)所證明之非競(jìng)爭(zhēng)型抑制效應(yīng)顯示在抗體治療期間有發(fā)展抗藥性hiv突變種的高度可能性，因?yàn)榫哂械陀?00％抑制的分離株會(huì)發(fā)生病毒復(fù)制。

相反地，來(lái)自一組超過(guò)850種env假型hiv病毒于10年期間收集的結(jié)果顯示，mabb4于hiv進(jìn)入抑制提供了非預(yù)期之廣泛性與效力(圖3)。從這些收集的數(shù)據(jù)可見(jiàn)mabb4具有接近100％最大抑制百分比(mpi)，具有兩個(gè)ic50濃度，一個(gè)是介于0.01至1μg/ml，且另一個(gè)是約10μg/ml。mabb4之hiv進(jìn)入抑制曲線(xiàn)具有競(jìng)爭(zhēng)型抑制機(jī)制的典型特性，無(wú)論ic50為何，其對(duì)每一hiv病毒具有為～100％之mpi。鑒于mabb4之顯著強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)型hiv進(jìn)入抑制特性，故在mabb4治療期間不大可能會(huì)發(fā)展出病毒抗藥性突變種。這種嚴(yán)密的競(jìng)爭(zhēng)型抑制，如透過(guò)mabb4所展現(xiàn)者，迄今從未以任何其它測(cè)試的hiv抑制劑觀察到。

來(lái)自此實(shí)施例之mpi和ic50，與顯示衍生自多重抗藥性患者之多個(gè)hiv分離株對(duì)mabb4具有高度敏感性的數(shù)據(jù)(實(shí)施例3)相結(jié)合，顯示mabb4或其人類(lèi)對(duì)應(yīng)物于haart治療失敗之抗藥性hiv患者治療上具有高效率。由mabb4所介導(dǎo)之中和模式提供獨(dú)特hiv藥物，其可于接受mabb4或其人類(lèi)對(duì)應(yīng)相似物(具有相似fv區(qū)域)治療的hiv患者中預(yù)防抗藥性病毒突變種的產(chǎn)生。

實(shí)施例5.單克隆抗體b4的人源化

因?yàn)槭笤纯贵w，mabb4于人類(lèi)具有免疫原性。可透過(guò)已知的去免疫化技術(shù)(jones，t.d.，etal.2009)之過(guò)程達(dá)到鼠源抗體的人源化。mabb4的去免疫化于lynn.，s.和wang，c.y.之美國(guó)7,501,494號(hào)專(zhuān)利中已詳細(xì)描述(其均透過(guò)引用以并入本文整體)，如同以下內(nèi)容所概述。

首先，完全地移除鼠源抗體b4的恒定區(qū)(ch和cκ)，并以人類(lèi)igg1的恒定區(qū)(分別為seqidnos：12和14)取代，然而保留fv部分，從而制造嵌合b4抗體。接下來(lái)，為供人類(lèi)使用而將鼠源mabb4之fv片段去免疫化，此是藉由辨識(shí)與除去潛在具有免疫原性之鼠源t和b-細(xì)胞抗原表位而達(dá)成。在從mabb4的可變區(qū)中辨別此種抗原表位之后移除t細(xì)胞抗原表位。為了呈現(xiàn)第二型主要組織相容性復(fù)合體結(jié)合域(mhcclassii-bindingmotifs)而利用三維“肽鏈線(xiàn)化”方法以分析可變區(qū)的氨基酸序列。藉由表面殘基的“鑲飾”達(dá)成由可變區(qū)移除b細(xì)胞抗原表位而不妨礙抗體辨識(shí)。此去免疫化人源化形式的mabb4稱(chēng)為mabdb4。

lynn.，s.和wang，c.y.之美國(guó)7,501,494號(hào)專(zhuān)利討論到igg1于ch2區(qū)域中含有雙觸角復(fù)合n端結(jié)合碳水化合物，其對(duì)于效應(yīng)器作用(effectorfunctions)具有重要性，例如補(bǔ)體結(jié)合和抗原依賴(lài)細(xì)胞毒性作用(antigen-dependent-cellular-cytotoxicity，adcc)，可造成目標(biāo)抗原的消除。因?yàn)閙abb4作用于cd4受體復(fù)合體，其可透過(guò)負(fù)責(zé)結(jié)合補(bǔ)體之igg1的效應(yīng)器作用造成cd4+細(xì)胞的破壞和cd4+細(xì)胞功能的免疫抑制。因此，移除位于igg1之fc區(qū)域的n-糖化點(diǎn)可破壞igg1結(jié)合至人類(lèi)fcr1的能力，以活化補(bǔ)體，或結(jié)合c1q，從而消除igg介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴(lài)型細(xì)胞毒性作用(cdc)。藉由以his(h)取代氨基酸殘基asn(n)(即n298h)達(dá)成移除位于igg1之fc區(qū)域的n-糖化點(diǎn)。

在本說(shuō)明書(shū)中所討論的氨基酸編號(hào)/位置是基于包含在序列表中的序列，此序列表為本說(shuō)明書(shū)的一部分。應(yīng)該注意的是，以上所討論之位在第298個(gè)氨基酸之糖化點(diǎn)對(duì)應(yīng)于天然igg1分子中位于第297個(gè)氨基酸之糖化點(diǎn)，它是根據(jù)用于igg1的歐洲編號(hào)系統(tǒng)所編號(hào)的。因此，本申請(qǐng)案之第298個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)于美國(guó)7,501,494號(hào)專(zhuān)利中位于第297個(gè)氨基酸之糖化點(diǎn)。

fv結(jié)構(gòu)域之去免疫化mabdb4重鏈(圖4)和輕鏈(圖5)的cdr1、2和3區(qū)域分別包含seqidnos：1至6的氨基酸序列(表4)。mabdb4重鏈和輕鏈的完整氨基酸序列分別地如圖4和5所示，如seqidnos：7和8。

發(fā)現(xiàn)當(dāng)突變位于抗體重鏈的某些氨基酸時(shí)可改進(jìn)(延長(zhǎng))mabdb4的半衰期。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)位于第253(met)、255(ser)和257(thr)個(gè)重鏈fc氨基酸分別以tyr、thr和glu取代時(shí)可改進(jìn)人源化抗體之半衰期。人源化mabdb4抗體經(jīng)改進(jìn)之重鏈的全長(zhǎng)序列如圖6所示，如seqidno：9。據(jù)此，經(jīng)改進(jìn)之人源化抗體mabdb4包含具有seqidno：8氨基酸序列之輕鏈，以及具有seqidno：9氨基酸序列之重鏈。

鼠源mabb4和人源化mabdb4之序列和結(jié)構(gòu)的獨(dú)特特性為存在位于第101個(gè)氨基酸位置(asn101)的糖類(lèi)結(jié)合殘基asn，于fv的重鏈中。此糖類(lèi)結(jié)合位點(diǎn)對(duì)其fv區(qū)域位置是獨(dú)特的，其意外地隱藏于fv結(jié)構(gòu)域內(nèi)，且只可藉由整個(gè)抗體分子的變性而曝露出來(lái)供酶裂解。起初于fv區(qū)域呈現(xiàn)此糖類(lèi)使抗體特性復(fù)雜化。然而，對(duì)糖鏈或結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行修飾會(huì)破壞抗體對(duì)cd4的結(jié)合親和力。因此，此位于fv區(qū)域之獨(dú)特的n-糖化點(diǎn)對(duì)抗體結(jié)合至cd4是具關(guān)鍵性的。

圖7說(shuō)明mabdb4之完整長(zhǎng)度的重鏈氨基酸序列，其強(qiáng)調(diào)圖4和6于上述所討論的糖化、取代和突變位置。

實(shí)施例6.利用mt-2微斑、pbmc中和試驗(yàn)和phenosense進(jìn)入試驗(yàn)證明mabdb4和其親本mabb4間的生物相等性

進(jìn)行廣泛的比較研究，以評(píng)估去免疫化/人源化，fc-無(wú)糖基化的mabdb4和親本鼠源mabb4的生物相等性，以確保人源化形式可在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物和人類(lèi)供進(jìn)一步毒性/安全性和療效研究。來(lái)自這些比較研究的結(jié)果概述于下文。

(1)高靈敏性的hiv-1中和試驗(yàn)，分別以來(lái)自進(jìn)化支a、b、c、d和e，以及來(lái)自進(jìn)化支c和e之具代表性的hiv分離株，于mt-2微斑和有絲分裂促進(jìn)劑(mitogen)刺激的pbmc試驗(yàn)中進(jìn)行。利用去免疫化技術(shù)將鼠源mabb4人源化形成mabdb4抗體后并未造成hiv中和活性的喪失。比較結(jié)果如mt-2微斑(表5)和基于pbmc之試驗(yàn)(表6)所示。

(2)因?yàn)闇y(cè)得對(duì)來(lái)自所有進(jìn)化支之所有hiv分離株的ic50s和ic90s彼此間落于兩倍以?xún)?nèi)，因此證明鼠源mabb4和mabdb4間的生物相等性。

(3)在表達(dá)雙重受體(cxcr4和ccr5或x4/r5)的細(xì)胞株u87和具有各種向性之經(jīng)挑選hiv分離株(包含jrcsf(r5)、hxb2(x4)、92th594(r5/x4)、原代分離株#5(r5)、原代分離株#6(r5)和原代分離株#7(r5))上進(jìn)行，以評(píng)估藉由mabb4、mabdb4和其它兩個(gè)已知針對(duì)hiv-env之單克隆中和性抗體(2f5和2g12hiv)的hiv進(jìn)入抑制。在此試驗(yàn)中，hiv進(jìn)入抑制是由monogram生物科學(xué)利用假型病毒(假型病毒攜帶來(lái)自數(shù)百個(gè)hiv病毒株之任一者的包膜糖蛋白和熒光酶(1uciferase))而加以評(píng)估。定量于u87-cd4+/ccr5+/cxcr4+細(xì)胞產(chǎn)生之生物發(fā)光以測(cè)定抗體的中和作用，此細(xì)胞是利用生物工程于hivtat控制下表達(dá)熒光酶。此試驗(yàn)的結(jié)果如表7所示，其證明：

a.當(dāng)與兩個(gè)最具效力之抗-hivenv抗體2f5(第1列)和2g12(第2列)相比較時(shí)，鼠源mabb4(mub4；第4列)于hiv進(jìn)入抑制上較二者更具效力。對(duì)不同hiv分離株之相對(duì)應(yīng)的ic50s分別為0.04vs4和0.8；0.4vs0.07和0.5；0.05vs3和1.3；0.05vs50和20；0.05vs2和3；0.03vs≥100和2；以及

b.當(dāng)以各種向性之相同具代表性的hiv分離株測(cè)試時(shí)，鼠源mabb4(mub4；第4列)和mabdb4(第3列)于其ic50s出人意料地相等。

因此充分證明鼠源mabb4和去免疫化的mabdb4(二者在重鏈和輕鏈具有相同cdrs)為生物等效性的，且兩種抗體的功能特性在不同的體外和體內(nèi)試驗(yàn)中可為代表彼此的。

實(shí)施例7.(a)對(duì)hpb-all細(xì)胞之db4和mabb4結(jié)合活性；(b)對(duì)pbmccd4陽(yáng)性細(xì)胞之db4結(jié)合活性；(c)對(duì)重組cd4之db4結(jié)合活性，以及(d)對(duì)hpb-all細(xì)胞之db4和gp120結(jié)合活性的特性

1.背景

盡管抗原結(jié)合和功能特性的定性方面是已知的，如同藉由中和試驗(yàn)所證明，對(duì)mabdb4及其親本鼠源mabb4而言如先前實(shí)施例所示，但先前尚未研究過(guò)于cd4+t淋巴細(xì)胞之mabb4和mabdb4定量的細(xì)胞結(jié)合曲線(xiàn)。

測(cè)試鼠源mabb4和其人源化，fc-無(wú)糖基化的igg1單克隆抗體mabdb4在正常人類(lèi)血液cd4+t淋巴細(xì)胞和在cd4+t-白血病hpb-all細(xì)胞之細(xì)胞結(jié)合曲線(xiàn)。使用hpb-all細(xì)胞是因?yàn)槿鐚?shí)施例1所討論是透過(guò)以hpb-all細(xì)胞免疫接種小鼠而選出mabb4。一般的細(xì)胞結(jié)合是利用流式細(xì)胞儀(facs)分析方法評(píng)估，且結(jié)果是基于平均熒光強(qiáng)度(mfi)記述為ec50或ic50數(shù)值。除了評(píng)估抗體一般的細(xì)胞結(jié)合，也研究天然db4igg1分子對(duì)hpb-all細(xì)胞之絕對(duì)結(jié)合親和力(kd)和最大結(jié)合容量(bmax)。

2.材料

2.1.培養(yǎng)液和試劑

培養(yǎng)hpb-all細(xì)胞之rpmi-1640培養(yǎng)液和胎牛血清是來(lái)自gibco(貨號(hào)分別為11875-093和10091-148)。牛血清白蛋白(bsa)是來(lái)自applicchem(貨號(hào)a-0850)。細(xì)胞與測(cè)試抗體之培養(yǎng)是在nunc的v型底96孔盤(pán)(貨號(hào)249662)上進(jìn)行。供樣品制備的微量稀釋管(1.2ml)是來(lái)自bertec(貨號(hào)1710-00)。以2％甲醛固定細(xì)胞；樣品以含有0.05％bsa和0.05％疊氮化鈉之pbs(ph7.4)稀釋?zhuān)磺仪逑匆簽楹?.05％疊氮化鈉之pbs(ph7.4)。

分別利用山羊抗-鼠igg-fitc(sigma，貨號(hào)f8264)和山羊f(ab’)2抗-人iggfcγ-fitc(jacksonimmunoresearch，貨號(hào)109-096-098)追蹤鼠源mabb4和人源化mabdb4之結(jié)合。db4-alexa488綴合物(整篇文章以縮寫(xiě)的“db4-alexa”表示)為于聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)公司(ubi)內(nèi)部制造(ubi批號(hào)0102143)。b4-生物素綴合物來(lái)自u(píng)bi(批號(hào)051807)。綿羊抗-higg-hrp來(lái)自thebindingsite(貨號(hào)ap004)；extravidin-hrp來(lái)自sigmaaldrich(貨號(hào)e2886)；以及可溶性rcd4來(lái)自r&dsystem(貨號(hào)514-cd-050)。肽p2704ahiv包膜來(lái)自u(píng)bi，重組gp120mn來(lái)自immunodiagnostics(貨號(hào)1021-2)。利用抗-cd4(d2)-fitc抗體(ancell，貨號(hào)148-020)選取血液cd4⁺t細(xì)胞供結(jié)合之追蹤使用。利用來(lái)自linearflow^tmgreenflowcytometryintensitycalibrationkits(molecularprobe)的熒光珠作為參考標(biāo)準(zhǔn)，以定量標(biāo)幟細(xì)胞的相對(duì)熒光。使用的其它熒光偵測(cè)器為：fitc-chrompure山羊igg、f(ab′)2片段(jacksonimmunoresearch，貨號(hào)005-090-006)；cd3pe(asr)(bdbiosciences，貨號(hào)340662)；cd45percp(asr)(bdbiosciences，貨號(hào)340665)。

2.2.hpb-all細(xì)胞和周邊血液cd4⁺t細(xì)胞

由dsmzacc提供hpb-all細(xì)胞株(人類(lèi)胸腺衍生急性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞株)。pbmccd4⁺t細(xì)胞(由健康的供血者新鮮地采血至edta-真空采血管內(nèi))衍生自以含有氯化銨之低滲溶液(8.3g/l氯化銨、0.84g/l碳酸氫鈉以及29.4mg/ledta于ph7.4之混合液)分解紅血球后的外周血白細(xì)胞(pbl)。

2.3.鼠源mabb4和人源化db4mab

透過(guò)以hpb-all細(xì)胞作為免疫原之雜交瘤操作提供鼠源單克隆b4igg1(ubi批號(hào)120197)。藉由n298h使b4-衍生的人源化db4igg1成為fc-無(wú)糖基化(實(shí)施例5)。

2.4.elisa和facs偵測(cè)

96孔盤(pán)來(lái)自nalgenuncinternational，平底(cat.442404)的供光學(xué)測(cè)定，v型底的供細(xì)胞培養(yǎng)(cat.249570)。光學(xué)密度是于versamax微量盤(pán)分析儀上讀取(moleculardevices)。以bdfacscaliburscanner(dbbiosciences)偵測(cè)熒光染劑；并透過(guò)相關(guān)的cellquest軟體獲得結(jié)果的數(shù)據(jù)。將來(lái)自elisa和facs的結(jié)合數(shù)據(jù)導(dǎo)入到sigmaplot11軟體進(jìn)行定量分析。

3.方法

3.1.db4對(duì)hpb-all細(xì)胞的結(jié)合

3.1.1.平衡時(shí)間試驗(yàn)

于v型底的微量盤(pán)上，添加每孔洞0.1ml內(nèi)含2x10⁵個(gè)細(xì)胞的溶液，離心，并丟棄液體。于長(zhǎng)達(dá)180分鐘之各種持續(xù)時(shí)間，將細(xì)胞在冰上以100μl高達(dá)100ng/ml之各種濃度的db4溶液加以培養(yǎng)。于培養(yǎng)時(shí)間收集上清液以測(cè)定游離、未結(jié)合的抗體藥物。利用添加之總藥物濃度扣除游離的部份而計(jì)算出結(jié)合的部份。

利用elisa定量于結(jié)合溶液中的游離db4濃度。簡(jiǎn)而言之，此試驗(yàn)涉及涂覆于nuncmaxisorp微量盤(pán)之綿羊抗-higl(0.5μg/ml)混合液的使用，并以綿羊抗-huigg-hrp(1/1000稀釋)作為檢測(cè)蛋白質(zhì)?；?.14-18.5ng/ml范圍內(nèi)之校正標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定于未知樣品中的游離db4濃度。

3.1.2.與db4直接結(jié)合試驗(yàn)

于v型底的微量盤(pán)上，添加每孔洞0.1ml內(nèi)含2x10⁵個(gè)細(xì)胞的溶液，離心，并丟棄液體。將細(xì)胞在冰上以100μl高達(dá)2000ng/ml之各種濃度的db4溶液培養(yǎng)1小時(shí)。培養(yǎng)之后，移除db4，并加入與起始培養(yǎng)所使用相同濃度之db4的新鮮溶液至細(xì)胞中，并在冰上再培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)。重復(fù)此步驟一次。研究來(lái)自三次培養(yǎng)(繼代)的細(xì)胞。在第三次培養(yǎng)后，洗滌細(xì)胞一次，以300g離心5分鐘，以100μl之山羊f(ab)2抗-huiggfc-fitc(250ng/ml)于冰上染色30分鐘。洗滌細(xì)胞一次并于離心后丟棄液體。對(duì)每一孔洞加入200μl的結(jié)合溶液，并將其移至微量稀釋管供流式細(xì)胞檢測(cè)分析。基于每一樣品5,000個(gè)細(xì)胞的進(jìn)樣，于facs上測(cè)定結(jié)合強(qiáng)度(平均熒光強(qiáng)度，mfi)。

3.1.3.db4的結(jié)合親和力試驗(yàn)

在離心管內(nèi)，加入濃度為3.1-2000ng/ml(0.5ml)之db4抗體至數(shù)量為4x10⁵個(gè)細(xì)胞的hpb-all細(xì)胞(0.5ml)中，并于和緩的搖動(dòng)下于冰上培養(yǎng)1小時(shí)。測(cè)定于飽和結(jié)合時(shí)之絕對(duì)結(jié)合親和力，在此以elisa定量溶液中的游離db4濃度([f])，且如以上平衡試驗(yàn)所述計(jì)算結(jié)合部分([b])。以基于等式[b]＝bmax·{[f]/([f]+kd)}的曲線(xiàn)擬合于sigmaplot上分析所得之飽和的游離-vs-結(jié)合濃度曲線(xiàn)，在此個(gè)別的[b]和[f]代表結(jié)合和游離的濃度。

3.1.4.db4和b4與b4-生物素的競(jìng)爭(zhēng)

于涂覆scd4(0.5μg/ml)和p2704a肽(2.0μg/ml)混合液之平底微量盤(pán)上，于b4-生物素(10μg/ml)存在下加入0.1ml之db4或b4溶液(濃度為0.78-100μg/ml)，并于室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。以下對(duì)捕獲混合物之競(jìng)爭(zhēng)型結(jié)合，是以extravidin-hrp偵測(cè)結(jié)合的b4-生物素并以elisa分析儀測(cè)定。

3.1.5.db4和b4與db4-alexa的競(jìng)爭(zhēng)

于v型底微量盤(pán)上，添加每孔洞0.1ml內(nèi)含2x10⁵個(gè)細(xì)胞的溶液，離心，并丟棄液體。細(xì)胞于db4-alexa(250ng/ml)存在下與100μl之db4或b4溶液(濃度高達(dá)2000ng/ml)在冰上培養(yǎng)1小時(shí)。洗滌細(xì)胞一次并于離心后丟棄液體。對(duì)每一孔洞加入200μl的結(jié)合溶液，并將其移至微量稀釋管供流式細(xì)胞檢測(cè)分析?；诿恳粯悠?,000個(gè)細(xì)胞的進(jìn)樣，于facs上測(cè)定結(jié)合強(qiáng)度(平均熒光強(qiáng)度，mfi)。

3.1.6.db4c7和gp120mn與db4c7-alexa的競(jìng)爭(zhēng)

于v型底微量盤(pán)上，添加每孔洞0.1ml內(nèi)含2x10⁵個(gè)細(xì)胞的溶液，離心，并丟棄液體。細(xì)胞于db4-alexa(250ng/ml)存在下與100μl之db4c7或gp120mn溶液(濃度高達(dá)200nm，～30μg/ml)在冰上培養(yǎng)1小時(shí)。洗滌細(xì)胞一次并于離心后丟棄液體。對(duì)每一孔洞加入200μl的結(jié)合溶液，并將其移至微量稀釋管供流式細(xì)胞檢測(cè)分析。基于每一樣品5,000個(gè)細(xì)胞的進(jìn)樣，于facs上測(cè)定結(jié)合強(qiáng)度(平均熒光強(qiáng)度，mfi)。

3.2.db4對(duì)血液cd4+t淋巴細(xì)胞的結(jié)合

3.2.1.db4的溫度依賴(lài)性結(jié)合試驗(yàn)

為了模擬生理環(huán)境，在此于靜脈注射后db4(ub-421)結(jié)合(覆蓋或占據(jù))位于cd4⁺t細(xì)胞上之cd4受體，將由實(shí)驗(yàn)室人員新鮮采取的edta-血液溶液與等量之db4于稀釋緩沖液中在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)(db4濃度高達(dá)100μg/ml)。為了作比較，其它樣品組同時(shí)于冰上進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)1小時(shí)后，樣品以20倍體積之紅血球裂解緩沖液于室溫下裂解10分鐘以產(chǎn)生外周血白細(xì)胞(pbl)部分。

離心pbl部份，洗滌，并接著以等量之含有1.0％bsa和疊氮化鈉的pbs緩沖液再制(例如，0.1ml血液和0.1ml稀釋緩沖液)。以0.1ml之山羊f(ab)2抗-higgfc-fitc、抗-cd3-pe和抗-cd45percp混合液于冰上染色pbl樣品30分鐘。洗滌之后，以2％甲醛固定樣品，并基于10,000個(gè)細(xì)胞的進(jìn)樣對(duì)樣品進(jìn)行facs分析。利用抗-cd3-pe選取t淋巴細(xì)胞群。

3.2.2.直接結(jié)合

于三個(gè)男性和女性受試者中分析db4對(duì)血液cd4+t細(xì)胞的直接結(jié)合，在此將新鮮抽取之edta-血液與db4于37℃下培養(yǎng)1小時(shí)。mabdb4結(jié)合至cd4+t細(xì)胞，且發(fā)現(xiàn)達(dá)到濃度范圍為0.2-200ng/ml之表觀飽和度(apparentsaturation)。利用抗-cd3-pe選取t淋巴細(xì)胞群。此實(shí)驗(yàn)步驟與上述之溫度依賴(lài)性結(jié)合試驗(yàn)的步驟相同，在此利用山羊f(ab)2抗-higgfcγ-fitc染細(xì)胞以追蹤db4之結(jié)合。

3.2.3.未被占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)

類(lèi)似于上述之直接結(jié)合試驗(yàn)，在對(duì)三個(gè)男性和三個(gè)女性之每一個(gè)體于相同場(chǎng)合下研究db4結(jié)合后所留下未被占據(jù)之結(jié)合位點(diǎn)的程度(在完全受體占據(jù)之前)。此實(shí)驗(yàn)步驟與上述之直接結(jié)合試驗(yàn)的步驟相同，除了其使用固定量之db4-alexa(濃度250ng/ml)以顯現(xiàn)未被占據(jù)的、空閑結(jié)合位點(diǎn)的程度。

3.2.4.校正微珠

為了同時(shí)調(diào)查直接結(jié)合和未被占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)，利用兩種molecularprobes的linearflow^tmkits(貨號(hào)l14821和l14823)之組合在六個(gè)不同場(chǎng)合中的每一個(gè)產(chǎn)生log(mfi)-vs-log(bead％)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。此試劑盒組合于流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)中提供高和低強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)之寬廣的校正范圍。作為參考標(biāo)準(zhǔn)，利用這些熒光珠定量位于藉由山羊f(ab)2抗-higgfcr-fitc或db4-alexa標(biāo)幟之細(xì)胞上的相對(duì)熒光。

4.結(jié)果和討論

4.1.db4的結(jié)合曲線(xiàn)和其于cd4-陽(yáng)性hpb-all細(xì)胞之絕對(duì)結(jié)合親和力(kd)的測(cè)定

4.1.1.對(duì)hpb-all細(xì)胞之結(jié)合活性的平衡

在完全描述配體-受體結(jié)合反應(yīng)特征之前，定義對(duì)不同濃度配體達(dá)到平衡的時(shí)間長(zhǎng)度，即高原狀態(tài)，在此結(jié)合速率等于解離速率。通常已知的狀況為較低的濃度需要越長(zhǎng)時(shí)間達(dá)到平衡。

在于冰上培養(yǎng)cd4-陽(yáng)性hpb-all細(xì)胞之db4-cd4相互作用的例子中，對(duì)2.0ng/ml濃度要花約60分鐘，且對(duì)50ng/ml濃度要花約15分鐘，以達(dá)到％結(jié)合數(shù)值中的高原。對(duì)db4濃度為100ng/ml(0.1μg/ml)和更高的水平可觀察到幾乎瞬間達(dá)到高原狀態(tài)。

這些結(jié)果指出對(duì)寬的濃度范圍(例如，濃度≥2.0ng/ml)而言，db4結(jié)合反應(yīng)可于1小時(shí)達(dá)成。結(jié)合試驗(yàn)可在冷的及/或在0.05％疊氮化合物存在下進(jìn)行，以避免配體-受體復(fù)合體之可能的內(nèi)噬作用。于室溫或于37℃下培養(yǎng)可較快達(dá)到反應(yīng)的高原狀態(tài)。在上述進(jìn)展的狀況下，hpb-all細(xì)胞，以三個(gè)不同細(xì)胞繼代，于冰上與db4培養(yǎng)1小時(shí)。收集上清液以供游離藥物濃度的elisa測(cè)定，且藉由從總數(shù)扣除提供結(jié)合的部分。利用如圖8所示之結(jié)合曲線(xiàn)計(jì)算絕對(duì)結(jié)合親和力和結(jié)合容量。

4.1.2.對(duì)hpb-all細(xì)胞的直接結(jié)合

在三個(gè)不同場(chǎng)合(細(xì)胞繼代)，2x10⁵個(gè)hpb-all細(xì)胞于冰上與db4(高達(dá)～2000ng/ml)培養(yǎng)1小時(shí)，抗體展現(xiàn)4-參數(shù)羅吉函數(shù)(logitfunction)的飽和結(jié)合曲線(xiàn)，在此結(jié)合的程度是利用山羊f(ab)2抗-huiggfc-fitc測(cè)得并以平均熒光強(qiáng)度(mfi)表示。于濃度為200ng/ml(0.2μg/ml)和以上者之結(jié)合接近飽和。平均結(jié)合ecs0測(cè)得為42.2ng/ml(表8)，具有小的繼代代數(shù)間的差異(between-passagevariation)(n＝3)。也標(biāo)準(zhǔn)化絕對(duì)mfi數(shù)值為％mfi以供繼代代數(shù)間的比較。因此使標(biāo)準(zhǔn)差減到最小，且ec50數(shù)值基本上保持不變；對(duì)兩個(gè)平均曲線(xiàn)之總平均結(jié)合ec50數(shù)值測(cè)得為42.9ng/ml(表8)。

4.1.3.于hpb-all細(xì)胞之結(jié)合親和力(kd)和結(jié)合容量(bmax)

收集培養(yǎng)之后的上清液(冰上培養(yǎng)1小時(shí))供利用elisa測(cè)定游離(未結(jié)合)db4濃度[f]，且因此透過(guò)由加入(總)濃度扣除測(cè)得結(jié)合濃度[b]。利用如表9所示之游離藥物-vs-結(jié)合藥物數(shù)據(jù)圖表評(píng)估對(duì)db4的絕對(duì)結(jié)合親和力。平均解離常數(shù)(kd)測(cè)得為5.6x10^-11m(范圍：3.1至8.1x10^-11m)，且最大結(jié)合容量(bmax)測(cè)得為每細(xì)胞1.2x10⁶ab(范圍：0.93至1.4x10⁶)。這些結(jié)果指出db4以特別高的親合力結(jié)合至位于hpb-all細(xì)胞上的cd4受體，且hpb-all細(xì)胞具有高密度，最高每個(gè)細(xì)胞對(duì)db4具有超過(guò)一百萬(wàn)個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(表9)。位于hpb-all細(xì)胞上之cd4受體密度較位于血液cd4+t淋巴細(xì)胞者高至少20倍，其為每細(xì)胞約3.2-6.1x10⁴個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

4.2.db4和b4于結(jié)合至hpb-all細(xì)胞的比較

面臨的難題在于利用使鼠源b4抗體成為db4之去免疫化方法以人源化是否改變了結(jié)合親和力，故于使用競(jìng)爭(zhēng)設(shè)計(jì)的兩個(gè)技術(shù)報(bào)告上徹底研究此難題。

首先，于以可溶性cd4(scd4)和p2704a肽之捕獲混合物涂覆的elisa微量盤(pán)上調(diào)查mabb4和mabdb4的結(jié)合親和力。p2704a肽模擬cd4-ccr5受體復(fù)合體，因?yàn)槠浒辉赾cr5上的抗原表位序列，而hiv-1系住ccr5以進(jìn)入cd4細(xì)胞。當(dāng)以elisa分析時(shí)可見(jiàn)，于各種濃度之mabb4或mabdb4存在下，b4-生物素對(duì)涂覆之scd4/p2704a混合物的結(jié)合受到抑制。當(dāng)mabb4或mabdb4抗體共存且與b4-生物素競(jìng)爭(zhēng)對(duì)捕獲蛋白質(zhì)混合物之結(jié)合時(shí)，b4-生物素之結(jié)合受到抑制，b4和db4之ic50數(shù)值分別為5539ng/ml和8191ng/ml(圖9)。b4對(duì)db4之ic50比率為0.68，顯示人源化db4具有相當(dāng)于鼠源b4抗體的結(jié)合親和力。

再者，也利用cd4-陽(yáng)性hpb-all細(xì)胞研究相對(duì)結(jié)合親和力，在此b4或db4抗體共存且與db4-alexa競(jìng)爭(zhēng)對(duì)細(xì)胞cd4受體之結(jié)合。利用facs分析，db4-alexa結(jié)合受到抑制，b4和db4之ic50數(shù)值分別為135和197ng/ml(圖10)。b4對(duì)db4之ic50比率為0.69，如利用elisa范例所證明為實(shí)質(zhì)上相同，再次顯示人源化db4利用相當(dāng)于鼠源b4抗體的親和力結(jié)合cd4受體。

比較性的競(jìng)爭(zhēng)型結(jié)合抑制試驗(yàn)，利用親本抗體b4和其人源化抗體db4c7(ub-421)，提供對(duì)cd4陽(yáng)性t細(xì)胞(hpb-all)的抗體結(jié)合曲線(xiàn)，其如同以平均熒光強(qiáng)度(mfi)對(duì)一系列抗體濃度(由100至104ng/ml)所測(cè)得。此試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證表5和表6所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)，此兩個(gè)抗體的個(gè)別中和活性于mt2和pbmc試驗(yàn)系統(tǒng)中具有相當(dāng)?shù)闹泻涂贵w活性。

當(dāng)與其親本鼠源抗體b4比較時(shí)，這些比較性試驗(yàn)所提供之結(jié)果指出利用去免疫化技術(shù)以人源化并未顯著地減少db4c7(ub-421)對(duì)cd4受體的結(jié)合親和力。

4.3.mabdb4對(duì)cd4的結(jié)合特征

評(píng)估m(xù)abdb4對(duì)cd4的結(jié)合特征。

4.3.1.mabdb4對(duì)可溶性cd4和對(duì)細(xì)胞結(jié)合之cd4的結(jié)合

如以上討論，如利用elisa所評(píng)估，db4抑制b4-生物素對(duì)scd4/p2704a之結(jié)合，其ic50為8191ng/ml(圖9)，且如利用facs測(cè)試，db4抑制db4-alexa對(duì)hpb-all細(xì)胞之結(jié)合，其ic50為197ng/ml(圖10)。這些數(shù)據(jù)有趣地證明，相較于可溶性cd4(scd4)，db4對(duì)cd4-陽(yáng)性t細(xì)胞具有更高的結(jié)合親和力。具體來(lái)說(shuō)，這兩項(xiàng)試驗(yàn)之ic50數(shù)值的比較顯示db4對(duì)cd4陽(yáng)性t細(xì)胞的結(jié)合親和力較可溶性cd4高超過(guò)40倍。

4.3.2.db4和gp120mn于hpb-all細(xì)胞結(jié)合之比較

執(zhí)行競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)以比較db4和hivgp120mn對(duì)結(jié)合于cd4-陽(yáng)性t細(xì)胞之cd4的結(jié)合親和力。具體來(lái)說(shuō)，比較db4和gp120mn抑制db4-alexa結(jié)合至位于hpb-all細(xì)胞上之cd4的能力(圖11)。在第一個(gè)試驗(yàn)中，db4抑制db4-alexa結(jié)合至位于hpb-all細(xì)胞上之cd4，其ic50為1.8nm。在比較試驗(yàn)中，gp120mn抑制db4-alexa結(jié)合至位于hpb-all細(xì)胞上之cd4，其ic50為97.2nm。依照此結(jié)果，發(fā)現(xiàn)db4較gp120mn對(duì)位于hpb-allt細(xì)胞上之cd4具有實(shí)質(zhì)上更高的結(jié)合親和力。具體來(lái)說(shuō)，這兩項(xiàng)試驗(yàn)之ic50數(shù)值的比較顯示db4對(duì)cd4的結(jié)合親和力較gp120mn高至少50倍。

4.3.3.db4和gp120mn對(duì)cd4之結(jié)合親和力的比較

如以上討論，mabdb4結(jié)合至cd4具有約5.6x10^-11m的結(jié)合親和力(表9)。他人先前已發(fā)現(xiàn)，透過(guò)結(jié)晶學(xué)研究，hiv-1gpl20結(jié)合于cd4分子結(jié)構(gòu)域1附近，具有約5x10^-9m的高結(jié)合親和力(kd)(myszka，d.g.，etal.，“energeticsofthehivgp120-cd4bindingreaction”procnatlacadsciusa.aug1，2000；97(16)：9026-9031)。因此，比較db4和gp120之kd數(shù)值顯示，db4對(duì)cd4之結(jié)合親和力較gp120的結(jié)合親和力高約100倍。此結(jié)果與上述發(fā)現(xiàn)(基于ic50數(shù)值的比較，db4結(jié)合hpb-all細(xì)胞較gp120mn強(qiáng)至少50倍)一致。

體外結(jié)果整體顯示，上述討論證明藉由避免或關(guān)閉hiv病毒進(jìn)入，使db4足以阻斷或減少hiv-1感染。

4.4.db4(ub-421)對(duì)血液cd4+t細(xì)胞的溫度依賴(lài)性結(jié)合

研究于正常體溫(37℃)下db4對(duì)人類(lèi)血液中之cd4+t細(xì)胞的結(jié)合，以測(cè)定是否可有效地投予db4作為治療藥物給人類(lèi)受試者。為了模擬人體的生理環(huán)境，db4c7(ub-421)與新鮮抽取的血液于37℃下培養(yǎng)1小時(shí)，且利用紅血球裂解步驟提供外周血白細(xì)胞(pbl)樣品。同時(shí)執(zhí)行于冰上(4℃)的培養(yǎng)。之后以山羊f(ab)2抗-huigg-fitc染色pbl部分，以顯現(xiàn)db4對(duì)位于cd4-選取t細(xì)胞上之cd4受體的直接結(jié)合。

與于4℃下培養(yǎng)比較(數(shù)據(jù)未示)，指出以db4于37℃下細(xì)胞培養(yǎng)1小時(shí)并不會(huì)造成配體-受體的內(nèi)噬作用，如同觀察到于鼠抗-cd4(d2)-fitc之mfi無(wú)變化。鼠抗-cd4(d2)-fitc(供cd4+t細(xì)胞選取，濃度為50-1000ng/ml)和db4(目標(biāo)為cd4受體之d1結(jié)構(gòu)域，濃度高達(dá)200ng/ml)并不會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。

如同來(lái)自一女性個(gè)體之血液樣品所示(圖12)，于兩種不同溫度(37℃或4℃)下將外周血單核細(xì)胞(pbmc)與db4培養(yǎng)1小時(shí)。染色選取的cd4+t細(xì)胞供于facs上觀察db4結(jié)合。圖12顯示db4于37℃下較于4℃下以5倍高之親合力結(jié)合至cd4受體，此乃基于分別為4.8ng/ml和23.0ng/ml的ic50數(shù)值。如同預(yù)期，db4于兩種溫度狀況下均可達(dá)到相同之最大結(jié)合mfi。mfi數(shù)值反映受體占據(jù)的程度，特別是當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化這些數(shù)值并以％mfi表示時(shí)。

4.4.1.db4對(duì)血液cd4+t細(xì)胞的直接結(jié)合

研究于正常體溫(37℃)下db4對(duì)人類(lèi)血液中之cd4+t細(xì)胞的結(jié)合曲線(xiàn)。利用從六個(gè)成人(三個(gè)男性和三個(gè)女性)新鮮抽取的血液于六個(gè)不同場(chǎng)合下評(píng)估db4對(duì)血液cd4+細(xì)胞的直接結(jié)合活性(表10)。在1小時(shí)培養(yǎng)后，分離外周血白細(xì)胞，以山羊f(ab)2抗-huiggfc-fitc染色，并以facs分析db4-結(jié)合之cd4-選取的t細(xì)胞。以參考珠校正樣品以供熒光讀取。發(fā)現(xiàn)結(jié)合(ec50)數(shù)值介于2.6ng/ml至5.7ng/ml，其平均ec50為4.1ng/ml。同樣地，最大％mfi數(shù)值介于68％至93％，其平均值為77.8％(表10)。這些結(jié)果分別地反映于結(jié)合親和力和受體密度上具微小意義的受試者間差異。

4.4.2.在以mabdb4占據(jù)受體后之未被占據(jù)的cd4結(jié)合位點(diǎn)

連同于4℃下db4對(duì)血液cd4+細(xì)胞的直接結(jié)合(如同以山羊抗-higg偵測(cè))，利用db4-alexa評(píng)估位于cd4+細(xì)胞上之未被占據(jù)，空閑的cd4結(jié)合位點(diǎn)。

在沒(méi)有db4的狀況下，單獨(dú)db4-alexa綴合物于濃度為約250ng/ml時(shí)可接近其最大結(jié)合的～100％(圖13)。濃度高于500ng/ml時(shí)，db4-alexa綴合物可逐出約10％或更多的結(jié)合的db4(數(shù)據(jù)未示)。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)以250ng/ml之接近飽和程度的db4占據(jù)受體時(shí)，db4-alexa(于250ng/ml)對(duì)cd4受體之結(jié)合被完全地阻斷。

與db4-alexa結(jié)合上升的同時(shí)可觀察到受體占據(jù)隨著db4存在之下降而下降。受體占據(jù)程度與未被占據(jù)之結(jié)合位點(diǎn)的程度以對(duì)稱(chēng)方式同步化，且二曲線(xiàn)于濃度約4.0ng/ml處交錯(cuò)(圖13)，此與其結(jié)合ec50數(shù)值一致(表10)。

因此整體結(jié)果指出于體外使用250ng/ml的db4-alexa和mfi以及％mfi可作為適當(dāng)之范例，用以研究對(duì)人類(lèi)受試者投予db4c7(ub-421)后之體內(nèi)的受體占據(jù)。

5.結(jié)論

(1)mabdb4與位于hpb-all細(xì)胞上之cd4受體相互作用，其具有獨(dú)特地高活性，在濃度高于50ng/ml時(shí)于冰上達(dá)到立即的平衡。絕對(duì)結(jié)合親和力(kd)測(cè)定為5.6x10^-11m，且最高時(shí)1.2x10⁶個(gè)db4分子(bmax)可結(jié)合至單一個(gè)hpb-all細(xì)胞，其較于正常血液cd4+t細(xì)胞者具有至少高于20倍的受體密度。

(2)人源化鼠源b4成為db4mab并未顯著地改變對(duì)cd4受體之db4結(jié)合親和力。藉由結(jié)合抑制的設(shè)計(jì)，利用基于分子的elisa(涂覆scd4和含有ccr5抗原表位之肽p2704a)和與hpb-all細(xì)胞之基于細(xì)胞的facs，兩種抗體同等地阻斷示跡劑(示跡劑為b4-生物素或db4-alexa)的結(jié)合，于此二實(shí)驗(yàn)中觀察到b4-vs-db4之ic50比率約為0.7。

(3)db4抗體以高于hiv-1包膜蛋白gp120mn至少50倍之親和力結(jié)合cd4受體。具體來(lái)說(shuō)，利用hpb-all細(xì)胞之結(jié)合抑制試驗(yàn)證明db4和gp120mn分別以1.8和97.2nm之ic50數(shù)值抑制示跡劑db4-alexa之結(jié)合。此結(jié)果也與db4的高結(jié)合親和力(kd)(其于先前報(bào)導(dǎo)較重組gp120高約100倍)一致。

(4)mabdb4以與對(duì)hpb-all細(xì)胞相似之結(jié)合親和力結(jié)合血液cd4+t細(xì)胞。在低溫環(huán)境(4℃)下，db4之ec50為約23.0ng/ml。且在正常體溫(37℃)下，db4以約5倍高之親和力結(jié)合血液cd4+t細(xì)胞，結(jié)合ecs0為4.8ng/ml。

(5)由來(lái)自六個(gè)人類(lèi)受試者之血液樣品的試驗(yàn)證明db4濃度和cd4受體占據(jù)間具有直接(成反比的)相關(guān)性。如圖13所示之相反的曲線(xiàn)，交叉于約4.0ng/ml，其與對(duì)cd4之db4的平均ec50結(jié)合數(shù)值一致。這些整體結(jié)果指出于體外使用db4-alexa(濃度250ng/ml)和以熒光珠校正之％mfi之測(cè)定可作為適當(dāng)之范例，用以研究對(duì)人類(lèi)受試者投予db4c7(ub-421)后之體內(nèi)的受體占據(jù)。

實(shí)施例8.抗體b4有效地抑制hiv之無(wú)細(xì)胞和細(xì)胞間傳播

hiv顆粒典型地藉由無(wú)細(xì)胞傳播散布全身，在此病毒擴(kuò)散于血流和局部環(huán)境中以感染細(xì)胞。病毒也藉由需要親密細(xì)胞間接觸的機(jī)制以具有直接地由受感染細(xì)胞轉(zhuǎn)移至未受感染細(xì)胞的能力。此種傳播發(fā)生于當(dāng)受感染的細(xì)胞與未受感染的細(xì)胞形成穩(wěn)定的接觸點(diǎn)時(shí)，并直接地將hiv顆粒傳播給未受感染的細(xì)胞。相較于無(wú)細(xì)胞傳播，細(xì)胞間傳播具有較高效率，速度較快，且不需要擴(kuò)散至血流。

sigal，a.，等人于2011年報(bào)導(dǎo)，于抗病毒藥物tenofovir存在下，起源于無(wú)細(xì)胞病毒的感染激烈地下降，于共培養(yǎng)試驗(yàn)中涉及細(xì)胞間傳播之感染卻顯著地對(duì)藥物較不具敏感性(圖14)。敏感性的降低在藥物的存在下足以阻止多輪感染的終止。作者使用隨機(jī)感染模型在臨床藥物濃度的存在下研究來(lái)自細(xì)胞間傳播的復(fù)制，并發(fā)現(xiàn)復(fù)制是間歇性的，無(wú)突變的實(shí)質(zhì)積累。如果細(xì)胞間傳播在體內(nèi)具有相同的特性，它可能具有對(duì)免疫系統(tǒng)的不良后果，具有危險(xiǎn)因子以導(dǎo)致個(gè)體的治療失敗，并可能有助于病毒的持久性，因此，其為治療hiv感染的障礙。

因此，為了評(píng)估其于治療上的潛在影響，重要的是評(píng)估用以抑制hiv細(xì)胞間傳播之mabb4和mabdb4相關(guān)抗體的能力及效力。

1.用以測(cè)定hiv細(xì)胞間傳播之抗體介導(dǎo)抑制的試驗(yàn)

1.1.材料和方法

1.1.1.細(xì)胞和病毒

選擇jurkat-ingluc克隆(來(lái)自美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所aids研究和參考試劑計(jì)劃)，其具有利用基因工程置入于hiv-1基因體中的報(bào)導(dǎo)基因(luciferase)，選擇其作為供體細(xì)胞(原因在于在利用目標(biāo)原代cd4+t細(xì)胞之共培養(yǎng)試驗(yàn)中，表面cd4之低度表達(dá)可使供體-vs-供體感染減到最少)。報(bào)導(dǎo)基因luciferase可以在受感染的細(xì)胞中表達(dá)并作為病毒感染之標(biāo)志?？蓽y(cè)定于受感染細(xì)胞中的這些病毒表達(dá)報(bào)導(dǎo)者以定量hiv-1感染。以原代cd4⁺t細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞。于此試驗(yàn)中使用進(jìn)化支d的病毒ug266和ug046。

1.1.2.病毒細(xì)胞間傳播試驗(yàn)

在本試驗(yàn)，在與指明的hiv-1病毒株混合之前，將供體與連續(xù)稀釋之抗體b4預(yù)培養(yǎng)，并于幾天后使用(當(dāng)～10-75％的細(xì)胞為gag⁺時(shí))。之后以于200μl中為1.5×10⁶細(xì)胞/ml之最終濃度在96孔盤(pán)上以1∶2比率混合供體和cd4陽(yáng)性pbmc目標(biāo)細(xì)胞。于48小時(shí)后，針對(duì)細(xì)胞內(nèi)gag進(jìn)行細(xì)胞染色并以流式細(xì)胞儀分析。利用bioluxgaussialuciferaseassay套組(newenglandbiolabs)和bertholdtechnologies冷光測(cè)定儀偵測(cè)累積于培養(yǎng)上清液中的gluc。

1.1.3.ic50和ic90的校正

透過(guò)擬合數(shù)據(jù)至s形的劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)(多變的斜率)繪制劑量-反應(yīng)抑制曲線(xiàn)。抑制的百分比定義為(未處理之目標(biāo)細(xì)胞的信號(hào)百分比-抗體處理之細(xì)胞的信號(hào)百分比)/(未處理之目標(biāo)細(xì)胞的信號(hào)百分比)×100。依此計(jì)算ic50和ic90。

2.結(jié)果和討論

表11顯示，當(dāng)透過(guò)嚴(yán)格的90％進(jìn)入抑制標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定時(shí)，抗體b4可等效地抑制hiv(進(jìn)化支c的病毒株ug266和ug046)之細(xì)胞間和無(wú)細(xì)胞傳播。具體來(lái)說(shuō)，分別地發(fā)現(xiàn)對(duì)ug266和ug046病毒株于細(xì)胞間傳播試驗(yàn)中的融合抑制效價(jià)為1∶140和1∶245，其相當(dāng)于在無(wú)細(xì)胞傳播中和試驗(yàn)中為1∶136和1∶234之中和效價(jià)。當(dāng)以50％進(jìn)入抑制標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定時(shí)，相較于相對(duì)應(yīng)之無(wú)細(xì)胞傳播，在對(duì)細(xì)胞間傳播觀察到對(duì)此兩種病毒株較高的融合抑制效價(jià)。

這些結(jié)果證明，當(dāng)與迄今所測(cè)定之所有其它針對(duì)hivenv蛋白質(zhì)的中和單克隆抗體或其它art-藥物相比較時(shí)，抗體b4于其在抑制hiv之細(xì)胞間和無(wú)細(xì)胞傳播的能力方面均具有獨(dú)特的特性。這些結(jié)果顯示，只有mabb4和mabdb4相關(guān)抗體具有資格可在個(gè)體中預(yù)防hiv病毒的無(wú)細(xì)胞和細(xì)胞間傳播。

實(shí)施例9.抗體ub-421(db4c7或db4)介導(dǎo)在hiv感染個(gè)體中用于增強(qiáng)病毒復(fù)制之靜默pbmcs的再活化

1.背景

hiv-1感染靜默的外周血單核細(xì)胞(pbmcs)卻保持不活化直到后續(xù)的細(xì)胞活化。利用體外模型(此體外模型是利用細(xì)胞培養(yǎng)條件和允許靜默t細(xì)胞非增值性感染之方法，模擬藏匿于靜默pbmcs中的靜默hiv-1)，以研究熱滅活的hiv-1(ihiv-1)或gp120-抗-gp120免疫復(fù)合物對(duì)這些靜默pbmcs的刺激效應(yīng)(briant，l.，etal.，1996)。

此證明偕同熱滅活hiv-1(ihiv-1)或gpl20-抗-gpl20免疫復(fù)合物之包膜糖蛋白的cd4接合(cd4engagement)足以透過(guò)交聯(lián)以刺激控制nf-κb(即核轉(zhuǎn)位)和ap-1活化的信號(hào)傳遞路徑，其依次涉及cd4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域1(d1)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域與幾種激酶(lck、raf-1、mek和erk)，以誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)程、促進(jìn)活化標(biāo)志cd25的細(xì)胞表面表達(dá)，以及刺激原病毒整合和使細(xì)胞產(chǎn)生病毒。

由than等人(than，etal.，1997)之獨(dú)立的科學(xué)發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)，利用抗-cd4單克隆抗體于gp120結(jié)合位點(diǎn)之cd4分子的交聯(lián)可誘導(dǎo)來(lái)自hiv感染患者之潛伏受感染的pbmcs以促進(jìn)病毒復(fù)制。此試驗(yàn)中使用的抗-cd4mab為leu3a，其可結(jié)合cd4之d1的cdr2-環(huán)。具體來(lái)說(shuō)，leu3是針對(duì)線(xiàn)性抗原表位，而此線(xiàn)性抗原表位代表具有cd4結(jié)構(gòu)域1內(nèi)之第47-64個(gè)氨基酸的肽(chiba，y.1992)。

此外，發(fā)現(xiàn)藉由針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1(d1)之cdr2-環(huán)的單克隆抗體可特異性地誘導(dǎo)于靜默pbmcs之病毒的再活化，且此并非藉由針對(duì)其它抗原表位(例如位于d1之cdr3或接近d1/d2接合點(diǎn)區(qū)域(briant，l.，eta1.，1999))的抗體(參見(jiàn)圖15，比較第4長(zhǎng)條與第5和6長(zhǎng)條)?？衫每扇苄詂d4(scd4)事先吸附cdr2-環(huán)配體以預(yù)防此種病毒再活化(參見(jiàn)圖15，比較第4長(zhǎng)條和第8長(zhǎng)條)。

因此，重要的是要評(píng)估抗體db4c7(ub-421)(其對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1附近區(qū)域具有高結(jié)合親合力)是否可介導(dǎo)在hiv感染個(gè)體中用于增強(qiáng)病毒復(fù)制之靜默pbmcs的再活化。

2.位于cd4之d1附近之b4/db4構(gòu)型結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)精算

2.1.藉由mabb4對(duì)黑猩猩cd4陽(yáng)性pbmcs之leu3a結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)型順序結(jié)合抑制

于此試驗(yàn)中使用分離自?xún)擅茉囌?x282和x301)的黑猩猩pbmc細(xì)胞、mabb4(利用fitc標(biāo)幟)和leu3a(以pe標(biāo)幟)。以個(gè)別的抗體順序地染色pbmcs并進(jìn)行細(xì)胞熒光顯影(cytofluorography)的分析。由此實(shí)驗(yàn)所提供之?dāng)?shù)據(jù)如表12所描述，并于下文中討論。

于單一標(biāo)幟的對(duì)照組樣品，只利用以leu3a染色的細(xì)胞測(cè)試呈現(xiàn)leu3a-pe結(jié)合陽(yáng)性者；只利用以mabb4染色的細(xì)胞測(cè)試呈現(xiàn)b4-fitc結(jié)合陽(yáng)性者。具體來(lái)說(shuō)，于未受感染之黑猩猩樣品(x282和x301)的cd4+細(xì)胞(如利用leu3a所偵測(cè))分別為25.5％和44.0％，其與那些以mabb4偵測(cè)者(26.1％和45.5％)相似。

事先結(jié)合leu3a之后暴露于mabb4導(dǎo)致雙重染色的(leu3a+/b4+)pbmc細(xì)胞數(shù)量與單獨(dú)只利用leu3a或b4染色之單一標(biāo)幟的對(duì)照組細(xì)胞相似(即對(duì)x282和x301分別為24.5％和46.7％)。

相反地，事先結(jié)合mabb4之后暴露于leu3a導(dǎo)致在單一或雙重染色過(guò)程中只有無(wú)leu3a陽(yáng)性染色之mabb4染色的pbmcs。

整體來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果證明藉由針對(duì)leu3a-pe之抗體b4-fitc的單向抑制。也就是說(shuō)，藉由事先leu3a結(jié)合未能阻斷b4結(jié)合；然而，事先b4結(jié)合可阻斷l(xiāng)eu3a結(jié)合。結(jié)論為mabb4辨識(shí)涵蓋cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域的構(gòu)型抗原表位(抗體leu3a可辨識(shí)此區(qū)域)，且mabb4以相較于抗體leu3a之較高的親和力結(jié)合cd4的此區(qū)域。而這些數(shù)據(jù)支持此結(jié)論。

2.2.利用針對(duì)hivrc肽(第39-66個(gè)氨基酸)之免疫血清對(duì)b4結(jié)合至rscd4進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)型抑制(elisa方法)

透過(guò)利用針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1cdr2區(qū)域之免疫血清的競(jìng)爭(zhēng)型抑制試驗(yàn)，評(píng)估m(xù)abb4對(duì)完整重組可溶性cd4(rscd4)的結(jié)合親合力。

2.2.1.抗-hivrc多克隆抗體

利用包含cd4第39-66個(gè)氨基酸的環(huán)狀肽免疫天竺鼠以制備針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域的多克隆抗體。此環(huán)狀肽于本試驗(yàn)中稱(chēng)為hiv受體復(fù)合體肽(hivrc肽)，且如同先前于wang等人在2002年所描述之肽p2240c。

具體來(lái)說(shuō)，第0周是配制于完全弗氏佐劑者，且第3和6周是配制于不完全弗氏佐劑者，接著在此之后以配制于不完全弗氏佐劑者每月加強(qiáng)，以每劑量0.5ml中內(nèi)含100μg者肌肉注射免疫接種4-6周齡的duncanhartley天竺鼠后，于特定時(shí)間點(diǎn)收集針對(duì)hivrc肽之天竺鼠血清。

提供的多克隆抗體稱(chēng)為“抗-hivrc多克隆抗體”。

2.2.2.藉由抗-hivrc多克隆抗體對(duì)b4結(jié)合rscd4進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)型抑制

利用每孔洞以體積0.1ml濃度0.08μg/ml之完整rscd4涂覆的96孔微量盤(pán)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)型抑制實(shí)驗(yàn)。在利用生物素化b4-抗體結(jié)合前，將天竺鼠血清(在利用針對(duì)hivrc肽(cd4的第39-66個(gè)氨基酸)之免疫原免疫接種后第0、3、6、9、12、14、16和19周收集天竺鼠血清)以1∶30的比例稀釋與孔洞培養(yǎng)，之后利用與抗生物素蛋白(avidin)-hrp之結(jié)合作為示跡劑。也對(duì)從整個(gè)試驗(yàn)同期所收集來(lái)自未免疫接種之天竺鼠的陰性對(duì)照血清(rc同型)進(jìn)行測(cè)試。

圖16顯示藉由于初次免疫后第6周所提供之抗-hivrc多克隆抗體可顯著地抑制生物素化-b4結(jié)合至rscd4，藉由于初次免疫后第9周所提供之抗-hivrc多克隆抗體可達(dá)到近乎完全的抑制。

此競(jìng)爭(zhēng)型結(jié)合抑制試驗(yàn)進(jìn)一步證明mabb4的結(jié)合位點(diǎn)是位于cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2環(huán)附近，雖然藉由mabb4直接結(jié)合至此肽并非顯著地是因?yàn)閙abb4對(duì)膜結(jié)合cd4之構(gòu)型結(jié)構(gòu)的偏好性結(jié)合。

2.3.于mabdb4交聯(lián)時(shí)在hiv感染個(gè)體中用于增強(qiáng)病毒制造之靜默cd4陽(yáng)性t細(xì)胞的再活化

藉由利用mabdb4處理細(xì)胞與觀測(cè)tnf-α產(chǎn)量、病毒量和細(xì)胞增生，以評(píng)估m(xù)abdb4活化靜默cd4+細(xì)胞的能力。

在此試驗(yàn)中，藉由將培養(yǎng)盤(pán)與200μl山羊抗-人igg(jacksonimmunoresearch)在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)，以將人類(lèi)igg涂覆于8孔培養(yǎng)盤(pán)。將涂覆的培養(yǎng)盤(pán)保存于4℃冰箱中直到本試驗(yàn)進(jìn)一步使用。

依照標(biāo)準(zhǔn)作法將來(lái)自hiv患者之pbmc解凍1.5小時(shí)。如下所述，利用mabdb4(實(shí)驗(yàn)組)、pma+pha(陽(yáng)性對(duì)照組)或只有培養(yǎng)液(陰性對(duì)照組)處理pbmc，以評(píng)估靜默cd4+細(xì)胞的活化。

2.3.1.mabdb4處理

以mabdb4(濃度為3μg/10⁶細(xì)胞/ml)于4℃下處理細(xì)胞1小時(shí)以引發(fā)細(xì)胞上cd4的交聯(lián)。細(xì)胞以mabdb4處理，之后洗滌，并以rpmi培養(yǎng)液和10％胎牛血清于涂覆的48孔培養(yǎng)盤(pán)上培養(yǎng)7天。以未涂覆之孔洞作為陰性對(duì)照組。于第0天、第2天和第7天冷凍培養(yǎng)上清液供之后的評(píng)估。于4℃處理30分鐘后由細(xì)胞移除上清液，以提供作為mabdb4樣品之時(shí)間點(diǎn)第0天。

2.3.2.pma+pha處理

以0.1μm植物凝集素(phytohaemagglutinin，pha)加上15μg/ml豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(phorbolmyristateacetate，pma)(sigma)(pma+pha)于涂覆的48孔培養(yǎng)盤(pán)上和rpmi培養(yǎng)液與10％胎牛血清處理細(xì)胞7天，作為再活化之靜默cd4+細(xì)胞的陽(yáng)性對(duì)照組。利用未涂覆之孔洞作為陰性對(duì)照組。于第0天、第2天和第7天冷凍培養(yǎng)上清液供之后的評(píng)估。于4℃處理30分鐘后由細(xì)胞移除上清液，以提供作為pma+pha樣品之時(shí)間點(diǎn)第0天。

2.3.3.只有培養(yǎng)液

如同陰性對(duì)照組，于涂覆的48孔培養(yǎng)盤(pán)上以rpmi培養(yǎng)液和10％胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞7天(只有培養(yǎng)液)。利用未涂覆之孔洞作為額外的陰性對(duì)照組。于第0天、第2天和第7天冷凍培養(yǎng)上清液供之后的評(píng)估。于4℃下在培養(yǎng)液中培養(yǎng)30分鐘后由細(xì)胞移除上清液，以提供作為只有培養(yǎng)液樣品之時(shí)間點(diǎn)第0天。

2.3.4.cd4+再活化的分析

藉由評(píng)估tnf-α產(chǎn)量、病毒量和細(xì)胞增生以測(cè)定cd4+細(xì)胞的再活化。于表13概述來(lái)自本試驗(yàn)之結(jié)果。

使用標(biāo)準(zhǔn)方法分析來(lái)自所有樣品之溶液，項(xiàng)目包含：(1)利用定量的elisa分析tnf-α濃度；(2)利用rtpcr分析hiv病毒量；(3)細(xì)胞數(shù)量；以及(4)利用錐蟲(chóng)藍(lán)(trypanblue)分析存活率。

具體來(lái)說(shuō)，數(shù)據(jù)顯示，相較于只有培養(yǎng)液的陰性對(duì)照組(低于檢測(cè)極限)和以pma+pha刺激的細(xì)胞(較mabdb4覆蓋之細(xì)胞高約3至5倍)，mabdb4交聯(lián)所覆蓋之來(lái)自hiv患者的pbmc細(xì)胞可引起tnf-α的中度生成。

同樣地，mabdb4樣品以與只有培養(yǎng)液之陰性對(duì)照組相似的速率增生；然而，pma+pha刺激的細(xì)胞具有相較于以mabdb4交聯(lián)之細(xì)胞更大程度的增生(在第7天時(shí)，于pma+pha培養(yǎng)組別之細(xì)胞數(shù)量為mabdb4培養(yǎng)組的5倍高)。

然而，相較于培養(yǎng)液對(duì)照組和pma+pha刺激的細(xì)胞，于以mabdb4交聯(lián)之細(xì)胞的hiv病毒量顯著地增加。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)于第2和7天與只有培養(yǎng)液之陰性對(duì)照組相比較時(shí)，以mabdb4交聯(lián)之細(xì)胞于病毒量分別地具有151％和220％的增加；然而，pma+pha培養(yǎng)具有次佳的病毒量產(chǎn)生(于第2和7天分別為55％和78％)，盡管其細(xì)胞增生有5倍量的增加。

3.結(jié)論

(1)發(fā)現(xiàn)鼠源mabb4可辨識(shí)位于cd4上的構(gòu)型位置，且此構(gòu)型位置接近抗體leu3a所辨識(shí)的位置(位于cdr2區(qū)域第47-64個(gè)氨基酸)?；谠趯?shí)施例7所描述之比較性試驗(yàn)，預(yù)期mabdb4具有如同在此所述之對(duì)于mabb4而言相同的辨識(shí)特性。

(2)利用多克隆抗體(此多克隆抗體是針對(duì)含有cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域第39-66個(gè)氨基酸的環(huán)狀肽(hivrc肽))可抑制鼠源mabb4對(duì)完整rscd4之結(jié)合。這些結(jié)果顯示mabb4辨識(shí)cd4第39-66個(gè)氨基酸，其對(duì)應(yīng)至cd4之d1的cdr2環(huán)。基于在實(shí)施例7所描述之比較性試驗(yàn)，預(yù)期mabdb4具有如同在此所述之對(duì)于mabb4而言相同的辨識(shí)特性。

(3)發(fā)現(xiàn)cd4與mabdb4交聯(lián)于hiv感染的pbmccd4+t細(xì)胞可活化病毒制造。具體來(lái)說(shuō)，mabdb4誘導(dǎo)tnf-α產(chǎn)生，并增強(qiáng)hiv制造，而未誘導(dǎo)細(xì)胞增生(如表13所示)。

(4)基于此實(shí)施例所提供之結(jié)果，mabdb4(包含ub-421)能介導(dǎo)在hiv感染個(gè)體中用于增強(qiáng)病毒制造之靜默pbmcs的再活化。

實(shí)施例10.mabdb4c7和抗-hivrc多克隆抗體抑制抗原所引發(fā)的t細(xì)胞增生和cd4陽(yáng)性t細(xì)胞的細(xì)胞激素(il2和ifn-γ)制造，因此破壞細(xì)胞焦亡的hiv致病循環(huán)

1.背景

最近的報(bào)告顯示，當(dāng)hiv病毒感染允許(permissive)、活化的cd4+t細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞死亡透過(guò)caspase-3依賴(lài)性的細(xì)胞凋亡默默地發(fā)生(doitsh，g，etal.，2014)。相反地，當(dāng)r5或x4-向性hiv失敗地感染來(lái)自淋巴組織之非允許(non-permissive)、靜默的cd4+t細(xì)胞時(shí)，這些細(xì)胞透過(guò)caspase-1依賴(lài)性的細(xì)胞焦亡而死亡，其為程序性細(xì)胞死亡之強(qiáng)烈的炎癥形式。被視為宿主dna感測(cè)器的干擾素誘導(dǎo)因子16(ifi16)可識(shí)別不完整的hiv反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，進(jìn)而引發(fā)caspase-1的活化(monroe，k.m.，etal.，2013)。在大多數(shù)的人類(lèi)淋巴組織(包含扁桃體、淋巴結(jié)和脾臟)中，活化和允許的細(xì)胞次群體代表了cd4t細(xì)胞總數(shù)中的5％或更少數(shù)量，而非允許靜默細(xì)胞則代表了遭遇hiv之目標(biāo)中的95％或更多數(shù)量。因此，caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡似乎主要地負(fù)責(zé)在這些淋巴組織感染hiv后驅(qū)使cd4t細(xì)胞死亡，而非caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。分析來(lái)自以r5-向性hiv感染之受試者的新鮮淋巴結(jié)進(jìn)一步支持這些發(fā)現(xiàn)，其中在富含靜默cd4t細(xì)胞的皮質(zhì)區(qū)可偵測(cè)到caspase-1和il-1β，而發(fā)現(xiàn)在解剖學(xué)上不同的生發(fā)中心(在此發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)性感染細(xì)胞)可偵測(cè)到caspase-3活性。

細(xì)胞焦亡極可能透過(guò)前發(fā)炎性細(xì)胞激素的釋放和內(nèi)生性危險(xiǎn)信號(hào)，藉由移除細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的小生境(niches)和增強(qiáng)宿主的防御反應(yīng)，促進(jìn)各種細(xì)菌性感染的快速清除。然而，在致病的慢性炎癥，例如hiv感染，細(xì)胞焦亡不是保護(hù)性反應(yīng)且并不會(huì)導(dǎo)致原發(fā)性感染的清除。事實(shí)上，細(xì)胞焦亡似乎制造了惡性的致病循環(huán)，在此瀕死cd4t細(xì)胞釋放炎癥信號(hào)以吸引更多細(xì)胞進(jìn)入受感染的淋巴組織，進(jìn)而死亡并產(chǎn)生更多的炎癥。這些事件建立了炎癥的慢性狀態(tài)，其刺激病程和組織損傷。慢性炎癥也可能促進(jìn)潛伏hiv病毒庫(kù)的維持，而潛伏hiv病毒庫(kù)可刺激記憶cd4t細(xì)胞的恒定性增生。

cd4t細(xì)胞的耗竭和慢性炎癥的發(fā)展是推動(dòng)疾病進(jìn)展之hiv致病機(jī)制中的特征過(guò)程，且細(xì)胞焦亡提供了這兩種疾病-促進(jìn)過(guò)程之間意外的連結(jié)。

以上資料顯示，透過(guò)抑制由cd4+細(xì)胞之抗原刺激所引發(fā)的cd4+細(xì)胞增生及/或發(fā)炎性細(xì)胞激素制造的機(jī)制可能可以減輕或減少發(fā)生于hiv感染期間在淋巴組織的細(xì)胞焦亡。

2.實(shí)驗(yàn)

進(jìn)行研究以確定是否mabdb4可藉由于hiv感染個(gè)體抑制慢性炎癥發(fā)展以破壞由細(xì)胞焦亡所引起的致病循環(huán)。抑制由抗原刺激所引發(fā)之細(xì)胞激素制造有助于緩解許多靜默t細(xì)胞(靜默t細(xì)胞已經(jīng)有失敗的hiv感染)之細(xì)胞焦亡的負(fù)擔(dān)，從而破壞起因于細(xì)胞激素所造成cd4陽(yáng)性t細(xì)胞耗竭的hiv病理。

利用金黃色葡萄球菌b型腸毒素(seb)之體外模型評(píng)估m(xù)abdb4c7(ub-421)在正常和hiv感染個(gè)體中抑制pbmct細(xì)胞增生的能力。seb是一種超抗原，其具有刺激帶有特定t細(xì)胞抗原受體(tcr)之所有t細(xì)胞的能力，并可誘導(dǎo)大量的細(xì)胞激素制造。

透過(guò)與huyencao和mohamedelrefaei博士的合作，進(jìn)行了正常人類(lèi)供體(n＝3)和hiv感染供體(n＝6，未使用art治療的患者，cd4+數(shù)量＞200，病毒量＞10,000)的功能分析，以評(píng)估m(xù)abdb4c7(ub-421)或針對(duì)cd4之d1的cdr2區(qū)域的抗-hivrc多克隆抗體(實(shí)施例9)是否可以抑制細(xì)胞增生和細(xì)胞激素(il2和ifn-γ)的產(chǎn)生。

2.1.研究對(duì)象和樣品

從reachcohort(舊金山)招募hiv-陽(yáng)性未使用art治療的志愿者(n＝6)。也將三個(gè)年齡一致的hiv-血清反應(yīng)陰性對(duì)照組的志愿者納入此試驗(yàn)中。將pbmc分離并冷凍保存在液態(tài)氮中直到試驗(yàn)的時(shí)間。

2.2.使用mabdb4c7或純化的抗-hivrc多克隆抗體的飽和濃度

首先在間接免疫熒光試驗(yàn)中分別以mabdb4c7igg或抗-hivrc多克隆抗體igg染色cd4+t淋巴細(xì)胞，之后再用alexa-山羊抗-huigg或alexa-山羊抗-天竺鼠igg進(jìn)行染色。為了偵測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞百分比，透過(guò)流式細(xì)胞儀分析所得之染色的細(xì)胞。mabdb4c7和抗-hivrc多克隆抗體于2倍稀釋所測(cè)得之效價(jià)介于50μg/ml和0.0025μg/ml。mabdb4和抗-hivrc抗體的抗體效價(jià)測(cè)定為％cd4結(jié)合對(duì)抗體濃度(μg/ml)。在于hiv感染和正常個(gè)體進(jìn)行t細(xì)胞功能測(cè)試使用之前評(píng)估這些抗體效價(jià)。

圖17顯示于功能試驗(yàn)中所使用各試劑的飽和濃度，mabdb4(db4c7)為1μg/ml和抗-hivrc多克隆抗體為25μg/ml。

2.3.cd4+或cd8+t細(xì)胞的增生

利用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxy-fluoresceinsuccinimidylester，cfse)熒光試驗(yàn)分析細(xì)胞增生，其在細(xì)胞分裂時(shí)產(chǎn)生羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxy-fluoresceindiacetate，succinimidylester，cfda-se)染色的減少。利用cfse作為³h-胸腺嘧啶(增生)測(cè)試的代用品。

以mabdb4c7或純化的抗-hivrc多克隆抗體之飽和濃度與pbmcs培養(yǎng)，以覆蓋位于細(xì)胞表面上的cd4受體。細(xì)胞也分別與抗-hivrc同型(濃度為25μg/ml)和pha(10μg/ml；sigma-aldrich)培養(yǎng)作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照組。

于pbs中以cfda-se(molecularprobes，eugene，or)標(biāo)幟pbmcs，之后以100％fcs(sigma-aldrich，st.louis，mo)進(jìn)行熒光淬熄。在以pbs洗滌后，將細(xì)胞再懸浮于具有10％fcs的rpmi1640(sigma-aldrich)中。

之后在seb抗原(1μg/ml)存在下，將細(xì)胞于37℃含5％co2之條件下培養(yǎng)5天，并分析表面標(biāo)志的表達(dá)。

利用流式細(xì)胞儀圈選cd3+(amcyan)細(xì)胞群中cd4+(pe，d2)及cd8+(percpcy5.5)細(xì)胞群進(jìn)行分析，并針對(duì)％cfse陽(yáng)性細(xì)胞(作為％增生細(xì)胞)進(jìn)一步測(cè)定此細(xì)胞群。利用lsrii(bdbiosciences，mountainview，ca)獲得每個(gè)樣品四萬(wàn)(40,000)個(gè)淋巴細(xì)胞，并利用flowjo軟體(treestar，sancarlos，ca)分析。結(jié)果測(cè)定為分裂的cd4(或cd8)t細(xì)胞的百分比。所有試驗(yàn)參與者證明于pha刺激后之顯著的細(xì)胞增生。cd4t細(xì)胞在無(wú)seb抗原刺激下之細(xì)胞增生為＜0.5％(陰性對(duì)照組)。

2.4.用以測(cè)定細(xì)胞激素(il2和ifn-γ制造)的細(xì)胞內(nèi)染色試驗(yàn)

pbmc(0.5x10⁶個(gè)細(xì)胞)與seb抗原(1μg/ml)于37℃含5％co2之條件下培養(yǎng)2小時(shí)。以含有0.1％fcs之pbs(洗滌緩沖液)洗滌細(xì)胞，將細(xì)胞再懸浮于裂解緩沖液(bdbiosciences)中于室溫下反應(yīng)10分鐘進(jìn)行固定。細(xì)胞以洗滌緩沖液洗滌一次，之后將細(xì)胞再懸浮于0.5ml的膜通透劑2(bdbiosciences)中并于室溫下培養(yǎng)10分鐘進(jìn)行透化處理。接著以洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞，并以抗-il-2apc、抗-ifn-γ(pecy7)以及抗-cd3(amcyan)、抗-cd4(pe，d2)或抗-cd8(percpcy5.5)(bdpharmingen)染色。利用lsrii(bdbiosciences)獲得每個(gè)樣品四萬(wàn)(40,000)個(gè)淋巴細(xì)胞，并利用flowjo軟體(treestar)分析。在無(wú)抗原刺激下之細(xì)胞激素-制造cd4或cd8t細(xì)胞的百分比為<0.05％(陰性對(duì)照組)。結(jié)果表示為表達(dá)ifn-γ或il2之cd4+(或cd8+)t細(xì)胞的百分比。

2.5.統(tǒng)計(jì)分析

利用配對(duì)t檢定進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和比較。

3.結(jié)果

此seb抗原引發(fā)之t細(xì)胞增生試驗(yàn)所提供的結(jié)果顯示，在未使用hivart治療的患者和年齡一致的正常個(gè)體中，mabdb4c7(1μg/ml)和抗-hivrc多克隆抗體(25μg/ml)在飽和狀態(tài)下均可減少cd4+t細(xì)胞增生，而非cd8+t細(xì)胞增生(數(shù)據(jù)未示)。

mabdb4(1μg/ml)和純化的抗-hivrc多克隆抗體(25μg/ml)于其個(gè)別的飽和pbmc表面cd4結(jié)合濃度下，于hiv陰性(圖18a)和hiv陽(yáng)性(圖18b)個(gè)體均可抑制由超抗原seb所引發(fā)增生cd4+t細(xì)胞的il2生成。于來(lái)自相同hiv陽(yáng)性和陰性個(gè)體的cd8+t細(xì)胞中則未發(fā)現(xiàn)此種抑制(圖18c)。

mabdb4(1μg/ml)和純化的抗-hivrc抗體(25μg/ml)在其個(gè)別的飽和濃度下，于hiv陰性(圖18d)和hiv陽(yáng)性(圖18e)個(gè)體也均可抑制由超抗原seb所引發(fā)增生cd4+t細(xì)胞的ifn-gamma生成。于來(lái)自相同hiv陰性(圖18f)和陽(yáng)性(圖18g)個(gè)體的cd8+t細(xì)胞中則未發(fā)現(xiàn)此種抑制。

4.結(jié)論

抗體mabdb4c7(ub-421)和抗-hivrc多克隆抗體，二者針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域，發(fā)現(xiàn)可抑制超抗原seb所引發(fā)藉由cd4陽(yáng)性t細(xì)胞的t細(xì)胞增生和細(xì)胞激素(il2和ifn-γ)生成，而非藉由cd8陽(yáng)性t細(xì)胞的t細(xì)胞增生和細(xì)胞激素(il2和ifn-γ)生成。發(fā)現(xiàn)db4c7和抗-hivrc多克隆抗體可抑制cd4+t細(xì)胞增生和相關(guān)細(xì)胞激素(il2和ifn-γ)生成，顯示此抗體可能對(duì)其它c(diǎn)d4陽(yáng)性細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞激素生成展現(xiàn)相似的抑制效果，具有破壞細(xì)胞焦亡之hiv致病循環(huán)的潛力。

在此與先前實(shí)施例所觀察到，其對(duì)cd4陽(yáng)性t細(xì)胞增生和相關(guān)細(xì)胞激素(il2和ifn-γ)生成的抑制效果為高度顯著，其中在此所述之針對(duì)cdr2區(qū)域的抗體對(duì)cd4細(xì)胞可能展現(xiàn)同時(shí)發(fā)生的相反效果，包括：(1)靜默hiv感染之cd4陽(yáng)性t細(xì)胞的再活化，以引發(fā)由其潛伏狀態(tài)釋出hiv(實(shí)施例9)；(2)藉由靜默cd4+t細(xì)胞的再活化，競(jìng)爭(zhēng)型抑制和預(yù)防hiv從新釋出的病毒進(jìn)入未受感染的cd4陽(yáng)性t細(xì)胞(實(shí)施例4和6)；以及(3)當(dāng)(超)抗原刺激時(shí)藉由cd4陽(yáng)性t細(xì)胞抑制t細(xì)胞增生和細(xì)胞激素生成(此實(shí)施例)。

針對(duì)hiv結(jié)合之特定位置(即cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域)的mabdb4和抗-hivrc多克隆抗體的獨(dú)特生物特征和免疫反應(yīng)的引發(fā)可提供功能性治愈hiv感染所需的特性，即能夠(1)透過(guò)進(jìn)入抑制阻止hiv感染；(2)于靜默t細(xì)胞再活化病毒制造；以及(3)直接地改變細(xì)胞激素生成。

實(shí)施例11.于以進(jìn)化支b之hiv原代分離株hiv.-1dh12攻毒的黑猩猩利用mabb4對(duì)hiv感染的暴露前和暴露后預(yù)防和治療

已證明針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域的b4相關(guān)高親和力抗體具有許多獨(dú)特的體外特性，重要的是要在最像人類(lèi)的動(dòng)物模型中測(cè)試b4抗體于預(yù)防及/或治療hiv感染的療效。已使用黑猩猩作為人類(lèi)病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)感染的模型超過(guò)100年了。于黑猩猩所精心制定的攻毒模型中，使用進(jìn)化支b之hiv原代分離株hiv-1dh12展開(kāi)攻毒試驗(yàn)，以評(píng)估m(xù)abb4于暴露前和暴露后模式中對(duì)hiv-1感染提供被動(dòng)性免疫的潛力。具體來(lái)說(shuō)，評(píng)估m(xù)abb4所能提供的能力，包含(1)針對(duì)感染用以保護(hù)受暴露之受試者的消除性免疫，和(2)于證實(shí)感染后幾天投予抗體時(shí)對(duì)受暴露的受試者進(jìn)行治療。

1.于黑猩猩利用mabb4對(duì)hiv感染的暴露前和暴露后預(yù)防

評(píng)估m(xù)abb4于攻毒前和攻毒后(暴露于hiv-1)模式對(duì)hiv-1感染提供被動(dòng)性免疫的潛力。

1.1.方法

1.1.1試驗(yàn)使用之動(dòng)物

本試驗(yàn)總共使用4只黑猩猩。使用一只黑猩猩作為暴露前治療動(dòng)物(x084)，使用兩只黑猩猩作為暴露后治療動(dòng)物(x356和x357)，以及使用一只黑猩猩作為對(duì)照組(x259)。

1.1.2動(dòng)物對(duì)以hiv-1dh12病毒原液感染的敏感性

在治療和感染前利用其pbmc之體外感染測(cè)定動(dòng)物對(duì)以hiv-1dh12病毒原液感染的敏感性。在暴露于病毒3天內(nèi)可感染所有培養(yǎng)物。

1.1.3mabb4抗體

制備供輸注使用之mabb4作為高度純化的抗體制劑(濃度為5mg/ml)。

1.1.4攻毒前預(yù)防/治療

于hiv-1dh12攻毒前1小時(shí)利用5mg/kg的mabb4對(duì)黑猩猩x084進(jìn)行靜脈輸注。

1.1.5攻毒后預(yù)防/治療

于hiv-1dh12攻毒后1小時(shí)利用5mg/kg的mabb4對(duì)黑猩猩x356和x357進(jìn)行靜脈輸注。

1.1.6對(duì)照組動(dòng)物

以hiv-1dh12攻毒黑猩猩x259而未以mabb4抗體進(jìn)行輸注。

1.1.7以hiv-1dh12攻毒

以hiv-1dh12的100tcid50(其取自預(yù)先制備的病毒原液，并已于西南生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)在黑猩猩pbmc中測(cè)定效價(jià))靜脈攻毒四只黑猩猩。

1.1.8hiv-1dh12病毒的偵測(cè)

利用gag序列的dnapcr放大、共培養(yǎng)、p24捕獲elisa和免疫印跡法，藉由血漿病毒血癥、細(xì)胞相關(guān)病毒量和對(duì)hiv之免疫反應(yīng)的偵測(cè)，以監(jiān)測(cè)于黑猩猩的感染確立。利用來(lái)自所有黑猩猩于50周研究期期間內(nèi)所收集之所有血液樣品的hiv-1rna拷貝/ml，以測(cè)定hiv感染的血清病毒血癥指標(biāo)。利用病毒分離和dnapcr試驗(yàn)(dnapcr試驗(yàn)是用以偵測(cè)對(duì)應(yīng)gag的原病毒dna)于黑猩猩pbmc中偵測(cè)hiv-1dh12病毒。利用p24抗原捕獲elisa(coulter)評(píng)估病毒制造。制備黑猩猩pbmc和淋巴結(jié)細(xì)胞之1×10⁶至1×10²個(gè)細(xì)胞的連續(xù)稀釋?zhuān)趇l-2培養(yǎng)液中與來(lái)自3日齡之pha刺激的母細(xì)胞(數(shù)量為2×10⁶個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行共培養(yǎng)。選取導(dǎo)致p24制造之最高稀釋度的孔洞作為終點(diǎn)指標(biāo)。

1.1.9動(dòng)物飼養(yǎng)

經(jīng)機(jī)構(gòu)iacuc的批準(zhǔn)并依照國(guó)家研究委員會(huì)的指導(dǎo)方針，將黑猩猩飼養(yǎng)在西南生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)。

1.2.結(jié)果

利用mabb4對(duì)接受hiv-1dh12攻毒之黑猩猩提供消除性免疫。在hiv-1攻毒前以mabb4抗體輸注的動(dòng)物中(x084)(圖19a)，或在于hiv-1攻毒后1小時(shí)以mabb4抗體輸注的兩只動(dòng)物中(x356和x357)(圖19b)，在攻毒后后續(xù)的32周期間內(nèi)未偵測(cè)到感染的標(biāo)志。

相反地，在攻毒后第1周開(kāi)始由對(duì)照組動(dòng)物(x259)從pbmc(圖19c)和在攻毒后第2周時(shí)由血漿可輕易地分離出病毒。也可于第4和20周由x259活組織切片的淋巴結(jié)細(xì)胞分離出病毒。于包含細(xì)胞數(shù)量范圍介于1×10⁴至1×10⁶的稀釋物中，可偵測(cè)到于pbmc和淋巴結(jié)隔間之受感染的細(xì)胞。在第4周于動(dòng)物x259發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。

在利用抗體治療的黑猩猩x084、x356和x357發(fā)現(xiàn)在血液循環(huán)中所呈現(xiàn)的游離、未結(jié)合之mabb4迅速下降。來(lái)自接受治療之黑猩猩的cd4+和cd8+次群體在攻毒后20周期間的監(jiān)測(cè)下無(wú)cd4+耗竭的證據(jù)。到第32周期間，黑猩猩pbmc對(duì)有絲分裂促進(jìn)劑(pha、商陸果實(shí)分裂素(pokeweedmitogen)和刀豆素(concanavalina))的增生反應(yīng)無(wú)抑制作用。

此試驗(yàn)結(jié)果指出mabb4對(duì)hiv感染可以提供預(yù)防或消除性治愈，透過(guò)從攻毒日起甚至一年之血清病毒血癥和其它參數(shù)的廣泛隨訪(fǎng)可證明此試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.結(jié)論

在黑猩猩試驗(yàn)中，可藉由暴露之前或暴露之后于短暫時(shí)間間隔之內(nèi)的mabb4投予以中止藉由致病性原代分離株的hiv感染。過(guò)繼免疫(transferredimmunity)被消除，且無(wú)暫時(shí)、減少或延遲的病毒血癥證據(jù)。透過(guò)mabb4被捕捉在位于周邊血液和淋巴組織的cd4+細(xì)胞上，盡管mabb4抗體從血漿中快速清除，但完整的保護(hù)是明顯的。

精心執(zhí)行的試驗(yàn)進(jìn)一步指出，使用5mg/kg之mabb4或相關(guān)抗體的治療方案可供(i)遭受hiv患者于數(shù)小時(shí)內(nèi)，或(ii)由血清反應(yīng)陽(yáng)性母親所生下之?huà)雰河谏a(chǎn)時(shí)，以達(dá)到消除性治愈。

1.4.藉由mabb4對(duì)暴露后預(yù)防的應(yīng)用

美國(guó)公共衛(wèi)生服務(wù)指南對(duì)意外地暴露于hiv后之醫(yī)護(hù)人員推薦使用抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物的暴露后預(yù)防。然而，美國(guó)公共衛(wèi)生服務(wù)指南對(duì)暴露后預(yù)防目前可用藥物的毒性持保留態(tài)度。

在此試驗(yàn)所獲得的結(jié)果證明使用mabb4作為暴露后預(yù)防性治療以代替或合并使用現(xiàn)行暴露后治療方法的潛力。mabb4的低毒性和療效證明此抗體較抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物更為廣泛有效的潛力。

這些結(jié)果進(jìn)一步指出mabb4可用于從母親到孩子之hiv垂直傳播的預(yù)防。hiv的母嬰傳播(mother-to-childtransmission(mtct))也稱(chēng)為周產(chǎn)期或垂直傳播，發(fā)生于懷孕、分娩，及/或生產(chǎn)或母乳喂養(yǎng)期間，將hiv從hiv+的婦女傳播給其嬰兒。對(duì)未接受針對(duì)病毒之治療的hiv+婦女在懷孕、分娩和生產(chǎn)期間的mtct機(jī)率約為25％。在以母乳喂養(yǎng)其嬰兒之未經(jīng)治療的hiv+婦女，mtct有額外12％的機(jī)會(huì)。在全世界，在2001年，1.8萬(wàn)名婦女感染hiv，且大約80萬(wàn)名兒童也成為hiv感染者，其中多數(shù)是經(jīng)由mtct。在全世界被新診斷為hiv之大部分的人是介于15-24歲之間。mtct預(yù)防的一個(gè)非常重要的構(gòu)成要素是必須針對(duì)年輕人進(jìn)行hiv預(yù)防，尤其是女孩和年輕婦女在其變得性生活頻繁之前，并對(duì)那些已感染者進(jìn)行治療。關(guān)于mtct的額外訊息可以在http://caps.ucsf.edu/archives/factsheets/mother-to-child-transmission-mtct#sthash.dtryms46.dpuf找到。利用mabb4所得到的結(jié)果指出，可藉由對(duì)hiv+婦女之新生兒提供5mg/kg或更多之mabdb4的單次投予，以在分娩和生產(chǎn)階段期間預(yù)防m(xù)tct。

2.于黑猩猩利用mabb4治療hiv感染

2.1.方法

2.1.1試驗(yàn)中使用的動(dòng)物

黑猩猩x084、x356和x357在先前預(yù)防試驗(yàn)中使用且接受5mg/kg之mabb4的單次投予，以保護(hù)其免于hiv-1dh12的感染，其以治療模式于此攻毒試驗(yàn)中再次使用。

2.1.2動(dòng)物對(duì)以hiv-1dh12病毒原液感染的敏感性

在抗體治療和hiv攻毒之前，從動(dòng)物制備pbmcs以測(cè)定其對(duì)以hiv-1dh12感染的敏感性。利用病毒于預(yù)防接種的3天內(nèi)感染所有的體外培養(yǎng)物。

2.1.3mabb4抗體

制備供輸注使用之mabb4作為高度純化的抗體制劑(濃度為5mg/ml)。

2.1.4以hiv-1dh12攻毒

以hiv-1dh12的100tcid50(其取自預(yù)先制備的病毒原液，并已于西南生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)在黑猩猩pbmc中測(cè)定效價(jià))靜脈攻毒所有動(dòng)物(x084、x356和x357)。

2.1.5攻毒后治療

黑猩猩x084沒(méi)有任何攻毒后治療。在攻毒后第14天以5mg/kg的mabb4輸注黑猩猩x357，此時(shí)于供hiv感染治療之受攻毒的動(dòng)物中的hiv病毒血癥為最高。在攻毒后第14、18和22天以5mg/kg的mabb4輸注黑猩猩x356。

2.2.結(jié)果的概述

利用輸注5mg/kg鼠源mabb4進(jìn)行被動(dòng)性免疫治療試驗(yàn)，以于具有急性期hiv感染之黑猩猩測(cè)定mabb4的療效。以hiv-1dh12靜脈注射(i.v.)預(yù)防接種三只黑猩猩(x084、x356和x357)，并基于病毒檢測(cè)(未示出)和定量rt-pcr證實(shí)感染確立。

于所有黑猩猩(x084、x356和x357)在暴露后7天利用rt-pcr檢測(cè)來(lái)自hiv-1dh12的rna(基線(xiàn)以上)。利用病毒分離和利用hiv-1dh12整合偵測(cè)的dna-pcr，于14天內(nèi)在來(lái)自所有三只動(dòng)物之pbmcs和淋巴結(jié)細(xì)胞中檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)病毒。

在感染后第14天，利用mabb4(5mg/kg，靜脈注射)輸注受感染黑猩猩中的2只(x356和x357)。在感染后第18和22天，一只動(dòng)物(x356)接受額外兩劑的抗體(5mg/kg，靜脈注射)。對(duì)前12周以每周間隔和之后直到感染后40周每月地利用rt-pcr試驗(yàn)監(jiān)測(cè)病毒量。在感染后第14天時(shí)，以mabb4輸注黑猩猩x356和x357，病毒rna已經(jīng)處于一個(gè)快速上升的階段。相較于未接受治療的黑猩猩(x084)(圖20a，空心圓)，接受抗體的兩只黑猩猩之后在第20天時(shí)經(jīng)歷于其病毒量快速且顯著的下降(下降幅度為1-2個(gè)對(duì)數(shù))，以及于初期病毒血癥期持續(xù)時(shí)間的顯著降低(初期病毒血癥期持續(xù)時(shí)間由4周降至1周)(圖20a，實(shí)心圓)。

圖20a和圖20b比較于未接受治療的對(duì)照組黑猩猩x084(來(lái)自本試驗(yàn)，其先前接受mabb4的單次暴露前投藥)與未接受治療的對(duì)照組x259(來(lái)自先前試驗(yàn)，其未接受mabb4的投藥)和接受mabb4三次輸注之黑猩猩x356的血漿病毒血癥持續(xù)時(shí)間。于病毒攻毒后，如血清hiv-1rna拷貝所檢測(cè)，在無(wú)任何干預(yù)下利用hiv-1dh12攻毒黑猩猩x084(圖20a，空心圓)和x259(圖20b，空心圓)，并顯示早在第3天開(kāi)始病毒血癥。血清hiv-1病毒血癥的持續(xù)時(shí)間約42天，為hiv-1dh12感染的特征。黑猩猩x356(圖20a和20b，實(shí)心圓)接受mabb4的三次投予，且hiv-1病毒血癥急劇下降，之后在或約在第21天達(dá)到低于檢測(cè)極限。比較x356和x084與x259之間的病毒量數(shù)據(jù)顯示，從hiv-1dh12感染之特有的病毒血癥持續(xù)時(shí)間減少了21天。

如上所述，來(lái)自本試驗(yàn)之未接受治療的對(duì)照組黑猩猩x084于先前試驗(yàn)中接受了mabb4的單次暴露前投予；而來(lái)自先前試驗(yàn)之未接受治療的對(duì)照組黑猩猩x259則未接受任何mabb4投予。有趣的是，比較x084(圖20a，空心圓)與x259(圖20b，空心圓)所提供之?dāng)?shù)據(jù)顯示，相較于x259，在試驗(yàn)期間x084具有整體較低的病毒量。因此，雖然在此試驗(yàn)中未接受治療的動(dòng)物(x084)的病毒量顯著高于mabb4治療的動(dòng)物(x356)，于x084對(duì)mabb4之先前暴露似乎顯著地減少整體病毒量，特別是在hiv感染的急性期期間(比較x084與x259)。整體來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果指出于hiv暴露前之mabb4的任何投予可減少在感染急性期期間之病毒量程度，其可能進(jìn)一步降低感染后從個(gè)體至個(gè)體的病毒傳播。

另外，進(jìn)行細(xì)胞表面染色發(fā)現(xiàn)，在第14天時(shí)于投予mabb4單一劑量的動(dòng)物(x357)中，mabb4結(jié)合至cd4+細(xì)胞維持了至少七天。且于投予此抗體之多劑量的動(dòng)物(x356)中，mabb4結(jié)合至cd4+細(xì)胞持續(xù)了至少14天。相反地，只在輸注后三天之動(dòng)物中于血液循環(huán)內(nèi)偵測(cè)到游離mabb4，如利用針對(duì)hiv-1dh12分離株之中和活性所測(cè)得。如同在黑猩猩的預(yù)防試驗(yàn)中，這符合藉由結(jié)合至cd4+細(xì)胞而已經(jīng)將mabb4由血液循環(huán)中移除。

利用對(duì)于cd4/b4抗原表位的體外免疫染色，facs分析在40周期間可于所有樣品中偵測(cè)到cd4+細(xì)胞而無(wú)顯著的耗竭。在前21天的期間于pbmc之上完成輸注mabb4的免疫染色。pbmc樣品之有絲分裂促進(jìn)劑所誘導(dǎo)的增生反應(yīng)(利用刀豆素、pwm或pha)在抗體治療前和后是不同的，且似乎不受mabb4輸注所影響。這些觀察指出mabb4能夠破壞病毒感染，且減少病毒量及病毒血癥期，而無(wú)不適當(dāng)?shù)拿庖叨拘浴?/p>

實(shí)施例12.ub-421制劑，于狒狒之臨床前藥理學(xué)/毒性試驗(yàn)和在人體組織的交叉反應(yīng)性

簡(jiǎn)介

于前述實(shí)施例所討論之細(xì)胞培養(yǎng)和黑猩猩試驗(yàn)中所獲得的數(shù)據(jù)證實(shí)，有足夠的科學(xué)價(jià)值證明進(jìn)一步發(fā)展供人類(lèi)使用之含有mabdb4的藥物制劑是有理的。制備含mabdb4c7(ub-421)的藥物制劑，并為臨床使用而于大量生產(chǎn)上進(jìn)行一般的安全性測(cè)試。

另外，進(jìn)行一組臨床前安全性試驗(yàn)以提供針對(duì)候選藥物ub-421的藥效學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)、毒性和安全性資訊。

在狒狒(papiospecies)進(jìn)行單次與多次投予以及劑量依賴(lài)性(低和高劑量)試驗(yàn)，以協(xié)助第一期臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，用以評(píng)估在無(wú)癥狀hiv-1感染的人類(lèi)受試者中ub-421之劑量依賴(lài)性的安全性、耐受性和免疫毒性。于臨床前藥理/毒性試驗(yàn)使用狒狒作為動(dòng)物模型，原因?yàn)獒翎舻腸d4+t細(xì)胞具有與人類(lèi)相似的對(duì)mabdb4c7結(jié)合親合力，如圖21所示(即對(duì)人類(lèi)和狒狒分別為ec50＝0.33μg/ml和0.29μg/ml)。與krishnamurthy博士(西南生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)，病毒學(xué)暨免疫學(xué)部門(mén)，圣安東尼奧，德州)合作以開(kāi)始與執(zhí)行在狒狒的非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物藥理和毒性試驗(yàn)。

此外，執(zhí)行交叉反應(yīng)性試驗(yàn)，以評(píng)估ub-421是否具有任何非預(yù)期性的反應(yīng)性，和對(duì)有別于預(yù)定目標(biāo)之人類(lèi)組織之細(xì)胞毒性的可能位置。

如以下進(jìn)一步詳細(xì)討論者，從這些臨床前試驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)顯示具有足夠的科學(xué)價(jià)值證明進(jìn)一步發(fā)展ub-421作為在人體臨床試驗(yàn)之試驗(yàn)性新藥是有理的。

1.藥劑劑型

為了供人類(lèi)使用而制備含有mabdb4c7的藥劑劑型。一般來(lái)說(shuō)，包含mabdb4c7之藥劑劑型可配置于適當(dāng)?shù)木彌_液中包含，但不限于，檸檬酸鹽、磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷(tris)、1，3-二[三(羥甲基)甲基氨基]丙烷(bis-tris)等，于介于6.0至7.0之ph值，且可包含賦形劑(例如糖類(lèi)(50mm至500mm的蔗糖、海藻糖、甘露醇，或其混合))、表面活性劑(例如：0.025％-0.5％的tween20或tween80)，及/或其它試劑。

ub-421是指定為于磷酸鹽緩沖生理食鹽水(pbs)(ph6.5)中包含10mg/mlmabdb4c7、20mm甘氨酸，以及0.05％(v/v)tween(polysorbate20)的醫(yī)藥組合物。

mabdb4之高濃度劑型也可供包含皮下注射的應(yīng)用而加以制備，其包含10mm組氨酸。

制造之后，執(zhí)行一般的安全性和毒性試驗(yàn)以確保制造的藥物產(chǎn)品對(duì)投予人類(lèi)和動(dòng)物受試者是安全的。

2.一般的安全性試驗(yàn)

2.1.ub-421生產(chǎn)批次和安全標(biāo)準(zhǔn)

以?xún)蓚€(gè)大規(guī)模生產(chǎn)(p/nz807，批號(hào)225711和225758)制備ub-421藥物產(chǎn)品供臨床試驗(yàn)使用，并評(píng)估一般的安全性。

若在7天的測(cè)試期間符合下列條件(1)整個(gè)測(cè)試期間所有的動(dòng)物存活；(2)未觀察到毒性的明顯征象；以及(3)于投予醫(yī)藥組合物之時(shí)間直到試驗(yàn)期結(jié)束的期間內(nèi)沒(méi)有動(dòng)物具有明顯的體重減少，則將ub-421的大規(guī)模批次制造視作對(duì)臨床使用上為安全且可接受的。

2.2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小鼠：(白化，balb/cbyjnarl品系(家鼷鼠(musmusculus))，無(wú)特殊病原，雄性(國(guó)研院動(dòng)物中心(nlac)，臺(tái)灣)。(實(shí)驗(yàn)編號(hào)bio-003.90)。

天竺鼠：(白化，hartley品系(天竺鼠(caviaporcellus))，無(wú)特殊病原，雄性(臺(tái)大醫(yī)院(ntuh)，動(dòng)物中心，臺(tái)灣)。(實(shí)驗(yàn)編號(hào)bio-003.91)。

2.3.方法

透過(guò)腹腔投予方式對(duì)兩只小鼠和兩只天竺鼠注射各批次的ub-421。對(duì)照組的小鼠和天竺鼠則是透過(guò)腹腔投予方式注射等滲氯化鈉溶液(“s.t.”，批號(hào)1oc0206)。每只小鼠接受0.5毫升的總體積，而每只天竺鼠接受5.0毫升的總體積。在給藥前(第0天)和結(jié)束前(第7天)記錄動(dòng)物體重。針對(duì)一般健康情況和毒性的臨床征象每天觀察每只動(dòng)物。

2.4.分析和結(jié)論

來(lái)自一般的安全性試驗(yàn)結(jié)果針對(duì)分析標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生了以下令人滿(mǎn)意的結(jié)果：

(1)用于一般安全性試驗(yàn)的所有動(dòng)物在測(cè)試期間內(nèi)存活。

(2)在ub-421治療的動(dòng)物中未觀察到明顯征象的毒性。

(3)試驗(yàn)期間內(nèi)無(wú)動(dòng)物體重減少。

鑒于上述情況，將此些批次視為無(wú)未預(yù)期，不可接受的外來(lái)雜質(zhì)。

這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了ub-421的大規(guī)模制造批次(批號(hào)225711和225758)無(wú)未預(yù)期或不可接受的外來(lái)雜質(zhì)。據(jù)此，視這兩個(gè)批次于人類(lèi)臨床試驗(yàn)使用上為安全和可接受的。

3.試驗(yàn)a：于狒狒之ub-421的單次投予毒性試驗(yàn)

3.1.方法

試驗(yàn)a評(píng)估為期42天ub-421之低劑量(5mg/kg體重)或高劑量(25mg/kg體重)單次投予的藥效學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)和安全性，如表14a所示。在這項(xiàng)試驗(yàn)中，于30分鐘期間內(nèi)以5mg/kg或25mg/kg體重透過(guò)靜脈輸注投予ub-421。在0、0.5、1、2、4、8、12、24小時(shí)，以及在2、3、5、7、10、14、21、28、35、42天，收集用于藥物動(dòng)力學(xué)(pk)分析的血液樣品。

利用流式細(xì)胞儀分析法分析血液樣品，利用以下標(biāo)志監(jiān)測(cè)cd4+t淋巴細(xì)胞的存在，標(biāo)志包含：cd4結(jié)構(gòu)域1(抗-cd4+d1)和cd4結(jié)構(gòu)域2(抗-cd4+d2)。利用alexa-db4作為標(biāo)志和用于競(jìng)爭(zhēng)型cd4結(jié)合的示跡劑(競(jìng)爭(zhēng)型cd4結(jié)合是利用單克隆抗體ub421，且單克隆抗體ub421和alexa-db4均針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1和2)。利用alexa-山羊抗-huigg作為針對(duì)cd4結(jié)構(gòu)域1和2之單克隆抗體的示跡劑。此外，利用針對(duì)cd3和cd14的抗體監(jiān)測(cè)于pbmc制備中的總t細(xì)胞(cd3)和單核細(xì)胞(cd14)數(shù)量。

3.2.結(jié)果簡(jiǎn)述

未于藥效學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)和安全性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ub-421不應(yīng)該于人類(lèi)進(jìn)行第一期臨床試驗(yàn)之負(fù)面看法。對(duì)于評(píng)估的所有參數(shù)而言，在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均觀察到發(fā)現(xiàn)每一資料點(diǎn)顯著地高于或低于平均值(“超出正常范圍”)。

對(duì)來(lái)自以低劑量(5mg/kg)和高劑量(25mg/kg)ub-421單次投予治療之狒狒所提供的血液樣品評(píng)估ub-421之初始藥物動(dòng)力學(xué)(pk)性質(zhì)。

此試驗(yàn)結(jié)果顯示，以u(píng)b-421治療導(dǎo)致來(lái)自外周血單核細(xì)胞(pbmc)或由淋巴結(jié)活檢樣品細(xì)胞懸浮液所分離的cd3+cd4+t淋巴細(xì)胞和cd14+cd4+單核細(xì)胞之偵測(cè)顯著減少。因此懷疑這些細(xì)胞的減少是由于以u(píng)b-421“覆蓋”cd4+細(xì)胞，而不是因?yàn)閯?dòng)物體之cd4+細(xì)胞耗竭。發(fā)現(xiàn)當(dāng)利用針對(duì)抗-cd4+d2標(biāo)志的抗體時(shí)，所偵測(cè)之cd4+t淋巴細(xì)胞的百分比沒(méi)有變化，其證實(shí)了此項(xiàng)懷疑。此種在輸注后于cd4+細(xì)胞上以u(píng)b-421“覆蓋”的持續(xù)時(shí)間于接受低劑量之動(dòng)物中為至少3天，而于接受高劑量之動(dòng)物中則為至少7天。當(dāng)于動(dòng)物的血漿中不再偵測(cè)得到ub-421時(shí)，cd4+細(xì)胞上的“覆蓋”減少，且cd4+細(xì)胞(如利用抗-cd4+d1偵測(cè))回復(fù)到與利用抗-cd4+d2偵測(cè)者相同的百分比。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ub-421是安全的，且當(dāng)以低劑量ub-421投予時(shí)，ub-421可完全覆蓋cd4陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)至少3天，當(dāng)以高劑量ub-421投予時(shí)則達(dá)至少7天?；谙惹皩?shí)施例所討論的結(jié)果，當(dāng)完全覆蓋cd4+細(xì)胞時(shí)，預(yù)期可完全地排除hiv進(jìn)入細(xì)胞，此將產(chǎn)生病毒量減少的結(jié)果。

4.試驗(yàn)b：于狒狒之多次投予毒性試驗(yàn)

4.1.方法

試驗(yàn)b評(píng)估為期56天(8周)之ub-421的低劑量(5mg/kg體重)或高劑量(25mg/kg體重)重復(fù)投予的藥效學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)和毒性，如表14b所示。在此試驗(yàn)中，一個(gè)治療期包含以每周的間隔(每周投予一次)投予ub-421共8次。在8周治療期結(jié)束時(shí)，對(duì)半數(shù)之接受治療的動(dòng)物進(jìn)行尸體剖檢與評(píng)估(表14b，第1部分)。其余的動(dòng)物隨后經(jīng)過(guò)一個(gè)12周的恢復(fù)期，期間維持動(dòng)物供觀察和收集血液與淋巴結(jié)樣品(表14b，第2部分)之用。在治療期期間的0*、1、3、7*、14、21、28、35*、42、49、56*天，以及在恢復(fù)期期間的63*、70、77、91、105*、133天，由動(dòng)物收集血液樣品(和淋巴結(jié)活檢*)供分析之用。此試驗(yàn)系統(tǒng)使用成年雄性(m)和雌性(f)的狒狒(n＝20；年齡：7至18歲)。

4.2.結(jié)果簡(jiǎn)述

來(lái)自一組大規(guī)模臨床前試驗(yàn)所提供對(duì)ub-421之低劑量(5mg/kg)和高劑量(25mg/kg)多次投予的藥物動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)、毒性和安全性資訊。

整體來(lái)說(shuō)，由試驗(yàn)b第1部分和第2部分所提供之?dāng)?shù)據(jù)指出ub-421候選藥物具有供進(jìn)一步發(fā)展的科學(xué)價(jià)值以作為試驗(yàn)性新藥。未于藥效學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)和安全性研究中發(fā)現(xiàn)ub-421不應(yīng)該于人類(lèi)進(jìn)行第一期臨床試驗(yàn)之負(fù)面看法。對(duì)于評(píng)估的所有參數(shù)而言，在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均觀察發(fā)現(xiàn)到每一資料點(diǎn)顯著地高于或低于平均值(“超出正常范圍”)。

4.2.1血液和活檢分析

從利用低劑量和高劑量ub-421多次投予治療之動(dòng)物中所得到樣品進(jìn)行一組大規(guī)模的試驗(yàn)。這些試驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)在表15和17，并于以下內(nèi)容進(jìn)一步討論。

利用ubielisa試驗(yàn)(實(shí)施例7)和mt-2試驗(yàn)(實(shí)施例2)發(fā)現(xiàn)，于接受低劑量(5mg/kg)ub-421之動(dòng)物中可于其血漿偵測(cè)到ub-421達(dá)至少3天，而于接受高劑量(25mg/kg)ub-421之動(dòng)物中則達(dá)至少7天。在最后一次輸注后，于某些接受高劑量之動(dòng)物的血漿中檢測(cè)到過(guò)量ub-421達(dá)至少14天。

在接受ub-421的16個(gè)動(dòng)物中的任一個(gè)內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)針對(duì)ub-421的狒狒抗體，證實(shí)本候選藥物于接受治療之動(dòng)物中不具有免疫原性。

所有狒狒在第0和28天免疫接種b型肝炎病毒(hbv)疫苗(merck)。在4只對(duì)照組(1b)動(dòng)物中的4只、接受低劑量(2b)ub-421的8只狒狒中的6只，以及接受高劑量(3b)ub-421的8只狒狒中的3只，在第56天可觀察到可檢測(cè)水平的狒狒抗-hbsag抗體。這些結(jié)果指出cd4+細(xì)胞之ub-421“覆蓋”可能造成某些動(dòng)物對(duì)抗原預(yù)防接種的低反應(yīng)性。然而，發(fā)現(xiàn)此種低反應(yīng)性的效應(yīng)為可逆的，因?yàn)樵趗b-421治療中斷和以hbv疫苗額外免疫接種后，這些動(dòng)物都能夠發(fā)展出抗-hbsag抗體。

4.2.2觀察和尸體剖檢的結(jié)果

將本試驗(yàn)中接受治療之狒狒的肉眼和顯微鏡分析總結(jié)在表16和17。

在一般情況下，于此試驗(yàn)中評(píng)估取自所有狒狒的組織(第1和2部份)，未顯示可能歸因于以低或高劑量水平投予ub-421之任何獨(dú)特或一致的病理變化。

對(duì)所有第3b組(高劑量)動(dòng)物(n＝8)于輸注前之收案時(shí)進(jìn)行眼睛觀察，并于最后輸注后一周，于治療期結(jié)束時(shí)再次眼睛觀察。從這些動(dòng)物的眼科報(bào)告指出，對(duì)在治療期結(jié)束時(shí)執(zhí)行的所有測(cè)試而言，兩眼均保持在正常范圍內(nèi)。

取得來(lái)自所有動(dòng)物(n＝20)在完成投予每一劑量之前、期間和之后的心電圖觀察記錄。從所有試驗(yàn)動(dòng)物的心電圖報(bào)告推斷所發(fā)現(xiàn)的心電圖變化是在正常的逐日差異的范圍內(nèi)。

4.2.3ind-enabling毒理試驗(yàn)結(jié)果

除了對(duì)hbv疫苗接種的免疫反應(yīng)下降之外，ub-421處理組(2b和3b)和對(duì)照組(1b)之間于免疫毒性結(jié)果并無(wú)顯著差異。臨床檢查結(jié)果、眼科報(bào)告、心電圖記錄和組織病理學(xué)結(jié)果支持結(jié)論，結(jié)論為于成年狒狒在接受劑量水平高達(dá)25mg/kg之8周輸注后，ub-421是安全且耐受性良好的，治療法可有效地覆蓋目標(biāo)細(xì)胞而不造成細(xì)胞耗竭。

5.于人體組織的交叉反應(yīng)性

如先前實(shí)施例所討論的，mabdb4抗體，包含mabdb4c7(ub-421候選藥物的主要成分)，證明其對(duì)cd4具有高結(jié)合親合力，特別是位于t細(xì)胞上之膜結(jié)合cd4。以下的臨床前試驗(yàn)利用來(lái)自30個(gè)人體器官組織的一種陣列評(píng)估是否mabdb4c7可結(jié)合其它細(xì)胞種類(lèi)。本試驗(yàn)的目的是評(píng)估是否mabdb4c7具有任何意料之外的反應(yīng)性，以及其對(duì)有別于預(yù)期目標(biāo)人體組織之細(xì)胞毒性的可能位置。

5.1.方法

使用含有30個(gè)器官之共90個(gè)組織核心的fda標(biāo)準(zhǔn)的冷凍組織陣列進(jìn)行免疫組織化學(xué)試驗(yàn)，其每一組織取自3個(gè)正常人類(lèi)個(gè)體捐贈(zèng)者(美國(guó)biomax組織微陣列(tma)切片，洛克維爾，md)。個(gè)別人類(lèi)樣本之額外的冷凍切片也納入人體組織調(diào)查對(duì)象中，如表18所述。利用生物素化mabdb4c7和對(duì)照組試劑(生物素化山羊抗-兔igg)篩選人體組織調(diào)查對(duì)象供免疫反應(yīng)之用，用以評(píng)估特異性和非所欲之自體反應(yīng)性。

5.2.結(jié)果

藉由于phenopath實(shí)驗(yàn)室(西雅圖，華盛頓)經(jīng)認(rèn)證的臨床病理學(xué)家復(fù)審在成人正常組織切片所觀察到的染色模式，并針對(duì)反應(yīng)性進(jìn)行評(píng)分。在胸腺和位于扁桃體(和淋巴結(jié))之t細(xì)胞依賴(lài)區(qū)觀察到強(qiáng)陽(yáng)性的表面細(xì)胞膜染色，于脾臟則注意到弱陽(yáng)性反應(yīng)。偶發(fā)的單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞一致，以一個(gè)預(yù)期模式在多種組織中染色陽(yáng)性。也注意到于肝臟之局部微弱的庫(kù)氏細(xì)胞(kupffercell)染色。除了在某些組織中內(nèi)源性生物素的微弱染色，測(cè)試的所有其它人體組織均呈現(xiàn)陰性。扁桃體部分與未標(biāo)幟的mabdb4c7抗體預(yù)培養(yǎng)可阻斷特定染色模式。未觀察到預(yù)期外的交叉反應(yīng)性。

這些結(jié)果證實(shí)mabdb4c7(ub-421的主要成分)不具有可能會(huì)對(duì)有別于預(yù)定目標(biāo)之人類(lèi)組織導(dǎo)致細(xì)胞毒性的任何意料外的交叉反應(yīng)性。

實(shí)施例13.第i期，開(kāi)放性，單次投予，劑量依賴(lài)性試驗(yàn)，以評(píng)估ub-421于無(wú)癥狀hiv-1感染之成年人的安全性和藥物動(dòng)力學(xué)

1.目標(biāo)

主要目標(biāo)是要評(píng)估于無(wú)癥狀之人類(lèi)免疫缺陷病毒-1(hiv-1)感染的受試者以u(píng)b-421遞增劑量單次靜脈輸注的安全性和耐受性，次要目標(biāo)為確定于無(wú)癥狀之hiv-1感染的受試者以u(píng)b-421遞增劑量單次靜脈輸注的藥物動(dòng)力學(xué)。(臨床試驗(yàn)識(shí)別碼：nct01140126)。

2.方法

開(kāi)放性，單次投予，劑量依賴(lài)性(劑量遞增)，二中心，非比較性。

3.受試者人數(shù)

總共收案20個(gè)受試者(于每個(gè)劑量組有5位受試者)。

4.診斷和納入的主要標(biāo)準(zhǔn)

為了參與這項(xiàng)試驗(yàn)，受試者必須滿(mǎn)足以下所有標(biāo)準(zhǔn)。

(1)hiv-1血清反應(yīng)陽(yáng)性；

(2)年齡20歲(含)以上；

(3)對(duì)于方案版本mar-09-2010：無(wú)癥狀，如同試驗(yàn)主持人于篩選訪(fǎng)視(visit1，v1)根據(jù)疾病史、生理學(xué)檢查、心電圖(ecg)，以及凝血試驗(yàn)和臨床化學(xué)和血液學(xué)試驗(yàn)結(jié)果所判定，此些項(xiàng)目結(jié)果必須一直維持在正常范圍±10％內(nèi)；

(4)對(duì)于方案版本jul-01-2010：無(wú)癥狀，定義為患者在篩選訪(fǎng)視(visit1，v1)前24周內(nèi)無(wú)急性或有癥狀的病毒性肝炎，且無(wú)aids-界定疾病的病史，其是由試驗(yàn)主持人根據(jù)疾病史、生理學(xué)檢查、ecg，以及實(shí)驗(yàn)室值所判定；

(5)對(duì)于方案版本mar-09-2010：在篩選訪(fǎng)視(visit1，v1)所獲得cd4+t細(xì)胞數(shù)量＞350個(gè)細(xì)胞/mm³和hiv-1病毒量＞5,000個(gè)拷貝/ml；

(6)對(duì)于方案版本jul-01-2010：在篩選訪(fǎng)視前4周內(nèi)或于篩選訪(fǎng)視(visit1，v1)所獲得cd4+t細(xì)胞數(shù)量＞350個(gè)細(xì)胞/mm³和hiv-1病毒量＞5,000個(gè)拷貝/ml；

(7)未使用治療藥物者即事前和目前未接受抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療的受試者；

(8)非哺乳中婦女；

(9)受試者于對(duì)具生育能力婦女之篩選訪(fǎng)視時(shí)必需具有陰性的血清妊娠試驗(yàn)結(jié)果；

(10)受試者必須同意在試驗(yàn)期間使用屏障避孕法(女性或男性保險(xiǎn)套)；以及

(11)受試者在接受任何研究程序前應(yīng)簽署知情同意書(shū)。

5.試驗(yàn)用藥品和干預(yù)方法

以濃度為10mg/ml(100mg于10ml藥瓶)提供ub-421(db4c7mab)。

把受試者分成4個(gè)劑量組，每一劑量組包含5名受試者，此基于其所接受ub-421的劑量。每個(gè)納入的受試者在第0天(visit2，v2)以以下的劑量水平之一接受ub-421的單次靜脈輸注：1mg/kg體重(第1劑量組)、5mg/kg體重(第2劑量組)、10mg/kg體重(第3劑量組)或25mg/kg體重(第4劑量組)?；谔囟▌┝亢褪茉囌唧w重計(jì)算ub-421的適當(dāng)體積。使用無(wú)菌生理食鹽水調(diào)整每個(gè)個(gè)別劑量的體積，藉此以藥物之等量輸注體積輸注一個(gè)劑量組內(nèi)的每個(gè)個(gè)別受試者。之后使用輸注幫浦輸送ub-421的劑量。

6.療程：

從篩選、治療和隨訪(fǎng)的時(shí)間范圍：62至90天。從輸注到試驗(yàn)結(jié)束的時(shí)間范圍：60天。

7.評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：

7.1.主要安全性終點(diǎn)：

(1)生理學(xué)檢查(pe)

(2)生命征象

(3)臨床化學(xué)和血液學(xué)試驗(yàn)

(4)不良事件(ae)/嚴(yán)重不良事件(sae)的發(fā)生率

(5)心電圖(ecg)

7.2.次要安全性終點(diǎn)：

(1)在給藥后第0天(輸注前)、第14天、第28天和第60天所展現(xiàn)之抗-ub-421抗體的血清濃度(ub-421的免疫原性)。

(2)初始cd4+t細(xì)胞數(shù)量是在篩選訪(fǎng)視(v1)時(shí)評(píng)估，或是基于篩選訪(fǎng)視前4周內(nèi)所提供的預(yù)篩選數(shù)據(jù)。

(3)在給藥后第60天評(píng)估隨訪(fǎng)的cd4+t細(xì)胞數(shù)量。

8.療效終點(diǎn)

以于hiv-1病毒量從基線(xiàn)之改變?cè)u(píng)定療效終點(diǎn)。將基線(xiàn)的hiv-1病毒量定義為在篩選訪(fǎng)視v1時(shí)所評(píng)估的病毒量。

9.藥物動(dòng)力學(xué)(pk)

針對(duì)ub-421評(píng)估以下藥物動(dòng)力學(xué)(pk)參數(shù)：

(1)cmax：給藥后所觀察到的最高血清藥物濃度。

(2)tmax：達(dá)到cmax的時(shí)間。

(3)λz：排除(末端)速度常數(shù)。

(4)t1/2：排除(末端)半衰期。

(5)auc(0→last)：從時(shí)間零至最終樣品評(píng)估時(shí)間之血清藥物濃度-時(shí)間曲線(xiàn)下的面積。

(6)auc(0→∞)：從時(shí)間零至無(wú)限大之血清藥物濃度-時(shí)間曲線(xiàn)下的面積。

(7)cl：從身體之藥物的血清清除率。

(8)vβ：于消除相之分布的體積。

(9)vss：于穩(wěn)定狀態(tài)(steady-state)之分布的體積。

(10)mrt(0→∞)：外推到無(wú)限大的平均滯留時(shí)間(mrt(0→t))。

10.統(tǒng)計(jì)方法

10.1.主要安全性終點(diǎn)

(1)生理學(xué)檢查：利用藉由中心、天數(shù)、劑量組或整體之?dāng)⑹鼋y(tǒng)計(jì)概述生理學(xué)異常。也呈現(xiàn)從基線(xiàn)至最終訪(fǎng)視的轉(zhuǎn)變表。

(2)生命征象：藉由每一訪(fǎng)視利用敘述統(tǒng)計(jì)概述生命征象。也藉由中心、天數(shù)、劑量組或整體呈現(xiàn)相對(duì)于基線(xiàn)值的轉(zhuǎn)變。

(3)臨床化學(xué)和血液學(xué)試驗(yàn)：利用敘述統(tǒng)計(jì)于適用的訪(fǎng)視概述臨床化學(xué)和血液學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果。根據(jù)試驗(yàn)主持人的專(zhuān)業(yè)判斷和在每個(gè)研

究地點(diǎn)的正常范圍標(biāo)準(zhǔn)，將測(cè)試結(jié)果分為四個(gè)類(lèi)別：正常、異常且無(wú)臨床意義(ncs)、異常且有臨床意義(cs)，以及異常且有典型的臨床意義(cst)。在轉(zhuǎn)變表中也呈現(xiàn)從基線(xiàn)至最終訪(fǎng)視之實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果異常的改變。

(4)不良事件(ae)的發(fā)生率：將治療前不良事件、治療相關(guān)緊急不良事件(teae)、以及藥物相關(guān)不良事件概述于頻率分布。每個(gè)報(bào)導(dǎo)的不良事件與一個(gè)國(guó)際通用醫(yī)學(xué)術(shù)語(yǔ)辭典(meddra)編碼和一器官系統(tǒng)分類(lèi)相關(guān)?？蓪?guó)家過(guò)敏癥與傳染病研究所愛(ài)滋病分部(daids)的不良事件分級(jí)表第1.0版用于嚴(yán)重度分級(jí)。

(5)心電圖(ecg)：利用敘述統(tǒng)計(jì)概述于適用之訪(fǎng)視所提供的心電圖紀(jì)錄數(shù)據(jù)。

10.2.次要安全性終點(diǎn)

(1)抗-ub-421抗體的血清濃度：利用適用的訪(fǎng)視概述抗體濃度。

(2)cd4+t細(xì)胞數(shù)量：利用分布統(tǒng)計(jì)對(duì)適用的訪(fǎng)視概述細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞百分比。也概述了于cd4+t細(xì)胞數(shù)量和百分比之相對(duì)于基線(xiàn)至最終訪(fǎng)視的改變。

10.3.療效終點(diǎn)

(1)hiv-1病毒量：于每一訪(fǎng)視利用敘述統(tǒng)計(jì)概述hiv-1病毒量。也利用中心、天數(shù)、治療劑量組和整體呈現(xiàn)相對(duì)于基線(xiàn)數(shù)值之改變＝(于治療后訪(fǎng)視的數(shù)值-于基線(xiàn)訪(fǎng)視的數(shù)值)。

10.4.藥物動(dòng)力學(xué)評(píng)估

于每一訪(fǎng)視利用敘述統(tǒng)計(jì)概述藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

根據(jù)方案和統(tǒng)計(jì)分析方案(sap)，安全性終點(diǎn)是在意圖治療(intent-to-treat，itt)群體進(jìn)行分析，然而療效分析會(huì)在itt和療效群體二者中進(jìn)行。至于藥物動(dòng)力學(xué)評(píng)估，因?yàn)橹挥性谂_(tái)北榮民總醫(yī)院(tvgh)的受試者有樣品可收集作為pk數(shù)據(jù)分析之用，故定義這些受試者為pk群體。pk評(píng)估只在tvgh的受試者進(jìn)行。

11.結(jié)論的摘要

11.1.療效、藥物動(dòng)力學(xué)和安全性結(jié)果

11.1.1療效結(jié)果

如圖22a所示，利用測(cè)量在整個(gè)試驗(yàn)中于不同時(shí)間點(diǎn)之hiv-1病毒量的變化以評(píng)估ub-421的療效。療效分析顯示在ub-421輸注后于來(lái)自第2劑量組(5mg/kg)、第3劑量組(10mg/kg)和第4劑量組(25mg/kg)的受試者，而非于第1劑量組(1mg/kg)的受試者，可發(fā)現(xiàn)于平均hiv-1病毒量之顯著的凈變化。

藉由在單次投予后病毒量下降至2.25log10(來(lái)自10mg/kg組別)可證明抗體藥物ub-421(mabdb4c7)的療效(圖22b)。將對(duì)每一劑量組之hiv-1病毒量的最大平均下降概述如下，并在圖22b顯示：

第1劑量組(1mg/kg)：于第6天(v5)為0.29log10個(gè)拷貝/ml。

第2劑量組(5mg/kg)：于第6天(v5)為0.97log10個(gè)拷貝/ml。

第3劑量組(10mg/kg)：于第10天(v6)為1.58log10個(gè)拷貝/ml。

第4劑量組(25mg/kg)：于第14天(v7)為1.63log10個(gè)拷貝/ml。

hiv-1抑制的持續(xù)時(shí)間與劑量水平相關(guān)，其中相較于較低劑量之劑量組的受試者，在較高劑量之劑量組的受試者顯示hiv-1病毒量下降的持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)(圖22a)。對(duì)以最高劑量ub-421(第4劑量組，25mg/kg)輸注受試者之hiv-1病毒量抑制的持續(xù)時(shí)間維持最長(zhǎng)，約28天。

總之，發(fā)現(xiàn)ub-421抗體在5、10和25mg/kg的劑量水平以劑量-依賴(lài)關(guān)系具有強(qiáng)的抗病毒效應(yīng)。也就是說(shuō)，在可比較的投藥下，相對(duì)于tmb-355，利用ub-421治療時(shí)有更高百分比的患者于血清hiv-1rna水平達(dá)到＞1log10的減少。

針對(duì)tmb-355(tmb-355先前稱(chēng)為tnx-355；kuritzkes，d.r.，etal.，2004，圖1)先前報(bào)導(dǎo)的療效數(shù)據(jù)評(píng)估來(lái)自本試驗(yàn)使用ub-421之療效數(shù)據(jù)的理論比較，如圖23a至圖23c所示。基于此比較，于評(píng)估的100％的受試者中，接受10mg/kg或25mg/kg單次投予時(shí)，ub-421可達(dá)到于病毒量的10倍減少；然而tmb-355只可于使用相同劑量之83％的受試者中達(dá)到于病毒量的10倍減少。

11.1.2藥物動(dòng)力學(xué)結(jié)果

針對(duì)此試驗(yàn)中所使用ub-421的每個(gè)劑量(1、5、10和25mg/kg)評(píng)估以上列出的藥物動(dòng)力學(xué)(pk)參數(shù)。表19概述了在每一劑量組來(lái)自3個(gè)受試者所評(píng)估的多個(gè)pk參數(shù)(cmax、auc(0→∞)、t1/2和mrt)的結(jié)果。結(jié)果顯示每個(gè)pk參數(shù)和投予ub-421劑量的數(shù)據(jù)值之間具有相關(guān)性。也就是說(shuō)，ub-421的劑量由1mg/kg增加至25mg/kg可對(duì)應(yīng)至所評(píng)估之pk參數(shù)的增加。具體來(lái)說(shuō)，cmax由28.6μg/ml增加至462.5μg/ml；auc(0→∞)由201μg-小時(shí)/ml增加至51367μg-小時(shí)/ml；t1/2由14.4小時(shí)增加至85.4小時(shí)；且mrt(0→∞)由21.6小時(shí)增加至97.4小時(shí)。

11.1.3安全性結(jié)果

透過(guò)生理學(xué)檢查、生命征象、臨床化學(xué)和血液學(xué)試驗(yàn)、ae/sae的發(fā)生率和心電圖評(píng)估ub-421的安全性特征。也測(cè)定cd4+t細(xì)胞數(shù)量和抗-ub-421抗體濃度以提供進(jìn)一步的安全性評(píng)估。

針對(duì)總共30個(gè)事件，將teaes的凈發(fā)生率以嚴(yán)重度分級(jí)為65.0％(20個(gè)受試者中的13個(gè))。報(bào)導(dǎo)的三個(gè)受試者具有六件治療相關(guān)的不良事件與嚴(yán)重度分級(jí)：于受試者b-001-001(投予1mg/kg劑量的ub-421)為第1級(jí)(輕度)“搔癢”和“癤瘡”；于受試者a-015-009(投予10mg/kg劑量的ub-421)為第1級(jí)(輕度)“淋巴細(xì)胞數(shù)量增加”、“嗜中性球數(shù)量減少”和“血小板數(shù)量下降”；且于受試者b-015-008(投予25mg/kg劑量的ub-421)為第2級(jí)(中度)“麻疹樣疹”。于受試者b-015-008之麻疹樣疹的發(fā)生為未預(yù)期之嚴(yán)重藥品不良反應(yīng)(suspectedunexpectedseriousadversereaction，susar)；此受試者在5天護(hù)理之后從醫(yī)院出院。報(bào)導(dǎo)的一位受試者具有另外的sae，其與ub-421無(wú)關(guān)，于受試者a-012-005(投予5mg/kg劑量的ub-421)為肛門(mén)廔管和痔瘡；在生命征象或心電圖的結(jié)果則未發(fā)現(xiàn)與治療相關(guān)的異常。于治療僅有一個(gè)劑量；因此，尚未發(fā)生治療中斷或劑量變化。

在三個(gè)受試者(分別來(lái)自第2、3和4劑量組的一位受試者)中在第14天(v7)檢測(cè)到抗-ub-421抗體，其水平略高于0.4μg/ml的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)極限。在經(jīng)過(guò)第60天(試驗(yàn)結(jié)束)的任何后續(xù)的訪(fǎng)視中未檢測(cè)出抗-ub-421抗體。沒(méi)有相關(guān)的不良事件或其它生理學(xué)異常與抗-ub-421抗體的出現(xiàn)有關(guān)。

此外，cd4+t細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞百分比在60天的治療期和無(wú)治療隨訪(fǎng)期期間為相對(duì)穩(wěn)定的。

總而言之，當(dāng)以介于1和25mg/kg的劑量范圍透過(guò)靜脈內(nèi)(iv)輸注投予單劑量時(shí)，ub-421對(duì)hiv-1感染的成人是安全且耐受性良好的。

12.結(jié)論

此第i期試驗(yàn)，以劑量范圍從1至25mg/kg的ub-421單次靜脈輸注，證明ub-421對(duì)hiv-1感染的成人是安全且耐受性良好的。大部分的不良事件為輕度或與試驗(yàn)藥物無(wú)關(guān)的。麻疹樣疹之susar的唯一發(fā)生是發(fā)生在第4劑量組(25mg/kg劑量)，但目前還不清楚這起事件是否與試驗(yàn)藥物有關(guān)。在三個(gè)受試者中只于第14天(v7)檢測(cè)到對(duì)ub-421的暫時(shí)性免疫反應(yīng)，其抗體水平僅略高于0.4μg/ml的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)極限，證明此抗體的出現(xiàn)為輕微的臨床意義。關(guān)于此試驗(yàn)藥物的藥物動(dòng)力學(xué)概況，主要參數(shù)的趨勢(shì)與劑量水平相關(guān)。此外，hiv-1病毒量抑制的程度和持續(xù)時(shí)間與5、10和25mg/kg之ub-421劑量水平顯著地正相關(guān)，但在1mg/kg劑量組并非如此明顯。

考慮到從此試驗(yàn)所獲得的安全性和療效結(jié)果，在治療無(wú)癥狀hiv-1感染的成年人中許可至少為5mg/kg劑量水平ub-421的進(jìn)一步發(fā)展。

實(shí)施例14.第iia期，開(kāi)放性，多次投予，劑量依賴(lài)性試驗(yàn)以研究ub-421于無(wú)癥狀hiv-1感染之成年人的安全性和療效

1.試驗(yàn)?zāi)康?/p>

(1)評(píng)估于無(wú)癥狀hiv-1感染受試者之ub-421二劑量治療方案之多次投予的安全性和耐受性。

(2)獲得于這些受試者之ub-421二劑量治療方案之多次投予的抗病毒活性證據(jù)。

(3)評(píng)估抗病毒活性和安全性概況以確定最佳ub-421給藥和劑量治療方案。

(臨床試驗(yàn)識(shí)別碼：nct01668043)。

2.試驗(yàn)設(shè)計(jì)

這是利用ub-421之重復(fù)靜脈內(nèi)給藥的開(kāi)放性試驗(yàn)。為了可受試性(eligibility)而篩選對(duì)hiv-1血清反應(yīng)陽(yáng)性且無(wú)癥狀之受試者。二十九位納入的受試者接受兩個(gè)劑量水平(每周10mg/kg(第1劑量組)或每?jī)芍?5mg/kg(第2劑量組))之一的試驗(yàn)藥物(ub-421)之多次靜脈輸注，共為期8周的治療期。基于收案順序透過(guò)地點(diǎn)且輪流地將受試者分配到兩個(gè)試驗(yàn)劑量組之一。在8周的治療期之后隨訪(fǎng)受試者額外的八周。此試驗(yàn)在第16周結(jié)束。

3.納入的標(biāo)準(zhǔn)

受試者必須滿(mǎn)足以下標(biāo)準(zhǔn)才有資格參與第iia期試驗(yàn)：

(1)無(wú)癥狀，未接受抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者(antiretroviraltherapyhiv-1血清反應(yīng)陽(yáng)性

(2)cd4+t細(xì)胞數(shù)量＞350個(gè)細(xì)胞/mm³

(3)hiv-1病毒量＞5,000個(gè)拷貝/ml

(4)無(wú)需要立即治療的感染癥(hiv-1除外)

(5)無(wú)使用免疫調(diào)節(jié)藥物或全身化療

(6)無(wú)需高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)。

當(dāng)依據(jù)對(duì)hiv/aids診斷與治療的現(xiàn)行指導(dǎo)方針由試驗(yàn)總主持人視作必需時(shí)，在這項(xiàng)試驗(yàn)完成后，受試者于門(mén)診遵循例行的監(jiān)測(cè)時(shí)程表(無(wú)抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物)或接受標(biāo)準(zhǔn)治療之抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(例如haart)。允許于使用ub-421之第i期試驗(yàn)所納入的個(gè)體和符合第iia期試驗(yàn)之進(jìn)入標(biāo)準(zhǔn)的個(gè)體參與此次試驗(yàn)。

4.試驗(yàn)用藥品

以濃度為10mg/ml(100mg于10ml藥瓶)提供ub-421(db4c7mab)。

每個(gè)納入的受試者接受利用以下劑量水平之一的ub-421的多次靜脈輸注：每周10mg/kg(第1劑量組)或每?jī)芍?5mg/kg(第2劑量組)，為期8周。ub-421的適當(dāng)體積是基于特定劑量和受試者體重。使用無(wú)菌生理食鹽水調(diào)整每個(gè)個(gè)別劑量的體積，藉此利用藥物之等量輸注體積輸注一個(gè)劑量組內(nèi)的每個(gè)個(gè)別受試者。對(duì)10mg/kg劑量組的輸注總體積為約100ml，而對(duì)25mg/kg劑量組的輸注總體積為約200ml。每次給藥的輸注時(shí)間為約一到兩小時(shí)。

5.評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：

5.1.主要安全性和療效終點(diǎn)：

直到第16周(試驗(yàn)結(jié)束)評(píng)估ub-421的以下安全性和耐受性參數(shù)：

(1)生理學(xué)檢查(pe)

(2)生命征象

(3)臨床化學(xué)和血液學(xué)試驗(yàn)

(4)不良事件(ae)/嚴(yán)重不良事件(sae)的發(fā)生率

在試驗(yàn)期(從v2至v12)期間對(duì)每一個(gè)劑量組評(píng)估ub-421的以下療效參數(shù)：

(1)個(gè)別最大病毒量下降

(2)平均最大病毒量下降

5.2.次要病毒學(xué)終點(diǎn)

在試驗(yàn)期(從v2至v12)期間評(píng)估以下病毒學(xué)反應(yīng)：

(1)在每一試驗(yàn)劑量組內(nèi)和之間根據(jù)次群組的個(gè)別最大病毒量下降和平均最大病毒量下降。

(2)具有病毒量<50個(gè)拷貝/ml之受試者的比例；

(3)具有病毒量<200個(gè)拷貝/ml之受試者的比例；

(4)具有病毒量下降＞0.5log10個(gè)拷貝/ml之受試者的比例；

(5)具有病毒量下降＞1log10個(gè)拷貝/ml之受試者的比例；

(6)分別地對(duì)第1劑量組和第2劑量組在最終完成試驗(yàn)藥物投予后直到7天和14天具有病毒反彈(于病毒量從最低點(diǎn)有超過(guò)0.5log10的增加)之受試者的比例；

(7)抗-ub-421抗體的血清濃度(ub-421的免疫原性)；

(8)cd4+和cd8+t細(xì)胞數(shù)量的變化；

(9)ub-421的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)(cmax、auc(0→∞)和auc(0→last))。

6.分析群體

意圖治療(itt)群體：29個(gè)受試者，其接受試驗(yàn)藥物的至少一次給藥。

第1劑量組和第2劑量組的itt群體分別為14個(gè)受試者和15個(gè)受試者。

依方案執(zhí)行臨床試驗(yàn)的群體(per-protocol(pp)population)：18個(gè)受試者，其接受試驗(yàn)藥物的所有給藥，具有有效的基線(xiàn)和至少一個(gè)有效的治療后療效測(cè)定(hiv-1病毒量試驗(yàn))，且無(wú)重大違反方案規(guī)定。第1劑量組和第2劑量組的pp群體分別為7個(gè)受試者和11個(gè)受試者。

安全性和免疫原性群體：將29個(gè)受試者納入意圖治療(itt)群體。

藥物動(dòng)力學(xué)群體：是基于安全性和免疫原性群體中的次群體。

于安全性和免疫原性群體分析基線(xiàn)數(shù)據(jù)和安全性終點(diǎn)，然而療效分析是在itt和pp群體二者中進(jìn)行。在藥物動(dòng)力學(xué)群體進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)分析。

7.試驗(yàn)期的持續(xù)時(shí)間

篩選期：＜4周

治療期：8周

隨訪(fǎng)期：治療期結(jié)束后接著的8周

visit0代表初始篩選，而試驗(yàn)期間的每一次訪(fǎng)視代表1周期間。隨訪(fǎng)期通常以每周間隔執(zhí)行。

8.結(jié)果的概述

8.1.試驗(yàn)群體

在臺(tái)灣的兩個(gè)試驗(yàn)地點(diǎn)篩選總共33個(gè)無(wú)癥狀之hiv感染的成年人。其中29個(gè)受試者通過(guò)了篩選標(biāo)準(zhǔn)并被選擇進(jìn)行試驗(yàn)。所有符合資格的29個(gè)受試者均為男性。

8.2.安全性和耐受性結(jié)果

所有29名受試者在試驗(yàn)期間經(jīng)歷至少1件不良事件，共計(jì)128件不良事件。其中，114例(在所有29個(gè)受試者中有89.06％)為治療相關(guān)緊急不良事件(teaes)和14例(在5個(gè)受試者中有10.94％)為治療前不良事件。于29個(gè)受試者中未觀察到嚴(yán)重不良事件(saes)。所有治療前不良事件均與ub-421無(wú)關(guān)，且這些事件中無(wú)事件被視為saes。報(bào)導(dǎo)teaes中的大多數(shù)(78.95％)為輕度，17.54％為中度，且3.51％(于一個(gè)受試者)是重度的。

最常見(jiàn)的(＞10％)teae是皮疹和蕁麻疹。除了不良事件，在22個(gè)受試者中觀察到于血液學(xué)(于22個(gè)受試者中的154個(gè)事件)和生物化學(xué)(于6個(gè)受試者中的32個(gè)事件)之實(shí)驗(yàn)室異常檢測(cè)結(jié)果。然而，大多數(shù)的變化是輕微且不具有臨床意義的。生理學(xué)檢查結(jié)果和生命征象在試驗(yàn)期期間大多為正?；驘o(wú)臨床意義。

如臨床試驗(yàn)方案所說(shuō)明，ub-421在試驗(yàn)期期間為耐受性良好的，其于8周治療期的整體治療耐受性為73.84％。

8.3.藥效學(xué)

8.3.1cd4⁺t和cd8⁺t細(xì)胞數(shù)量

在8周治療期和8周隨訪(fǎng)期之后，平均cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量從基線(xiàn)略微減少了55.10±117.97個(gè)細(xì)胞/mm³，而平均cd8⁺t細(xì)胞數(shù)量從基線(xiàn)增加了193.31±459.34個(gè)細(xì)胞/mm³。第1劑量組受試者之代表的cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量和平均cd4t細(xì)胞數(shù)量如表22a和圖24a所示。第2劑量組受試者之代表的cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量和平均cd4t細(xì)胞數(shù)量如表22b和圖24b所示。

8.3.2以u(píng)b-421覆蓋cd4受體

利用熒光結(jié)合的ub-421透過(guò)流式細(xì)胞儀偵測(cè)cd4受體覆蓋的程度。從四個(gè)代表受試者所提供之結(jié)果，兩個(gè)來(lái)自第1劑量組和兩個(gè)來(lái)自第2劑量組，分別如圖25a至25b和圖25c至25d所示。此試驗(yàn)的靈敏度為0.15μg/ml。以每周10mg/kg或每?jī)芍?5mg/kg重復(fù)給藥時(shí)，ub-421的臨床療效顯示，當(dāng)作為單一藥物治療時(shí)，于＞10μg/ml之ub-421血清水平存在下可使病毒減少至低于檢測(cè)極限。只要pbmccd4+細(xì)胞被完全覆蓋(即db4c7-alexa結(jié)合百分比接近0)就沒(méi)有病毒反彈。

在以?xún)蓚€(gè)劑量水平投予ub-421二至三次后可達(dá)成以u(píng)b-421完全覆蓋位于pbmc上之cd4受體。此外，于整個(gè)治療期期間可保持以u(píng)b-421完全覆蓋cd4+t細(xì)胞(圖25a-25d，上圖)。在大多數(shù)受試者中，如同利用熒光db4c7mab(db4c7-alexa)之結(jié)合所測(cè)定，在最終ub-421輸注的三周內(nèi)，結(jié)合至cd4受體的ub-421減少并回復(fù)至基線(xiàn)數(shù)值。

評(píng)估試驗(yàn)期間于受試者血清中所呈現(xiàn)之ub-421的濃度，以決定足以達(dá)成完全cd4覆蓋和hiv-1病毒抑制之ub-421的血清濃度?；谒@得的數(shù)據(jù)，只要ub-421血清濃度維持在高于10μg/ml，則可利用ub-421達(dá)成持續(xù)的cd4+t細(xì)胞的完全覆蓋和hiv-1病毒抑制(圖25a-25d，下圖)。

8.4.藥物動(dòng)力學(xué)

在第1劑量組中觀察到平均auc從17300±10000μgx小時(shí)/ml(visit1-2)增加至23900±10700μgx小時(shí)/ml(visit8-9)，然后在visit11-12回復(fù)至基線(xiàn)。在第1劑量組中所觀察到的平均auc(0→last)是171000±70300μgx小時(shí)/ml。

在第2劑量組中觀察到平均auc從56500±19500μgx小時(shí)/ml(visit1-3)增加至61100±20700μgx小時(shí)/ml(visit7-9)，然后在visit11-12回復(fù)至基線(xiàn)。在第2劑量組中所觀察到的平均auc(0→last)是239000±73900μgx小時(shí)/ml。

這些數(shù)據(jù)證明，如同利用auc(0→last)所測(cè)定，相較于接受每周10mg/kgub-421輸注者(第1劑量組，171000±70300μgx小時(shí)/ml)，平均血清藥物濃度以在投予每?jī)芍?5mg/kgub-421輸注的受試者中較高(第2劑量組，239000±73900μgx小時(shí)/ml)。

8.5.療效結(jié)果

此試驗(yàn)招募29個(gè)hiv-1感染的受試者，其接受至少一劑的ub-421(itt群體)。招募的29個(gè)受試者中，共計(jì)18個(gè)受試者完成了8周的治療期，其接受試驗(yàn)藥物的所有給藥(pp群體)。于試驗(yàn)期間透過(guò)評(píng)定所納入無(wú)癥狀hiv-1感染受試者的個(gè)別和平均最大病毒量下降，以評(píng)估ub-421多次投予的療效，且將第1和2劑量組之itt和pp群體的結(jié)果概述于表20。

發(fā)現(xiàn)平均最大病毒量下降在itt或pp群體的兩個(gè)劑量水平之間并無(wú)顯著差異。具體來(lái)說(shuō)，在第1劑量組于itt群體之病毒量減少了2.27±0.60log10個(gè)拷貝/ml，而在第2劑量組于itt群體之病毒量減少了2.45±0.46log10個(gè)拷貝/ml。于pp群體，在第1劑量組病毒量減少了2.73±0.34log10個(gè)拷貝/ml，而在第2劑量組病毒量減少了2.47±0.45log10個(gè)拷貝/ml。

在治療期期間，于所有(n＝29，100.00％)試驗(yàn)受試者觀察到≥0.5log10個(gè)拷貝/ml的病毒量下降；且于所有(n＝29，100.00％)試驗(yàn)受試者觀察到≥1log10個(gè)拷貝/ml的病毒量下降。

于以下內(nèi)容揭露在治療期期間所獲得之?dāng)?shù)據(jù)的進(jìn)一步評(píng)估：

在第1劑量組，于itt之8/14(57.14％)的受試者和于pp之5/7(71.43％)的受試者具有≤200個(gè)拷貝/ml的病毒量；此外，于itt之3/14(21.43％)的受試者和于pp之3/7(42.86％)的受試者具有<50個(gè)拷貝/ml的病毒量。

在第2劑量組，于itt之10/15(66.67％)的受試者和于pp之7/11(63.64％)的受試者具有≤200個(gè)拷貝/ml的病毒量；且于itt之3/15(20.00％)的受試者和于pp之2/11(18.18％)的受試者具有<50個(gè)拷貝/ml的病毒量。

來(lái)自第1和2劑量組受試者之代表的病毒量下降數(shù)據(jù)如表21a至21c和圖25a至25d(上圖)所示。在每一劑量組之內(nèi)、每一劑量組之間，或在每一劑量組內(nèi)的次群體之間，于具有病毒量下降之受試者的比例并無(wú)統(tǒng)計(jì)上顯著的差異。此外，在8周治療期期間，在第1和2劑量組分別有43％和18％受試者的病毒量減少至低于目前實(shí)驗(yàn)檢測(cè)極限(20個(gè)拷貝/ml)的水平。在所有受試者中，當(dāng)以u(píng)b-421完全覆蓋cd4+t細(xì)胞時(shí)可使病毒量持續(xù)下降。在隨訪(fǎng)期結(jié)束時(shí)，于兩個(gè)劑量組的病毒量回復(fù)至基線(xiàn)水平。此外，在治療期期間于任何的試驗(yàn)受試者中未觀察到病毒反彈。來(lái)自?xún)蓚€(gè)劑量組之患者于整個(gè)治療期中未偵測(cè)到可計(jì)量的抗-ub421抗體(表21a至21c)。

8.6.ub-421和tmb-355的比較

針對(duì)由他人(jacobson，j.l.，eta1.，2009；toma，j.，etal.，2011；andpace，c.s.，etal.，2013)所執(zhí)行tmb-355(ibalizumab，先前稱(chēng)為tnx-355)的相似試驗(yàn)所提供的結(jié)果，以評(píng)估ub-421于此試驗(yàn)所提供之結(jié)果。圖26a顯示在具有cd4+細(xì)胞完全覆蓋的ub-421存在下，有高達(dá)＞3log10之優(yōu)異的病毒量下降而無(wú)病毒量反彈。相反地，甚至在cd4+細(xì)胞完全覆蓋存在下，從治療起只有一周之后，接受tmb-355治療的患者便遭遇到病毒反彈，此為抗藥性病毒突變種發(fā)展的象征(圖26b)。

這兩種治療方案的比較，如圖所示，證明了利用ub-421治療hiv感染的受試者具有較tmb-355治療明顯的優(yōu)勢(shì)。具體來(lái)說(shuō)，ub-421在整個(gè)治療期中提供了于hiv病毒量的持續(xù)性下降，且甚至在進(jìn)入到隨訪(fǎng)期的一或兩周仍具有＞3log10的最大病毒量下降。相反地，tmb-355藉由第一次投予只提供了暫時(shí)性的病毒量下降，以及接近1log10之最大病毒量下降。

此外，使用tmb-355之先前試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，盡管血清tmb-355之呈現(xiàn)和cd4陽(yáng)性t細(xì)胞之完全覆蓋，hiv病毒反彈仍在進(jìn)入治療的一周后發(fā)生(jacobson，j.l.，etal.，2009)。這結(jié)果與于上述實(shí)施例4之先前預(yù)測(cè)一致，非競(jìng)爭(zhēng)型進(jìn)入抑制機(jī)制，如tmb-355(ibalizumab)所介導(dǎo)者，在抗體治療期期間可提供抗藥性hiv突變種發(fā)展的高度可能性。實(shí)際上，發(fā)現(xiàn)來(lái)自接受tmb-355治療以減少病毒量之患者的病毒抗藥性突變種于gp120的v5區(qū)域上辨別出突變(toma，j.，etal.，2011；pace，c.s.，etal.，2013)。

9.結(jié)論

發(fā)現(xiàn)于無(wú)癥狀hiv-1感染的受試者以u(píng)b-421進(jìn)行8周治療具有良好的耐受性。此外，分別來(lái)自第1和2劑量組對(duì)個(gè)別受試者之代表的cd4+t細(xì)胞數(shù)量(表22a和22b)和平均cd4t細(xì)胞數(shù)量(圖24a和24b)在整個(gè)為期兩個(gè)月的監(jiān)測(cè)中保持穩(wěn)定。

更重要的是，以u(píng)b-421治療導(dǎo)致在所有受試者中顯著的病毒量下降(100％接受治療的受試者以≥1log10個(gè)拷貝/ml之最大下降作出反應(yīng))。兩種治療方案，每周10mg/kg(第1劑量組)和每?jī)芍?5mg/kg(第2劑量組)輸注，顯示于病毒量下降之類(lèi)似療效。在第1劑量組于itt群體之平均最大病毒量下降達(dá)到2.27±0.60log10個(gè)拷貝/ml，而在第2劑量組于itt群體之平均最大病毒量下降達(dá)到2.45±0.46log10個(gè)拷貝/ml。利用ub-421所觀察到的病毒減少療效比迄今所測(cè)試的任何其它的小分子抗hiv藥物優(yōu)越。

從此周密進(jìn)行之ub-421的多劑量第iia期所得到的臨床試驗(yàn)結(jié)果證明在治療期期間不具有病毒反彈之作為單一藥物治療的高耐受性、安全性，和于病毒量下降之空前的療效。在這試驗(yàn)中所獲得的結(jié)果是意想不到的，且與此領(lǐng)域中長(zhǎng)期抱持之懷疑(結(jié)合cd4結(jié)構(gòu)域1的抗-cd4單克隆抗體是免疫抑制的，因?yàn)槠鋵?duì)于第二型主要組織相容性復(fù)合體所介導(dǎo)之免疫功能的干擾，且此種療法對(duì)于hiv疾病之治療并不合適(jacobson，j.l.，etal.，2009))相矛盾。此結(jié)果進(jìn)一步指出利用ub-421合并使用正交的(orthogonal)haart及/或其它hiv病毒庫(kù)激活劑(例如hdaci)之hiv療法的額外形式可達(dá)到hiv感染的功能性治愈。

實(shí)施例15.利用ub-421單一藥物治療的治療形式作為于hiv-1感染成年人之抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法的替代品

圖27說(shuō)明利用ub-421單一藥物治療對(duì)各種hiv患者群體的治療形式以作為抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法的替代品。詳細(xì)的目的和方案于以下內(nèi)容所述。

1.適用的患者群體

藉由穩(wěn)定的高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)而具有病毒抑制之對(duì)hiv-1為血清反應(yīng)陽(yáng)性的受試者有資格進(jìn)行此種治療。

符合資格的患者在4個(gè)月的初期透過(guò)iv或sc途徑接受ub-421投予，之后是haart治療的另一個(gè)循環(huán)?！癶aart-ub-421”交替治療循環(huán)可重復(fù)多次，直到停用ub-421和haart治療時(shí)不再觀察到病毒反彈為止，從而達(dá)成對(duì)hiv感染的功能性治愈。

更具體地，這些受試者分別地于為期8周和16周的治療期，以?xún)蓚€(gè)劑量水平(每周10mg/kg或每?jī)芍?5mg/kg)之一，接受試驗(yàn)藥物(ub-421)的多次靜脈輸注。在第一次ub-421輸注的前一天停用haart治療。在ub-421投予之前，依照試驗(yàn)總主持人所判斷，給予受試者預(yù)防用藥(治療前給藥)，包含類(lèi)固醇和抗組織胺藥物，以預(yù)防輸注反應(yīng)。在完成最后一次排程的ub-421給藥后，所有受試者在同一天重啟其原先或其它適當(dāng)之病毒敏感的抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法。haart治療方案之使用是由試驗(yàn)總主持人所判斷。在治療期期間和在治療期結(jié)束后6個(gè)月監(jiān)測(cè)來(lái)自所有患者的病毒量和cd4細(xì)胞數(shù)量。

2.納入標(biāo)準(zhǔn)

若受試者滿(mǎn)足以下所有標(biāo)準(zhǔn)則可納入此治療形式：

(1)hiv血清反應(yīng)陽(yáng)性；

(2)年齡20歲(含)以上；

(3)已接受haart治療，定義為至少2個(gè)核苷類(lèi)/核苷酸類(lèi)反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nrtis)加上1個(gè)非核苷類(lèi)反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nnrti)、整合酶抑制劑，或蛋白酶抑制劑，達(dá)至少2年；此治療在進(jìn)入本試驗(yàn)之前一年內(nèi)

是不間斷的且無(wú)藥物更換。

(4)在篩選訪(fǎng)視前1年內(nèi)具有cd4+t細(xì)胞數(shù)量≥500個(gè)細(xì)胞/mm³或cd4百分比≥28％的兩個(gè)測(cè)量值；

(5)在篩選訪(fǎng)視前4周內(nèi)或于篩選訪(fǎng)視時(shí)所提供具有cd4+t細(xì)胞數(shù)量≥500個(gè)細(xì)胞/mm³；

(6)篩選訪(fǎng)視前至少1年之hiv-1血漿rna保持在低于檢測(cè)極限，每年具有至少2個(gè)病毒量測(cè)定。病毒量在篩選訪(fǎng)視前4周內(nèi)或于篩選訪(fǎng)視時(shí)也是低于檢測(cè)極限；在篩選訪(fǎng)視前4周以前的可檢測(cè)hiv血漿rna的單次事件將不排除參與。

3.排除標(biāo)準(zhǔn)

為了以下任何的理由可將受試者排除在此治療形式之外：

(1)需要立即治療的任何感染癥(hiv除外)；

(2)根據(jù)美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(cdc)對(duì)hiv感染分類(lèi)系統(tǒng)按照第b類(lèi)和第c類(lèi)條件之任何先前確診或現(xiàn)行的aids-界定疾?。?/p>

(3)體重＞80kg；

(4)在篩選前12周內(nèi)任何紀(jì)錄的cd4+t細(xì)胞數(shù)量<250個(gè)細(xì)胞/mm³或cd4+t細(xì)胞百分比≤14％；

(5)先前納入于ub-421的第i期或第iia期試驗(yàn)，或呈現(xiàn)抗-ub-421抗體的任何病史；

(6)在試驗(yàn)藥物ub-421第一次給藥前12周內(nèi)對(duì)單克隆抗體的任何先前暴露；

(7)任何顯著疾病(除了hiv-1感染)或臨床上顯著的發(fā)現(xiàn)，包括精神和行為問(wèn)題，根據(jù)篩選、病史及/或生理學(xué)檢查決定，由試驗(yàn)主持人判定，將受試者排除參加此項(xiàng)試驗(yàn)；

(8)在試驗(yàn)藥物第一次給藥前8周內(nèi)的任何疫苗接種；

(9)在試驗(yàn)藥物第一次給藥前12周內(nèi)的任何免疫調(diào)節(jié)治療(包含干擾素)、全身化療；

(10)少于12個(gè)月的預(yù)期余命；

(11)在試驗(yàn)藥物第一次給藥前12周內(nèi)的任何非法靜脈注射吸毒；

(12)由于病毒學(xué)失敗和先前的非何杰金氏淋巴瘤或卡波西氏肉瘤之不只一次的haart治療方案改變；

(13)任何當(dāng)前之酒精或非法毒品的使用，由試驗(yàn)主持人判定，會(huì)妨礙受試者去遵從投藥和訪(fǎng)視時(shí)程表以及方案評(píng)估的能力。

4.藥品成品

以濃度為10mg/ml(100mg于10ml藥瓶)提供藥品成品ub-421(db4c7mab)。受試者利用靜脈輸注接受10mg/kgub-421的8次每周劑量或25mg/kgub-421的8次每?jī)芍軇┝俊?/p>

ub-421的適當(dāng)體積是基于特定劑量和受試者體重。使用無(wú)菌生理食鹽水調(diào)整每個(gè)個(gè)別劑量的體積，藉此利用藥物之等量輸注體積輸注一個(gè)劑量組內(nèi)的每個(gè)個(gè)別受試者。對(duì)10mg/kg劑量組的輸注總體積為約100ml，而對(duì)25mg/kg劑量組的輸注總體積為約200ml。每次給藥的輸注時(shí)間為約一到兩小時(shí)。

實(shí)施例16.利用ub-421合并使用haart的治療形式供hiv-1感染的功能性治愈

圖28說(shuō)明利用抗體ub-421合并使用haart對(duì)各種hiv患者群體的治療形式可供hiv-1感染的功能性治愈。適用的患者群體：(1)未使用治療藥物之hiv患者；(2)haart治療穩(wěn)定的hiv患者；以及(3)haart治療失敗之hiv患者。

更具體地，于受感染之受試者供hiv功能性治愈的臨床方案之達(dá)成是藉由在初期(為期4個(gè)月)透過(guò)iv或sc途徑投予ub-421，初期(為期4個(gè)月)之后是治療假日(為期2個(gè)月)，其作為在兩個(gè)完整循環(huán)(為期一年)中的一個(gè)治療循環(huán)(為期6個(gè)月)。這些相同的受試者也在ub-421治療之兩個(gè)完整循環(huán)的期間開(kāi)始和持續(xù)haart治療。在兩個(gè)完整循環(huán)結(jié)束時(shí)，停用haart和ub-421(a組(arma))以評(píng)估發(fā)生病毒反彈所需的時(shí)間，如果有病毒反彈的話(huà)。對(duì)照組中，包含在haart治療停用之前透過(guò)相同的12個(gè)月期間單獨(dú)以haart治療的受試者，其也被評(píng)估以評(píng)定發(fā)生病毒反彈的時(shí)間，如果有病毒反彈的話(huà)(b組(armb))。

在同時(shí)發(fā)生ub-421和haart治療的二個(gè)循環(huán)期間和治療期后6個(gè)月，共計(jì)18個(gè)月，監(jiān)測(cè)來(lái)自所有患者的病毒量及cd4細(xì)胞數(shù)量。

a組：以haart治療合并使用每周10mg/kg或每?jī)芍?5mg/kg的ub-421投予。b組：?jiǎn)为?dú)以haart治療。

1.于功能性治愈之ub-421治療的設(shè)計(jì)(表23)

ub-421勝過(guò)haart藥物的潛在優(yōu)勢(shì)：

(1)ub-421可阻斷hiv-1病毒的細(xì)胞間傳播

(2)ub-421交聯(lián)cd4的類(lèi)cdr-2環(huán)并活化細(xì)胞，且因此從潛伏誘導(dǎo)和釋放hiv-1

2.目標(biāo)

(1)利用ub-421合并使用haart，藉由阻斷hiv之無(wú)細(xì)胞和細(xì)胞間傳播，以提供hiv感染的受試者有效的治療和保護(hù)。

(2)于hiv感染的受試者提供對(duì)hiv的功能性治愈。

3.適用的患者群體

(1)haart治療穩(wěn)定的hiv患者；(2)未使用haart治療之hiv患者；以及(3)haart治療失敗之hiv患者。

4.藥品成品ub-421

以濃度為10mg/ml(100mg于10ml藥瓶)提供藥品成品ub-421(db4c7mab)。受試者利用靜脈輸注接受10mg/kgub-421的8次每周劑量或25mg/kgub-421的8次每?jī)芍軇┝俊?/p>

ub-421的適當(dāng)體積是基于特定劑量和受試者體重。使用無(wú)菌生理食鹽水調(diào)整每個(gè)個(gè)別劑量的體積，藉此利用藥物之等量輸注體積輸注一個(gè)劑量組內(nèi)的每個(gè)個(gè)別受試者。對(duì)10mg/kg劑量組的輸注總體積為約100ml，而對(duì)25mg/kg劑量組的輸注總體積為約200ml。每次給藥的輸注時(shí)間為約一到兩小時(shí)。

5.分配干預(yù)

分配以下的干預(yù)措施：

5.1.a組-ub-421和haart治療的合并使用

受試者以適當(dāng)?shù)膆aart療法持續(xù)地治療，并也以持續(xù)一年之兩個(gè)完整循環(huán)的ub-421治療。ub-421治療的每個(gè)循環(huán)包括在4個(gè)月的期間以每周10mg/kgub-421投予或以每?jī)芍?5mg/kgub-421投予，之后接續(xù)無(wú)ub-421治療的兩個(gè)月。

在1年的治療期結(jié)束后，停用haart和ub-421治療。進(jìn)行額外的觀察試驗(yàn)(藉由于缺乏haart和ub-421狀況下未見(jiàn)任何病毒反彈)以確保hiv感染的功能性治愈。

5.2.b組-單獨(dú)以haart治療

作為對(duì)照組，于同樣期間內(nèi)利用適當(dāng)?shù)膆aart療法而未以u(píng)b-421治療用以持續(xù)地治療一組個(gè)別的受試者。

在1年的治療期結(jié)束后，停用haart治療并針對(duì)病毒反彈對(duì)受試者進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

所有說(shuō)明書(shū)中所揭示之發(fā)明技術(shù)特點(diǎn)可以任意方式組合。說(shuō)明書(shū)中揭示之每一技術(shù)特點(diǎn)可以提供相同、等同或相似目的之其它方式替換。因此，除非另有特別說(shuō)明，文中所有揭示之特點(diǎn)均只是等同或相似特點(diǎn)之一般系列之實(shí)例。

由上述可知，熟習(xí)此技藝者能輕易地了解本發(fā)明之必要特征，在不脫離其精神與范圍之下能就本發(fā)明做許多改變與調(diào)整以應(yīng)用于不同用途與條件。

表1.在hiv治療上未滿(mǎn)足的醫(yī)療需求：功能性治愈和根除

表2.目前發(fā)展中供hiv感染靜默t細(xì)胞之再活化的hdac抑制劑的列表

表3.單克隆抗體b4的hiv進(jìn)入抑制活性(monogram生物科學(xué)phenosense^tm試驗(yàn))

表4.來(lái)自鼠源抗體b4重鏈和輕鏈序列的相對(duì)應(yīng)cdr1、2、3序列

表5.相較于親本b4之去免疫化b4(db4c7)的中和活性(mt-2微斑試驗(yàn))

表6.相較于親本b4之去免疫化b4(db4c7)的中和活性(pbmc試驗(yàn))

表8.db4c7對(duì)hpb-all細(xì)胞之結(jié)合親和力(ec50)

表9.db4c7對(duì)hpb-all細(xì)胞之絕對(duì)結(jié)合親和力(kd)和最大結(jié)合容量(bmax)

表10.利用(1)山羊抗-huigg-fitc和(2)db4c7-alexa結(jié)合至血液cd4+t細(xì)胞所測(cè)得之db4c7的結(jié)合活性(ec50)

表11.單克隆抗體b4阻斷hiv的無(wú)細(xì)胞和細(xì)胞間傳播

表12.利用facs分析的順序性染色-陽(yáng)性pbmc百分比

表13.于pbmc培養(yǎng)物的tnf-α水平和hiv-1病毒量

nd：低于檢測(cè)極限

表14a.試驗(yàn)a：于狒狒的單次投予臨床前試驗(yàn)

表14b.試驗(yàn)b：于狒狒的多次投予臨床前試驗(yàn)

¹為期8周每周投予

²劑量：mg(ub-421)/kg(體重)

表15.于狒狒的血液和活檢結(jié)果

表16.于狒狒的觀察和尸體剖檢結(jié)果

表17.ub-421的臨床前概述：于狒狒的ind-enabling毒理試驗(yàn)

表18.利用生物素化的mabdb4c7評(píng)估組織的交叉反應(yīng)性

¹觀察到強(qiáng)陽(yáng)性表面膜染色

²與未標(biāo)幟的mabdb4c7預(yù)培養(yǎng)可阻斷染色

³觀察到弱陽(yáng)性

⁴觀察到偶而陽(yáng)性的染色

⁵局部微弱的庫(kù)氏細(xì)胞染色

表19.關(guān)于在第i期試驗(yàn)單一劑量ub-421的pk參數(shù)

¹結(jié)果為來(lái)自3個(gè)受試者的平均值

表20.在第iia期試驗(yàn)于多次投予ub-421后的病毒量下降

itt：意圖治療群體(intent-to-treatpopulation)

pp：依方案執(zhí)行臨床試驗(yàn)的群體(per-protocolpopulation)

vl：病毒量(viralload)

表21a.第iia期臨床療效數(shù)據(jù)顯示病毒量減少至低于檢測(cè)極限：患者1-1-01(第1劑量組：每周10mg/kg)

nq：無(wú)法定量

斜線(xiàn)：未評(píng)估

表21b.第iia期臨床療效數(shù)據(jù)顯示病毒量減少至低于檢測(cè)極限：患者1-1-02(第1劑量組：每周10mg/kg)

nq：無(wú)法定量

斜線(xiàn)：未評(píng)估

表21c.第iia期臨床療效數(shù)據(jù)顯示病毒量減少至低于檢測(cè)極限：患者1-2-03(第2劑量組：每?jī)芍?5mg/kg)

nq：無(wú)法定量

斜線(xiàn)：未評(píng)估

表22a.第1劑量組ub-421治療之患者的平均cd4t細(xì)胞數(shù)量(每周10mg/kg)

表22b.第2劑量組ub-421治療之患者的平均cd4t細(xì)胞數(shù)量(每?jī)芍?5mg/kg)

表23.于功能治愈之ub-421治療的設(shè)計(jì)

【序列表】

<110>美國(guó)聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)公司(unitedbiomedical,inc.)

王長(zhǎng)怡

<120>藉由針對(duì)cd4之單克隆抗體介導(dǎo)競(jìng)爭(zhēng)型hiv進(jìn)入抑制之hiv感染的治療和功能性治愈

<130>1004263.213wo(2034wo)

<150>us62/051,200

<151>2014-09-16

<150>pct/us2014/065048

<151>2014-11-11

<160>14

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>5

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(5)

<223>鼠源抗體b4之重鏈的cdr1

<400>1

asptyrvalilehis

15

<210>2

<211>17

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(17)

<223>鼠源抗體b4之重鏈的cdr2

<400>2

gluiletyrproglyserglyseralatyrserasnalalysphelys

151015

asp

<210>3

<211>9

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(9)

<223>鼠源抗體b4之重鏈的cdr3

<400>3

argglyasnglythrglyphealatyr

15

<210>4

<211>15

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(15)

<223>鼠源抗體b4之輕鏈的cdr1

<400>4

lysalaglyglnservalasptyraspglyaspsertyrmetasn

151015

<210>5

<211>7

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(7)

<223>鼠源抗體b4之輕鏈的cdr2

<400>5

valalaserasnleugluser

15

<210>6

<211>9

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(9)

<223>鼠源抗體b4之輕鏈的cdr3

<400>6

glnglnsertyrlysaspproleuthr

15

<210>7

<211>448

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(448)

<223>具有與衍生自來(lái)自親本鼠源b4抗體重鏈序列相對(duì)應(yīng)之cdrs1、2、3的相似cdrs1、2、3的去免疫化人類(lèi)抗體b4[ub421]的重鏈

<400>7

glnvalglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

valilehistrpvallysglnalathrglyglnglyleuglutrpile

354045

glygluiletyrproglyserglyseralatyrserasnalalysphe

505560

lysaspargvalthrmetthralaasplysserserasnthralatyr

65707580

metgluleuserserleuthrseraspaspthralavaltyrphecys

859095

alaargargglyasnglythrglyphealatyrtrpglyglnglythr

100105110

leuvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro

115120125

leualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleugly

130135140

cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn

145150155160

serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln

165170175

serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser

180185190

serleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproser

195200205

asnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthr

210215220

histhrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproser

225230235240

valpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserarg

245250255

thrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasppro

260265270

gluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala

275280285

lysthrlysproargglugluglntyrhisserthrtyrargvalval

290295300

servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr

305310315320

lyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthr

325330335

ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu

340345350

proproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcys

355360365

leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser

370375380

asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp

385390395400

seraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysser

405410415

argtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisgluala

420425430

leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

435440445

<210>8

<211>218

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(218)

<223>具有與衍生自來(lái)自親本鼠源b4抗體輕鏈序列相對(duì)應(yīng)之cdrs1、2、3的相似cdrs1、2、3的去免疫化人類(lèi)抗體b4[ub421]的輕鏈

<400>8

aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly

151015

glnargalathrilethrcyslysalaglyglnservalasptyrasp

202530

glyaspsertyrmetasntrptyrglnglnlysproglyglnpropro

354045

lysleuleuiletyrvalalaserasnleugluserglyileproala

505560

argpheserglyserglyserglythraspphethrleuasnilehis

65707580

provalglugluasnaspalaalathrtyrtyrcysglnglnsertyr

859095

lysaspproleuthrpheglyglnglythrlysleugluilelysarg

100105110

thrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglugln

115120125

leulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyr

130135140

proargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnser

145150155160

glyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspserthr

165170175

tyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulys

180185190

hislysleutyralacysgluvalthrhisglnglyleuserserpro

195200205

valthrlysserpheasnargglyglucys

210215

<210>9

<211>448

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(448)

<223>具有m253y/s255t/t257e取代之去免疫化人類(lèi)抗體b4[ub421]的重鏈

<400>9

glnvalglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

valilehistrpvallysglnalathrglyglnglyleuglutrpile

354045

glygluiletyrproglyserglyseralatyrserasnalalysphe

505560

lysaspargvalthrmetthralaasplysserserasnthralatyr

65707580

metgluleuserserleuthrseraspaspthralavaltyrphecys

859095

alaargargglyasnglythrglyphealatyrtrpglyglnglythr

100105110

leuvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro

115120125

leualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleugly

130135140

cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn

145150155160

serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln

165170175

serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser

180185190

serleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproser

195200205

asnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthr

210215220

histhrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproser

225230235240

valpheleupheproprolysprolysaspthrleutyrilethrarg

245250255

gluprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasppro

260265270

gluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala

275280285

lysthrlysproargglugluglntyrhisserthrtyrargvalval

290295300

servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr

305310315320

lyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthr

325330335

ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu

340345350

proproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcys

355360365

leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser

370375380

asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp

385390395400

seraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysser

405410415

argtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisgluala

420425430

leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

435440445

<210>10

<211>448

<212>prt

<213>人源化抗體

<220>

<221>尚未歸類(lèi)的特征

<222>(253)..(253)

<223>m或y

<220>

<221>尚未歸類(lèi)的特征

<222>(255)..(255)

<223>s或t

<220>

<221>尚未歸類(lèi)的特征

<222>(257)..(257)

<223>t或e

<220>

<221>尚未歸類(lèi)的特征

<222>(298)..(298)

<223>n或h

<400>10

glnvalglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

valilehistrpvallysglnalathrglyglnglyleuglutrpile

354045

glygluiletyrproglyserglyseralatyrserasnalalysphe

505560

lysaspargvalthrmetthralaasplysserserasnthralatyr

65707580

metgluleuserserleuthrseraspaspthralavaltyrphecys

859095

alaargargglyasnglythrglyphealatyrtrpglyglnglythr

100105110

leuvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro

115120125

leualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleugly

130135140

cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn

145150155160

serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln

165170175

serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser

180185190

serleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproser

195200205

asnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthr

210215220

histhrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproser

225230235240

valpheleupheproprolysprolysaspthrleuxaailexaaarg

245250255

xaaprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasppro

260265270

gluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala

275280285

lysthrlysproargglugluglntyrxaaserthrtyrargvalval

290295300

servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr

305310315320

lyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthr

325330335

ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu

340345350

proproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcys

355360365

leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser

370375380

asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp

385390395400

seraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysser

405410415

argtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisgluala

420425430

leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

435440445

<210>11

<211>118

<212>prt

<213>鼠源抗體

<400>11

glnvalglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

valilehistrpvallysglnalathrglyglnglyleuglutrpile

354045

glygluiletyrproglyserglyseralatyrserasnalalysphe

505560

lysaspargvalthrmetthralaasplysserserasnthralatyr

65707580

metgluleuserserleuthrseraspaspthralavaltyrphecys

859095

alaargargglyasnglythrglyphealatyrtrpglyglnglythr

100105110

leuvalthrvalserser

115

<210>12

<211>330

<212>prt

<213>人類(lèi)抗體

<220>

<221>尚未歸類(lèi)的特征

<222>(135)..(135)

<223>m或y

<220>

<221>尚未歸類(lèi)的特征

<222>(137)..(137)

<223>s或t

<220>

<221>尚未歸類(lèi)的特征

<222>(139)..(139)

<223>t或e

<220>

<221>尚未歸類(lèi)的特征

<222>(180)..(180)

<223>n或h

<400>12

alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys

151015

serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr

202530

pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser

354045

glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser

505560

leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr

65707580

tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys

859095

lysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys

100105110

proalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepropro

115120125

lysprolysaspthrleuxaailexaaargxaaprogluvalthrcys

130135140

valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrp

145150155160

tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu

165170175

gluglntyrxaaserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleu

180185190

hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn

195200205

lysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysgly

210215220

glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspglu

225230235240

leuthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr

245250255

proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn

260265270

asntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphephe

275280285

leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn

290295300

valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr

305310315320

glnlysserleuserleuserproglylys

325330

<210>13

<211>111

<212>prt

<213>鼠源抗體

<400>13

aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly

151015

glnargalathrilethrcyslysalaglyglnservalasptyrasp

202530

glyaspsertyrmetasntrptyrglnglnlysproglyglnpropro

354045

lysleuleuiletyrvalalaserasnleugluserglyileproala

505560

argpheserglyserglyserglythraspphethrleuasnilehis

65707580

provalglugluasnaspalaalathrtyrtyrcysglnglnsertyr

859095

lysaspproleuthrpheglyglnglythrlysleugluilelys

100105110

<210>14

<211>107

<212>prt

<213>人類(lèi)抗體

<400>14

argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu

151015

glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe

202530

tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln

354045

serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser

505560

thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu

65707580

lyshislysleutyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser

859095

provalthrlysserpheasnargglyglucys

100105